Contrôles non destructifs suivi du développement de dégradable axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Résumé

Un protocole étape par étape pour les essais non destructifs et longue période suivi le processus de remodelage vasculaire et la dégradation de l’échafaudage en culture en temps réel de biodégradables polymériques axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins avec stimulation pulsatile à l’aide de la tomographie par cohérence optique est décrite ici.

Résumé

Ingénierie des greffons vasculaires aux propriétés structurelles et mécaniques similaires à des vaisseaux sanguins naturels sont censés satisfaire la demande croissante de pontage artériel. Caractérisation de la dynamique de croissance et le processus de remodelage des polymères dégradables axée sur l’échafaud tissulaire des vaisseaux sanguins (TEBVs) avec une stimulation pulsatile sont cruciales pour l’ingénierie des tissus vasculaires. Les techniques d’imagerie optiques se démarquent comme de puissants outils pour surveiller la vascularisation du tissu machiné permettant l’imagerie haute résolution en culture en temps réel. Cet article démontre une non destructive et rapide en temps réel d’imagerie stratégie pour surveiller la croissance et la rénovation des TEBVs dans les cultures à long terme en utilisant la tomographie par cohérence optique (OCT). La morphologie géométrique est évaluée, y compris le processus de remodelage vasculaire, épaisseur de paroi et comparaison de l’épaisseur de la TEBV à des moments différents de la culture et de la présence de stimulation pulsatile. Enfin, les PTOM fournit des possibilités pratiques pour l’observation en temps réel de la dégradation du polymère dans les tissus reconstituante profonde sous stimulation pulsatile ou pas et dans chaque segment du navire, par contre l’évaluation de l’utilisation de dégradation du polymère balayage électronique microscopic(SEM) et microscope polarisé.

Introduction

Tissulaire des vaisseaux sanguins (TEBVs) est le matériau plus prometteurs comme une prothèse vasculaire idéal¹. Afin de développer les greffes pour être cliniquement utile avec des propriétés structurales et fonctionnelles similaires comme navires indigènes, plusieurs techniques ont été conçus pour maintenir les fonctions vasculaires^2,3. Bien qu’il y a eu des navires conçus avec des taux de perméabilité acceptable pendant l’implantation et à l' étude clinique de Phase III⁴, culture à long terme et des coûts élevés montrent également la nécessité de suivre le développement de TEBVs. Compréhension des processus matrix(ECM) extracellulaire de croissance, remodelage et l’adaptation en TEBVs dans l’environnement de chimio-mécanique biomimétiques peut fournir des informations cruciales pour le développement de l’ingénierie des tissus vasculaires.

La stratégie idéale pour suivre le développement de vaisseaux machiné de petit diamètre⁵ devrait être non destructive, stérile, longitudinal, tridimensionnelle et quantitative. TEBVs dans des conditions de culture différente pourraient être évaluées par cette modalité d’imagerie, y compris même les changements avant et après la transplantation vasculaire. Stratégies pour décrire les caractéristiques des navires de vie conçue sont nécessaires. Techniques d’imagerie optiques permettent la visualisation et la quantification des dépôts de tissu et des biomatériaux. Autres avantages sont la possibilité d’activer l’imagerie des tissus profonds et sans étiquette avec haute résolution^6,7. Cependant, les molécules d’image spécifique et des équipements optiques moins facilement accessible pour surveiller en temps réel est un obstacle pratique, qui a limité l’application extensive de la microscopie optique non linéaire. Tomographie par cohérence optique (OCT) est une approche optique avec un système d’imagerie intravasculaire comme outil clinique largement utilisé pour guider la thérapie interventionnelle cardiaque⁸. Dans la littérature, la méthode de OCT a été signalée comme un moyen d’évaluer l’épaisseur de la paroi de TEBVs^9,10, couplé avec affirmatives modalités d’imagerie pour la recherche en génie tissu vasculaire. Considérant que, la dynamique de l’ingénierie vasculaire croissance et remodelage observe pas.

Dans ce manuscrit, nous détaillons la préparation du TEBVs d’axée sur l’échafaud polymères biodégradables pour la culture de quatre semaines. Les cellules musculaires lisses vasculaires des artères ombilicale humaine (HUASMCs) sont élargies et ensemencés dans un échafaudages de (PGA) l’acide polyglycolique dégradable poreux dans le bioréacteur. Polymères biodégradables jouent un rôle dans un substrat temporaire pour l’ingénierie tissulaire et ont une certaine dégradation taux¹¹. Afin d’assurer une correspondance appropriée entre la dégradation de l’échafaudage et formation des neo-tissus, ECM et PGA échafaudages sont des facteurs cruciaux pour un remodelage vasculaire efficace. Le système de perfusion simule le microenvironnement biomécanique des vaisseaux natifs et maintient une déformation uniforme sous la stimulation de la pression.

Le protocole présenté vise à décrire une stratégie relativement simple et non destructive pour TEBVs d’imagerie et de surveillance à long terme de la culture. Ce protocole peut être utilisé pour la visualisation des changements morphologiques et mesures d’épaisseur de navires conçus dans des conditions de culture différente. En outre, les analyses de la dégradation des matériaux à base de polymères dans les tissus techniques échafaudages peuvent être exécutées pour l’identification. En combinant les méthodes de balayage électronique microscopic(SEM) et polarisée microscope utilisé dans ce protocole, la corrélation et la quantification de la distribution de la matrice extracellulaire et de la dégradation de la PGA sont possibles, qui peuvent faciliter l’évaluation d’échafaudage dégradation, combiné avec l’imagerie OCT.

Protocole

1. dégradable PGA échafaudage base tissulaire navires Culture

1. Fabrication de l’échafaudage de la PGA
   1. Coudre maille PGA (diamètre de 19 mm et 1 mm d’épaisseur) autour de tubes en silicone stérilisé par l’oxyde d’éthylène (longueur 17 cm, diamètre 5,0 mm et 0,3 mm d’épaisseur) à l’aide de la suture de 5-0.
   2. Coudre en polytétrafluoroéthylène (ePTFE, 1cm de longueur) avec suture 4-0 sur chaque extrémité de la maille PGA et se chevauchent de 2 mm.
   3. Tremper les échafaudages PGA avec la main en 1 mol/L, NaOH pendant 1 min pour ajuster la structure spatiale de la maille et le faire tremper avec de l’eau de la culture de tissus grade trois fois pendant 2 min de chaque. Doucement pat sécher l’échafaud avec un papier de soie chaque fois. Puis s’assécher les échafaudages sous une hotte avec un souffleur pendant 1 h.
2. Assemblée du bioréacteur et la jonction en Y pour l’imagerie de l’OCT
   1. Faire tremper le bioréacteur cylindrique verre self-developed (10 cm de diamètre et 11,7 cm de hauteur avec quatre lèvres à l’intérieur et quatre armes de poing à l’extérieur du réacteur, tel qu’illustré à la Figure 1), le PGA échafaudages, le tube de silicone (diamètre extérieur 5 mm, épaisseur 0. 3 mm), tubes biocompatibles, connecteurs, remuer bar et matériel pour l’assemblage dans un réservoir d’éthanol 95 % pendant 2 h.
   2. Tirez l’échafaud PGA grâce à des armes de poing du bioréacteur relié à un côté avec un connecteur, mais aussi un autre côté avec la jonction en Y pour l’acheminement du guide OCT. Assembler un autre échafaudage de PGA dans le bioréacteur de la même manière. Veuillez vous reporter à la Figure 1.
   3. Monter en ePTFE à lèvres bioréacteur en serrant avec des sutures de 4-0.
   4. Mettez le bioréacteur dans le réservoir de l’éthanol à nouveau pendant 1 h et sécher durant la nuit dans la hotte avec ventilateur.
3. Semis de HUASMCs et de conditionnement de bioréacteur statique
   1. Isoler les HUASMCs des artères ombilicales humaines par des techniques standard d’explant.
   2. Développer et maintenir les cellules en milieu de culture de cellules musculaires lisses composées de milieu DMEM, 20 % sérum de veau fœtal, 2,36 mg/mL, HEPES, 100 U/mL de pénicilline G, 50 proline µg/mL, 20 µg/mL alanine, glycine 50 de µg/mL, 1,5 µg/mL CuSO4, 50 µg/mL d’acide ascorbique , facteur de croissance de 10 ng/mL basique des fibroblastes et 10 facteur de croissance dérivé des plaquettes ng/mL.
   3. Graines HUASMCs à une concentration de 5 × 10⁶ cellules/mL dans le milieu de culture ci-dessus sur les échafaudages de la PGA.
   4. Mettre un émoi bar (1,5 cm de long) dans le bioréacteur. Insérer un tube d’alimentation (diamètre 5 mm, longueur 15 cm) et trois segments de tuyau court (5 mm de diamètre, 7 cm de longueur) pour les échanges gazeux à travers le couvercle bouchon en silicone.
   5. Fixez PTFE 0,22 µm filtres à chaque changement de tuyau et cap une héparine à le œsophage. Ajustez la barre de remuer avec une vitesse d’agitation de 13 coups par minute. Assembler le bioréacteur de verre, couvercle bouchon en silicone et échafaudage de PGA dans le système de culture.
   6. Permettre aux HUASMCs d’adhérer pendant 45 min en vous penchant le bioréacteur toutes les 15 min avec socle, à gauche et à droite. Les ports de réacteur et les joints sont tous scellés avec le film de paraffine.
   7. Connectez le Luo-Ye pompe, sac de PBS, le pilote avec tubes biocompatibles comme le système de perfusion. Ouvrez le lecteur de remplir les tubes de PBS.
   8. Placez le bioréacteur global dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ à 37 ° C. Remplir la chambre de culture avec 450 mL de milieu de culture HUASMCs.
   9. Appuyez sur le bouton arrêter et mettre hors tension de l’appareil d’entraînement. Cultiver les échafaudages semées sous culture statique pendant une semaine.
   10. Changer le milieu de culture tous les 3-4 jours en aspirant la moitié du vieux milieu à travers le tube d’alimentation et au rechargement du réacteur par une quantité équivalente de milieu de culture frais.
4. Préparation du système de perfusion pour l’imagerie de l’OCT
   1. Pomper des fluides dans le sac de PBS de circuler à travers les tubes biocompatibles et retour au sac.
   2. Ouvrez la puissance du pilote et réglementer le réglage de la pompe avec une fréquence de 60 battements par minute et de sortie tension systolique de 120 mmHg. Ajustez les paramètres mécaniques selon les besoins de la culture vasculaire génie tissulaire.
   3. Cliquez sur le bouton Exécuter pour faire fonctionner le système de perfusion. Fournir la stimulation pulsatile fixe ci-dessus aux navires pendant 3 semaines en pressurisant itérativement biocompatible tubes^10,12 après 1 semaine de culture statique.

2. effectuer une imagerie optique par OCT

1. Utiliser une source de lumière pour assurer la résolution axiale du 10-20µm et la profondeur de l’image de 1 à 2 mm pour identifier la structure de TEBV issu du domaine fréquentiel OCT intravasculaire d’imagerie système⁹.
2. Allumez l’interrupteur et ouvrez le logiciel de capture d’image.
3. Connecter la sonde d’imagerie optique de fibre pour le contrôleur de moteur d’entraînement et d’optique (DOC) avec fonction de retraite automatique de cathéter.
4. Définir les paramètres de fréquence d’acquisition des images à 10 images par seconde avec une vitesse de recul automatique 10 mm/s.
5. Fixez cathéter d’imagerie à Y-jonction via le cap de l’héparine avec une aiguille 18G.
6. Placer la sonde dans le tube de silicone et d’identifier l’étanchéité de la suture de maille PGA avant de charger l’échafaudage de PGA sur le bioréacteur.
7. Placez l’extrémité du cathéter sur la région d’intérêt. Ajuster le dispositif de recul et vérifier la qualité d’image⁸.
8. Acquisition d’images à 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 jours de culture pour chaque TEBV individuel et économisez séquentiellement avec observation en temps réel de la microstructure de la TEBV, dont la morphologie de la surface, structure interne et la composition.
9. Recommencez la mesure 3 fois obtenir une mesure fiable des navires conçus chaque fois. Capturer une série d’images au cours de tests en utilisant le logiciel de capture d’image.

3. imagerie analyse

1. Logiciel d’analyse image permet de mesurer l’épaisseur de la paroi TEBV. Sélectionnez l’image à analyser. Cliquez sur l’outil de suivi pour identifier la face interne du TEBV par le logiciel automatiquement et manuellement esquisser le côté extérieur. Un diagramme d’épaisseur s’affiche sur l’écran.
2. Recommencez la mesure pendant 5 fois obtenir une mesure fiable des constructions. L’analyse de OCT a été réalisée par deux chercheurs indépendants aveuglés à l’information obtenue.

4. la récolte du TEBV et du traitement de tissus

1. Ouvrir le couvercle bouchon en silicone placé sur le bioréacteur lorsque la culture est terminée et jeter le milieu de culture. Desserrer l’ePTFE lèvres bioréacteur et couper les tubes de silicone du côté extérieur du ePTFE avec des ciseaux. Prises en TEBVs de bioréacteur et couper en sections pour examen au microscope électronique à balayage.
2. Prendre le reste de TEBVs et y découper 4 µm de coupes épaisses. Sortir le support tube de silicone et fixez les sections avec paraformaldéhyde à 4 %. Effectuer des courants histologique tacher de Masson trichrome et Sirius rouge pour étudier la morphologie de collagène et PGA^10,13,14.
3. Pour évaluer le contenu PGA et composant de collagène, observer des échantillons histologiques avec Sirius rouge taches provoquées par un microscope polarisé. Restes de la PGA sont clairement délimitées par le biais de biréfringence et la zone reste peut être quantifiée basé sur la section transversale de¹⁰.

Résultats

Le système de culture en trois dimensions se composait d’une chambre de culture dans le bioréacteur et le système de perfusion avec un cycle fermé de fluide^10,13 (Figure 1). Le cathéter d’imagerie OCT a été inséré dans l’extrémité distale de la jonction en Y et tiré vers l’arrière dans le tube de silicone pour l’imagerie. L’imagerie OCT a été utilisée pour délimiter la car...

Discussion

Pour générer conçu navires avec structure et propriétés mécaniques similaires à ceux des natifs des vaisseaux sanguins peuvent entraîner pour raccourcir le temps pour l’usage clinique et sont le but ultime de l’ingénierie vasculaire. Les techniques d’imagerie optiques permettent la visualisation de l’ingénierie des tissus vasculaires composants spécifiques, qui ne peut pas contrôler des constructions individuelles tout au long des greffes de la culture et de l’exposition à un milieu de culture sans...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PGA mesh	Synthecon
silicone tube	Cole Parmer
connector	Cole Parmer
intravascular OCT system	St. Jude Medical, Inc	ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic	Philips	FEI Philips XL-30
polarized microscope	Olympus	Olympus BX51
sutures	Johnson & Johnson
pulsatile pump	Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software	St. Jude Medical, Inc