基于光学相干断层扫描的可降解支架组织工程血管发育的无损监测

摘要

可生物降解高分子支架组织工程血管脉冲刺激实时培养过程中的非破坏性和长周期监测的步进协议本文介绍了光学相干层析成像方法。

摘要

具有类似天然血管的结构和机械性质的工程化血管移植有望满足日益增长的动脉旁路需求。用脉冲刺激对可降解高分子支架基组织工程血管 (TEBVs) 的生长动力学和重塑过程进行表征, 对血管组织工程具有重要意义。光学成像技术是监测工程组织血管化的有力工具, 能够实现实时文化中的高分辨率成像。本文通过光学相干层析成像 (OCT) 对 TEBVs 在长期培养中的生长和重塑进行了无损、快速的实时成像策略。评价几何形态学, 包括血管重塑过程、壁厚、不同培养时间点的 TEBV 厚度比较和脉动刺激的存在。最后, OCT 提供了实际的可能性, 实时观察在重建组织中的聚合物在脉动刺激或不和在每一个容器段, 通过与评估聚合物降解使用扫描电子显微镜 (SEM) 和偏光显微镜。

引言

组织工程血管 (TEBVs) 是最有希望的材料作为理想的血管移植¹。为了使移植物在临床上有用, 以类似的结构和功能特性作为本机血管, 多项技术的设计, 以维持血管功能^2,3。虽然在植入和 III 期临床研究⁴中, 已有工程血管可接受的通畅率, 但长期培养和高成本也显示了监测 TEBVs 发展的必要性。对仿生化学-机械环境中 TEBVs 细胞外基质 (ECM) 的生长、重塑和适应过程的理解可以为血管组织工程的发展提供重要的信息。

跟踪小直径工程船舶发展的理想策略⁵应为无损、无菌、纵向、三维和定量。TEBVs 在不同的培养条件下可以用这种成像方式评估, 甚至包括血管移植前后的变化。描述生活工程船的特征的策略是必要的。光学成像技术允许组织沉积和生物材料的可视化和量化。其他优点是可以使深组织和无标签成像与高分辨率^6,7。然而, 图像特异分子和不易接近的光学设备用于实时监测是一个重要的实际障碍, 限制了非线性光学显微学的广泛应用。光学相干层析成像 (OCT) 是一种用于指导心脏介入治疗⁸的广泛应用的临床工具, 具有血管内成像方式。文献报道了 OCT 的方法, 以评估 TEBVs^9,10的壁厚, 加上肯定成像方式的血管组织工程研究。然而, 没有观察到工程血管生长和重塑的动力学。

本论文详细介绍了四周培养的生物降解高分子支架 TEBVs 的制备方法。人脐动脉血管平滑肌细胞 (HUASMCs) 在生物反应器中扩展并播种成多孔可降解羟基酸 (PGA) 支架。生物降解聚合物在组织工程的临时基质中发挥作用, 并具有一定的降解率¹¹。为了保证支架降解与新组织形成之间的适当匹配, ECM 和 PGA 支架是有效血管重塑的关键因素。该灌注系统模拟了本机的生物力学微环境, 在压力刺激下保持了一致的变形。

提出的协议的目的是描述一个相对简单和无损的战略, TEBVs 成像和长期监测的文化。该协议可用于不同培养条件下工程船舶形态变化和厚度测量的可视化。此外, 还可以对组织工程支架中聚合物基材料的降解进行分析, 以进行鉴定。采用扫描电子显微镜 (SEM) 和偏光显微镜相结合的方法, 对细胞外基质分布和 PGA 降解的相关和定量进行了研究, 有助于评估脚手架退化与 OCT 成像相结合。

研究方案

1. 可降解 PGA 支架基组织工程容器培养

1. PGA 脚手架制作
   1. 将 PGA 网 (19 毫米直径和1毫米厚), 用0.3 缝合环氧乙烷 (17 厘米长, 5.0 毫米直径, 5-0 毫米厚) 消毒。
   2. 将聚四氟乙烯 (聚四氟乙烯, 1cm 长度) 缝合到 PGA 网格的每一端, 重叠2毫米。
   3. 在1摩尔/升氢氧化钠中用手蘸 PGA 支架1分钟, 调整网格的空间结构, 用组织培养级水浸泡三次, 每组2分钟。每次用纸巾轻轻拍干脚手架。然后用鼓风机将支架干燥1小时。
2. 生物反应器的组装与 OCT 成像的 Y 结
   1. 浸泡自已开发的玻璃圆柱形生物反应器 (10 厘米直径和11.7 厘米的高度与四唇内和四侧臂外的反应堆, 如图 1), PGA 脚手架, 硅胶管 (外径5毫米, 厚度0.3 毫米),95% 乙醇罐中装配的生物相容管、连接器、搅拌杆和设备2小时。
   2. 拉 PGA 脚手架通过与连接器一侧连接的生物反应器的侧臂, 以及另一侧与用于提供 OCT 导丝的 Y 连接。用同样的方法在生物反应器中组装另一个 PGA 脚手架。请参阅图 1。
   3. 用4-0 缝线收紧聚四氟乙烯以适应生物反应器的嘴唇。
   4. 再将生物反应器放在乙醇罐中1小时, 用鼓风机将其干燥一夜。
3. HUASMCs 与静态生物反应器调节的播种
   1. 用标准外植体技术分离人脐动脉中的 HUASMCs。
   2. 扩张和维持平滑肌细胞生长培养基中由 DMEM 培养基组成的细胞, 20% 胎牛血清, 2.36 毫克/毫升 HEPES, 100 的 U/毫升青霉素 G, 50 µg/毫升脯氨酸, 20 µg/毫升丙氨酸, 50 µg/毫升甘氨酸, 1.5 µg/毫升 CuSO4, 50 µg/毫升抗坏血酸, 10 ng/毫升碱性成纤维细胞生长因子和10的血小板衍生生长因子。
   3. 种子 HUASMCs 在 5×10⁶细胞/毫升的浓度在上述培养基上的 PGA 支架上。
   4. 在生物反应器中放入搅拌杆 (1.5 厘米长)。插入一个加料管 (5 毫米直径, 15 厘米长) 和三短油管段 (5 毫米直径, 7 厘米长度), 用于气体交换通过硅胶塞子盖子。
   5. 将聚四氟乙烯0.22 µm 过滤器连接到每一个空气变化管和一个肝素帽的喂养管。调整搅拌杆的搅拌速度为每分钟13回合。将玻璃生物反应器、硅胶塞子盖和 PGA 脚手架组装成养殖系统。
   6. 允许 HUASMCs 坚持45分钟, 通过倾斜的生物反应器每15分钟与立场, 在左侧和右侧。反应器的端口和接头都用石蜡膜密封。
   7. 连接螺叶泵, PBS 袋, 驱动程序与生物相容管作为灌注系统。打开驱动器, 用 PBS 填充管道。
   8. 将整个生物反应器放在一个加湿的孵化器中, 5% CO₂在37摄氏度。用450毫升的 HUASMCs 培养基填充培养腔。
   9. 按 "停止" 按钮并关闭驱动器设备的电源。在静态培养下种植种子支架一周。
   10. 每3-4 天将培养基中的一半通过加料管吸气, 再用同等数量的新鲜培养基重新填充反应器, 以改变培养培养基。
4. OCT 成像灌注系统的研制
   1. 在 PBS 袋中泵浦流体通过生物相容的管子循环, 回到袋子里。
   2. 打开驱动程序的电源, 调节泵的设置, 频率为每分钟60次, 输出收缩压力为 120 mmHg。根据组织工程血管培养的需要, 调整机械参数。
   3. 单击 "运行" 按钮, 使灌注系统正常工作。通过迭代加压生物相容管^10,12在静态培养1周后, 提供上述固定的脉动刺激对血管3周。

2. 利用 OCT 进行光学成像

1. 利用光源保证10-20µm 的轴向分辨率和 1-2 mm 的图像深度, 以识别基于频域 OCT 血管成像系统⁹的 TEBV 结构。
2. 开启电源开关并打开图像采集软件。
3. 将光纤成像导管连接到驱动马达和光学控制器 (DOC) 中, 并配以导管自动撤退功能。
4. 将图像采集率的参数设置为每秒10帧, 自动回撤速度为10毫米/秒。
5. 用18G 针将成像导管连接到 Y 形接头。
6. 将导管放入硅胶管中, 在将 pga 脚手架装入生物反应器之前, 确定 pga 网格的缝合密性。
7. 把导管尖放在感兴趣的区域。调整回撤装置, 检查图像质量⁸。
8. 获取图像在 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 天在文化为每个单独 TEBV 和保存按顺序 TEBV 显微组织的实时观察, 包括表面形态, 内部结构和构成。
9. 重复测量3次, 以获得可靠的测量工程船舶每次。使用图像捕获软件在整个测试过程中捕获一系列图像。

3. 成像分析

1. 使用图像分析软件测量 TEBV 壁厚。选择要分析的图像。单击跟踪工具可自动识别 TEBV 的内侧, 并手动绘制外部侧面。屏幕上将显示一个厚度图。
2. 重复测量5次, 以获得可靠的结构测量。OCT 分析是由两名独立调查员对获得的信息视而不见。

4. TEBV 和组织加工的收获

1. 在培养完成后, 打开放置在生物反应器上的硅胶塞子盖并丢弃培养基。从生物反应器的嘴唇松开聚四氟乙烯, 用剪刀把聚四氟乙烯外侧的硅胶管切开。从生物反应器中收获 TEBVs, 并切割成切片进行扫描电镜检查。
2. 取出其余的 TEBVs, 切成4µm 厚的部分。拉出支撑硅胶管和固定部分与4% 多聚甲醛。对马尾三色和天狼星红进行常规组织学染色, 检查胶原蛋白和 PGA^10、13、14的形态学。
3. 为了评估 PGA 含量和胶原成分, 用偏光显微镜观察小天狼星红染色的组织学标本。PGA 残留物通过双折射明显标定, 剩余面积可根据断面面积¹⁰进行量化。

结果

三维培养系统由生物反应器中的一个培养室和一个封闭流体循环^10、13 (图 1) 的灌注系统组成。OCT 成像导管插入到 Y 形接头的远端, 并将其拉回硅胶管中进行成像。在生物反应器培养过程中, OCT 成像首次被用于描述生物降解高分子支架基 TEBVs 的结构表征。

讨论

生成具有类似于原生血管的结构和机械特性的工程容器, 可缩短临床使用时间, 是血管工程的终极目标。光学成像技术允许可视化组织工程化的血管特异成分, 它不能监测整个文化和暴露移植到一个文化环境中的个体结构, 而不损害不孕⁷。本文将培养室与灌注系统分离。相对独立的灌流系统, 保证了养殖过程中污染风险的降低和导丝的安置。同时, 该腔内成像方式采用了 TEBVs 的简?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PGA mesh	Synthecon
silicone tube	Cole Parmer
connector	Cole Parmer
intravascular OCT system	St. Jude Medical, Inc	ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic	Philips	FEI Philips XL-30
polarized microscope	Olympus	Olympus BX51
sutures	Johnson & Johnson
pulsatile pump	Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software	St. Jude Medical, Inc