Неразрушающего контроля развития разложению на основе эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов с использованием оптическая когерентная томография

Резюме

Шаг за шагом протокол для неразрушающего контроля и длительного периода наблюдения за процессом сосудистого ремоделирования и эшафот деградации в реальном времени культуры биоразлагаемые полимерные основанных на эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов с пульсирующего стимуляции Здесь описывается использование оптическая когерентная томография.

Аннотация

Инженерии сосудистых имплантатов с структурно-механические свойства, аналогичные природные кровеносных сосудов, как ожидается, удовлетворять растущий спрос на артериальной объездной. Характеристика динамики роста и модернизации процесса разложению полимер на основе эшафот инженерии тканей кровеносных сосудов (TEBVs) с пульсирующего стимуляции имеет решающее значение для сосудистой тканевой инженерии. Оптические методы визуализации выделяются как мощные инструменты для мониторинга васкуляризации инженерии тканей позволяет с высоким разрешением изображений в реальном времени культуры. Этот документ демонстрирует неразрушающего и быстро в реальном времени визуализации стратегии для мониторинга роста и реконструкции TEBVs в долгосрочные культуры с помощью оптическая когерентная томография (Окт). Оценивается геометрические морфологии, включая сосудистого ремоделирования процесс, толщина стенок и Сравнение толщины TEBV в моменты времени различные культуры и наличие пульсирующего стимуляции. Наконец OCT предоставляет практические возможности для реального времени наблюдения деградации полимера в реконструкции тканях под пульсирующего стимуляции или не и в каждом сегменте судна, по сравнению с оценкой использования деградации полимера Сканирование, microscopic(SEM) электронов и поляризационный микроскоп.

Введение

Ткани инженерии кровеносных сосудов (TEBVs) является наиболее перспективных материалов как идеальный сосудистого трансплантата¹. Для того, чтобы развивать графтов клинически полезным с аналогичными структурных и функциональных свойств как родной судов, были разработаны несколько методов для поддержания функции сосудистого^2,3. Хотя там были инженерии судов с приемлемым проходимость ставок во время имплантации и клиническое исследование III фазы⁴, долгосрочные культуры и высокой стоимости также показывают необходимость наблюдения за развитием TEBVs. Понимание процессов роста, модернизация и адаптация внеклеточные matrix(ECM) в TEBVs в среде химико механические biomimetic может предоставить важную информацию для развития сосудистой тканевой инженерии.

Идеальной стратегии для отслеживания развития инженерии судов малого диаметра⁵ должно быть неразрушающего контроля, стерильные, продольная, трехмерные и количественные. TEBVs условиях различные культуры могут оцениваться этой модальности изображений, включая даже изменения до и после трансплантации сосудов. Необходимо разработать стратегии для описания особенностей жизни инженерии судов. Оптические методы визуализации позволяют визуализации и количественной оценки осаждения ткани и биоматериалов. Другими преимуществами являются возможность включить глубокие ткани и этикетка бесплатные изображения с высоким разрешением^6,7. Однако изображение конкретных молекул и менее легко доступны оптического оборудования для мониторинга в реальном времени является значительное практическое препятствие, которое имеет ограниченную широкое применение нелинейной оптической микроскопии. Оптическая когерентная томография (Окт) — это оптический подход с внутрисосудистого изображений модальности как широко используется клинический инструмент направлять сердечной интервенционной терапии⁸. В литературе метод октября было сообщено о том, как способ оценки толщины стенок TEBVs^9,10, в сочетании с позитивных изображений условия для сосудистых тканей инженерных исследований. В то время как динамика инженерии сосудистой роста и реконструкции не наблюдалось.

В этой рукописи мы подробно подготовку биоразлагаемые полимерные основанных на эшафот TEBVs для четырех недель культуры. Человека пупочных артерий сосудистой гладкомышечные клетки (HUASMCs) расширил и посеяны в пористых разложению Полигликолидная кислота (PGA) леса в биореактор. Биоразлагаемые полимеры играть роль в временной субстрат для тканевой инженерии и имеют определенные¹¹деградации ставка. С тем чтобы обеспечить соответствующий матч между деградацией лесов и нео-ткани, ECM и PGA подмостей являются важнейшими факторами для эффективного сосудистого ремоделирования. Система перфузии имитирует биомеханических микроокружения родной судов и поддерживает последовательную деформации под давлением стимуляции.

Цель представленных протокола-изложить стратегию относительно простой и неразрушающего контроля для TEBVs изображений и долгосрочный мониторинг культуры. Этот протокол может использоваться для визуализации морфологических изменений и измерения толщины инженерии судов в условиях иной культуры. Кроме того можно выполнить анализ деградации материалов на основе полимеров в ткани, инженерные строительные леса для идентификации. Комбинируя методы сканирования электрон microscopic(SEM) и поляризационный микроскоп, используемые в этот протокол, корреляции и количественной оценки распределения внеклеточного матрикса и PGA деградации может быть сделано, которая может содействовать оценке эшафот деградация в сочетании с октября изображений.

протокол

1. разложению PGA леску на основе культуры ткани инженерии судов

1. Изготовление PGA эшафот
   1. Шить PGA сетки (диаметром 19 мм и толщиной 1 мм) вокруг Силиконовая трубка, стерилизована окисью этилена (длина 17 см, диаметр 5.0 мм и толщиной 0,3 мм) с помощью швов 5-0.
   2. Шить политетрафторэтилена (ePTFE, 1 см длиной) с 4-0 швом на каждом конце PGA сетки и перекрывается 2 мм.
   3. Окуните PGA подмости с рукой в 1 моль/Л NaOH за 1 мин, чтобы скорректировать структуру пространственной сетки и смочите водой культуры ткани класса три раза за 2 мин. Нежно погладить сухой леску с папиросной бумаги каждый раз. Затем высушите до леса в капюшон с вентилятором на 1 ч.
2. Ассамблея биореактора и Y-соединения для октября изображений
   1. Замочить самостоятельно разработанные стекла цилиндрических биореактора (диаметр 10 см и 11,7 см в высоту с четырьмя губы внутри и четыре стороны оружия вне реактора, как показано на рис. 1), PGA подмостей, силиконовые трубки (внешний диаметр 5 мм, толщина 0,3 мм), биосовместимых трубы, разъемы, перемешать бар и оборудование для сборки в баке этанола 95% за 2 ч.
   2. Вытяните PGA леску через сторону герб биореактора, подключенных к одной стороне с разъемом, а также другая сторона с Y-Джанкшн, используются для доставки OCT проволочного проводника. Соберите другую леску PGA в биореакторе таким же образом. Пожалуйста, обратитесь к рис.
   3. Установите ePTFE биореактор губы, затянув с 4-0 швами.
   4. Поместить реактор в этанол бак снова за 1 ч и высохнуть на ночь в капот с вентилятором на.
3. Заполнение HUASMCs и статические биореактор кондиционирования
   1. Изолируйте HUASMCs от человеческой пуповинной артерии методами стандартных экспланта.
   2. Расширять и поддерживать клетки в гладкомышечные клетки рост среднего, состоящий из среде DMEM, 20% плода бычьим сывороточным, 2,36 мг/мл HEPES, 100 ед/мл пенициллин G, 50 мкг/мл пролина, 20 мкг/мл аланина, 50 мкг/мл глицин, 1,5 мкг/мл CuSO4, аскорбиновая кислота 50 мкг/мл , 10 нг/мл основные фибробластический фактор роста и 10 нг/мл тромбоцитарный фактор роста.
   3. Семена HUASMCs в концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл в выше питательной среды на PGA подмостей.
   4. Положите сенсацию бар (1,5 см длины) в биореактор. Вставка одного кормления труб (диаметром 5 мм, длина 15 см) и трех сегментов коротких труб (диаметром 5 мм, длиной 7 см) для газового обмена через крышку пробкой силикона.
   5. Прикрепите фильтры 0,22 мкм PTFE для каждого изменения трубку и один гепарина колпачок для питания трубки. Настройка панели перемешать с перемешивания скорость 13 выстрелов в минуту. Соберите стекла биореактора, силиконовая пробка крышки и PGA леску в системе культуры.
   6. Разрешить HUASMCs следовать за 45 мин, опираясь биореактор каждые 15 мин с подставкой, влево и вправо. Реактор портов и стыки загерметизированы с парафин фильм.
   7. Подключите Луо-Ye насос, PBS мешок, водитель с биосовместимыми трубы как система перфузии. Откроете диск для заполнения трубы с PBS.
   8. Поместите общий биореактор в увлажненные инкубатор с 5% CO₂ при 37 ° C. Заполните палаты культуры с 450 мл HUASMCs питательной среды.
   9. Нажмите кнопку «Стоп» и выключите устройство. Посеян подмостки под статической культуры растут на одну неделю.
   10. Измените культуру среднего каждые 3-4 дня, аспирационных половина из старой среды путем кормления трубки и заправки реактора с эквивалентное количество свежей питательной среды.
4. Подготовка системы перфузии для октября изображений
   1. Перекачивать жидкости в мешке PBS распространить через биосовместимых трубы и обратно в мешок.
   2. Откройте силу водителя и регулировать параметр насос с частотой 60 ударов в минуту и вывода систолическое давление 120 мм рт.ст.. Механические параметры согласно потребностям инженерных сосудистой культуры ткани.
   3. Нажмите кнопку "запустить", чтобы сделать работу системы перфузии. Предоставить выше фиксированных пульсирующего стимуляции для судов на 3 недели, многократно герметизирующего биосовместимых трубы^10,12 после 1 недели статической культуры.

2. выполнение оптических изображений с октября

1. Используйте источник света для обеспечения осевой резолюции 10-20µm и глубина изображения 1-2 мм для определения структуры на основе частотной области октября внутрисосудистого изображений системы⁹TEBV.
2. Включите выключатель питания и откройте программное обеспечение захвата изображения.
3. Подключите волоконно оптических изображений катетер к мотор и оптических контроллер (DOC) с функцией автоматического отступление катетера.
4. Установка параметров изображения приобретение ставки до 10 кадров в секунду с автоматической обратной протяжке скорость 10 мм/сек.
5. Придаем изображений катетер Y-Джанкшн через гепарина колпачок с иглой 18G.
6. Уложите силиконовые трубки катетера и определить герметичность шва PGA сетки перед загрузкой PGA леску на реактор.
7. Поместите кончик катетера области интереса. Настройте устройство обратной протяжке и проверить качество изображения⁸.
8. Получение изображений в 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 дней в культуре для каждого индивидуального TEBV и сохранить последовательно с наблюдения в реальном времени TEBV микроструктуры, включая поверхности морфологии, внутренней структуры и состава.
9. Повторите измерение для 3 раз, чтобы получить надежное измерение инженерии судов каждый раз. Захват серии изображений на протяжении тестирования с использованием программного обеспечения захвата изображения.

3. томография анализ

1. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для измерения толщины стенок TEBV. Выберите изображение для анализа. Щелкните инструмент отслеживания для определения внутренней стороне TEBV программное обеспечение автоматически и вручную эскиз внешней стороне. На экране появится диаграмма толщины.
2. Повторите измерение в 5 раз получить надежное измерение конструкции. Был проведен анализ октября два независимых следователей, ослепленный к полученной информации.

4. урожай TEBV и обработки тканей

1. Открыть крышку пробкой силикона помещен над биореактора по завершении культуры и отбросить питательной среды. Ослабьте ePTFE от биореактор губы и вырезать трубы силиконовые с внешней стороны ПТФЭ с ножницами. Урожай TEBVs от биореактор и нарезать разделы для сканирования электронной микроскопии экспертизы.
2. Взять из остальной части TEBVs и нарезать 4 µm толщиной секции. Вытяните поддержки силиконовые трубки и исправить разделы с параформальдегида 4%. Выполняйте обычные гистологические окрашивание Массон в trichrome и Сириус красный для изучения морфологии коллагена и PGA^10,,1314.
3. Чтобы оценить PGA контента и компонент коллагена, наблюдать гистологических образцы с Sirius красное окрашивание, поляризационный микроскоп. PGA Остатки четко разграниченные через двойное лучепреломление и остаток области могут быть количественно основанные на площадь поперечного сечения¹⁰.

Результаты

Система трехмерного культуры состояла из палаты культуры в биореактор и перфузии системы с замкнутым циклом жидкости^10,13 (рис. 1). Окт изображений катетер был вставлен в дистальный конец Y-Джанкшн и вытащил обратно в силик?...

Обсуждение

Для создания инженерии судов с структурных и механические свойства аналогичны родной кровеносных сосудов может привести к сократить время для клинического использования и является конечной целью сосудистой техники. Оптические методы визуализации позволяют визуализации сосудистой ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PGA mesh	Synthecon
silicone tube	Cole Parmer
connector	Cole Parmer
intravascular OCT system	St. Jude Medical, Inc	ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic	Philips	FEI Philips XL-30
polarized microscope	Olympus	Olympus BX51
sutures	Johnson & Johnson
pulsatile pump	Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software	St. Jude Medical, Inc