ניטור לא הורסות של פיתוח מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Summary

פרוטוקול צעד אחר צעד גמישה, תקופה ארוכה ניטור התהליך של שיפוץ כלי הדם והשפלה לגרדום בתרבות בזמן אמת של מתכלה פולימריים מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם עם גירוי פועמת באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית מתואר כאן.

Abstract

שתלי כלי הדם מהונדסים בעלת מאפיינים מבניים מכניים דומים לכלי הדם טבעי צפויים לפגוש את הדרישה הגוברת מעקף עורקים. אפיון של הדינמיקות צמיחה ואת תהליך שיפוץ של פולימר מתכלה מבוססי לגרדום רקמות מהונדסים כלי דם (TEBVs) עם גירוי פועמת חיונית הנדסת רקמות עילאיים. טכניקות דימות אופטי להתבלט בתור כלים רבי-עוצמה עבור ניטור אמוניה רקמות מהונדסים מאפשר דימות ברזולוציה בתרבות בזמן אמת. מאמר זה מדגים גמישה, מהר בזמן אמת הדמיה אסטרטגיה כדי לפקח על הגידול ובניה של TEBVs בתרבות לטווח ארוך באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר). מורפולוגיה גיאומטריות מחושבת, כולל תהליך שיפוץ כלי הדם, עובי הקיר של השוואה של עובי TEBV נקודות זמן תרבות אחרת, נוכחות של גירוי פועמת. לבסוף, OCT מספק אפשרויות מעשיות להשגחה בזמן אמת השפלה של פולימר ברקמות בשחזור תחת גירוי פועמת או לא, כל קטע כלי השיט, על ידי לעומת הערכת השימוש השפלה פולימרי סריקה microscopic(SEM) אלקטרון, מיקרוסקופ מקוטב.

Introduction

רקמות מהונדסים כלי הדם (TEBVs) הוא חומר המבטיחים ביותר שתל וסקולרית אידיאלי¹. כדי לפתח שתלי להיות שימושי קלינית עם מאפיינים מבניים ופונקציונליים דומים ככלים מקורית, לטכניקות שונות עוצבו כדי לשמור על תפקוד כלי הדם^2,3. אמנם היו כלי הנדסה במחירים patency קביל במהלך ההשתלה, מחקר קליני שלב III⁴, עלות גבוהה ותרבות ארוכת טווח להציג גם את הצורך בפיקוח על התפתחות TEBVs. הבנה matrix(ECM) חוץ-תאית צמיחה שיפוץ, עיבוד תהליכי TEBVs בסביבת כימותרפיה-מכניים ביונים יכול לספק מידע חיוני להתפתחות של הנדסת רקמות עילאיים.

האסטרטגיה אידיאלי כדי לעקוב אחר התפתחות כלי הנדסה בקוטר קטן⁵ צריכה להיות גמישה, סטרילי, האורך, תלת מימדי, כמותית. TEBVs בתנאים תרבות אחרת יכול להיות מוערך על ידי מודאליות הדמיה זו, כולל שינויים לפני ואחרי השתלת כלי הדם. אסטרטגיות כדי לתאר תכונות של חיים מהונדסים כלי נחוצים. טכניקות דימות אופטי אפשר ויזואליזציה של כימות של רקמות התצהיר, biomaterials. יתרונות נוספים הם האפשרות לאפשר לדימות רקמות עמוק, ללא תווית עם רזולוציה גבוהה^6,7. אולם מולקולות ספציפיות התמונה וציוד אופטי פחות נגיש עבור ניטור בזמן אמת הוא מכשול משמעותי מעשיים, אשר הגביל יישום נרחב של מיקרוסקופ אופטי לא-ליניאריות. טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) היא גישה אופטי עם קרישה תוך-כלית מודאליות הדמיה ככלי בשימוש נרחב קליניים כדי להנחות טיפול התערבותית לב⁸. בספרות דווח השיטה של OCT כדי להעריך את עובי הקיר של TEBVs^9,10, בשילוב עם שיטות הדמיה חיובית לחקר הנדסת רקמות עילאיים. ואילו, הדינמיקה של הנדסה לאחור כלי הדם צמיחה ובניה נצפתה לא.

כתב יד זה, אנחנו מפרטים את הכנת TEBVs מבוססי לגרדום פולימריים מתכלים לתרבות ארבעה שבועות. תאי השריר החלק בכלי הדם האנושי עורקי הטבור (HUASMCs) מורחבת, נזרע לתוך פיגומים חומצה (PGA) נקבובי polyglycolic מתכלה ב ביוריאקטור. פולימרים מתכלים לשחק את התפקיד של מצע זמני עבור הנדסת רקמות, יש מסוים השפלה שיעור¹¹. על מנת להבטיח התאמה המתאימה בין השפלה לגרדום ויצירת ניאו-רקמות, פיגומים ECM ו- PGA הם גורמים קריטיים עבור שיפוץ כלי דם יעיל. מערכת זלוף מדמה את microenvironment ביו-מכני של כלי יליד ושומר על עיוות עקבי תחת לחץ גירוי.

המטרה של פרוטוקול הציג היא לתאר את אסטרטגיה פשוטה יחסית, גמישה TEBVs הדמיה וניטור לטווח ארוך של תרבות. פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל עבור ויזואליזציה של שינויים מורפולוגיים ומדידות עובי של כלי מהונדסים בתנאים תרבות אחרת. בנוסף, ניתן לבצע הבדיקות של השפלה מבוסס פולימר חומרים ברקמת הנדסה פיגומים לצורך הזיהוי. על ידי שילוב של שיטות של סריקת אלקטרונים microscopic(SEM) ו מקוטב מיקרוסקופ בשימוש פרוטוקול זה, המתאם, כימות של מטריצה חוץ-תאית הפצה והשפלה PGA יכול להתבצע, אשר יכול להקל להערכת לגרדום השפלה בשילוב הדמיה OCT.

Protocol

1. מתכלה PGA לגרדום המבוסס על תרבות כלי רקמות מהונדסים

1. ייצור PGA לגרדום
   1. לתפור רשת PGA (בקוטר 19 מ מ, עובי 1 מ"מ) סביב צינורות סיליקון מחוטא ע י אתילן אוקסיד (באורך 17 ס"מ 5.0 מ"מ קוטר, בעובי 0.3 מ מ) באמצעות 5-0 בתפר.
   2. לתפור טפלון (ePTFE, אורך 1 ס מ) 4-0 בתפר על גבי אחד מהקצוות של PGA רשת, החופף של 2 מ מ.
   3. טובלים PGA פיגומים עם יד 1 מול/ליטר NaOH במשך 1 דקה כדי להתאים את המבנה המרחבי של רשת השינוי ומשרים במים כיתה תרביות רקמה שלוש פעמים למשך 2 דקות כל אחד. בעדינות פאט יבש לגרדום בנייר טישו בכל פעם. ואז לייבש פיגומים בשכונה עם מפוח לשעה.
2. הרכבה של ביוריאקטור ו- Y-הצומת עבור הדמיה OCT
   1. משרים את הזכוכית עצמית מפותחת ביוריאקטור גלילי (בקוטר 10 ס מ ו- 11.7 ס מ גובה עם שפתיים ארבע, ארבע צד-זרועות החוצה הכור כפי שמוצג באיור1), פיגומים PGA, צינור סיליקון (חיצוני בקוטר 5 מ"מ, עובי 0.3 מ מ), צינורות מסתיימים, מחברים, מערבבים בר, ציוד להרכבה בתוך מיכל אתנול 95% עבור 2 h...
   2. משוך PGA לגרדום דרך הצד-סמל ביוריאקטור מחוברת בצד אחד עם מחבר, כמו גם צד אחר עם Y-צומת נהגו לשלוח OCT guidewire. להרכיב עוד PGA לגרדום ב ביוריאקטור באותה דרך. נא עיין באיור 1.
   3. מתאים ePTFE על השפתיים ביוריאקטור על ידי הידוק בתפרים 4-0.
   4. לשים את ביוריאקטור במיכל אתנול שוב על 1 h, לייבש לילה בשכונה עם מפוח על.
3. זריעה של HUASMCs ומיזוג ביוריאקטור סטטי
   1. לבודד HUASMCs מן האדם עורקי הטבור בטכניקות explant רגיל.
   2. להרחיב ולתחזק בתאי השריר החלק תא מדיום הגידול מורכב DMEM בינוני, סרום שור עוברית 20%, 2.36 מ"ג/מ"ל HEPES, U/mL 100 פניצילין G, פרולין µg/mL 50, 20 אלנין µg/mL, גליצין µg/mL 50, 1.5 µg/mL CuSO4, חומצה אסקורבית µg 50/mL , 10 ננוגרם למ"ל בסיסי פיברובלסט גורם גידול ו ng/mL 10 נגזר טסית פקטורי גדילה.
   3. HUASMCs זרע-ריכוז של 5 × 10⁶ תאים למ"ל במדיום תרבות לעיל על גבי פיגומים PGA.
   4. הכניסו למהומה בר (1.5 ס מ אורך) ביוריאקטור. הכנס אחד צינורית (בקוטר 5 מ מ, אורך 15 ס מ), שלושה מקטעי צינורות קצרים (5 מ מ קוטר, 7 ס מ אורך) לחילופי גזים דרך המכסה פקק סיליקון.
   5. לצרף PTFE מיקרומטר 0.22 מסננים כל שינוי צינורית אוויר והכובע הפארין אחד את הזונדה. להתאים את סרגל מערבבים עם מהירות מלהיב של 13 סיבובים לדקה. להרכיב ביוריאקטור זכוכית, המכסה פקק סיליקון, לגרדום PGA לתוך מערכת תרבות.
   6. לאפשר HUASMCs לדבוק למשך 45 דקות על-ידי הישענות על ביוריאקטור כל 15 דקות עם מעמד ימין ועל שמאל. הכור יציאות והמפרקים חתומים עם סרט פרפין.
   7. לחבר את לואו-Ye משאבה, PBS התיק, הנהג עם צינורות מסתיימים כמערכת זלוף. פתח את הכונן כדי למלא את הצינורות PBS.
   8. למקם את ביוריאקטור הכוללת חממה humidified עם 5% CO₂ ב 37 º C. למלא את התא תרבות 450 מ של המדיום תרבות HUASMCs.
   9. לחצו על הלחצן ' עצור ', מכבה את החשמל של המכשיר נסיעה. לגדול פיגומים הזריעה תחת תרבות סטטי למשך שבוע.
   10. לשנות את המדיום תרבות כל 3-4 ימים על ידי כ רפה בעברית חצי של המדיום הישן באמצעות הזנה אנטרלית ו מילוי הכור עם כמות שווה של טרי בינוני תרבות.
4. הכנה של מערכת זלוף OCT הדמיה
   1. משאבת נוזלים בתיק PBS לזרום דרך צינורות מסתיימים ובחזרה את התיק.
   2. פתח את הכוח של הנהג, לווסת את הגדרת משאבה עם תדירות של 60 פעימות דקה ופלט הלחץ הסיסטולי של 120 מ מ כספית. כוונן את הפרמטרים מכני לצרכים של תרבות וסקולרית הנדסת רקמות.
   3. לחץ על לחצן ההפעלה להפוך את המערכת זלוף לעבוד. לספק את לעיל קבוע פועמת גירוי בכלי הדם למשך 3 שבועות על ידי iteratively pressurizing^10,צינורות מסתיימים¹² לאחר שבוע של תרבות סטטי.

2. ביצוע הדמיה אופטית עם OCT

1. השתמש מקור אור כדי להבטיח את הרזולוציה צירית של 10-20µm ואת העומק תמונה של 1-2 מ מ כדי לזהות את המבנה של TEBV מבוסס על התדר OCT קרישה תוך-כלית הדמיה מערכת⁹.
2. הפעל את מתג ההפעלה ופתח את התוכנה לכידת התמונה.
3. להתחבר הקטטר הדמיה אופטיים סיבים נסיעה-מנוע, אופטי הבקר (DOC) עם קטטר לסגת אוטומטית בתפקוד.
4. הגדר פרמטרים של קצב רכישת התמונה 10 מסגרות לשנייה עם מהירות היי אוטומטית של 10 מ מ/s.
5. לצרף צנתר ההדמיה Y-צומת דרך הפארין כובע עם מחט 18 גרם.
6. להכניס את הצנתר בתוך צינור סיליקון ולזהות ההידוק בתפר של PGA רשת לפני טעינת PGA לגרדום על גבי ביוריאקטור.
7. המקום הקטטר עצה מעל האזור של ריבית. התאם את הזז התקן ולבדוק איכות התמונה⁸.
8. לרכוש תמונות ב 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 ימים בתרבות עבור כל TEBV בודדים ולשמור ברצף עם תצפית בזמן אמת של מיקרו TEBV, כולל משטח מורפולוגיה, המבנה הפנימי, קומפוזיציה.
9. חזור על המדידה עבור 3 פעמים לקבל מדידה אמין של כלי הנדסה בכל פעם. לכידת סדרה של תמונות במהלך בדיקה באמצעות התוכנה ללכידת תמונות.

3. הדמיה ניתוח

1. השתמש בתוכנת ניתוח התמונה כדי למדוד את עובי הקיר TEBV. בחר את התמונה כדי להיות מנותח. לחץ על הכלי מעקב כדי לזהות באופן אוטומטי בצד הפנימי של TEBV על ידי תוכנת באופן ידני לשרטט את הצד החיצוני. דיאגרמה של עובי יופיע על המסך.
2. חזור על המדידה עבור 5 פעמים לקבל מדידה אמין של המבנה. הניתוח OCT בוצע על ידי שני חוקרים עצמאיים עיוור על המידע שהושג.

4. הקציר של TEBV ועיבוד רקמה

1. פתח את המכסה פקק סיליקון הניח על ביוריאקטור התרבות תסתיים וזורקים המדיום תרבות. לשחרר ePTFE מהשפתיים ביוריאקטור וחותכים את צינורות סיליקון מהצד החיצוני של ePTFE עם מספריים. הקציר TEBVs מ ביוריאקטור וחותכים למקטעים לסריקה בדיקה מיקרוסקופיית אלקטרונים.
2. קח את שאר TEBVs וחתוכים לקוביות 4 מיקרומטר סעיפים עבה. נוציא את הצינור סיליקון תמיכה ולתקן חלקים עם 4% paraformaldehyde. ביצוע שגרתי היסטולוגית כתמים של מאסון trichrome, סיריוס אדום לבחון את המורפולוגיה של קולגן ו PGA^10,13,14.
3. כדי להעריך PGA תוכן ומרכיב קולגן, לבחון דגימות היסטולוגית עם סיריוס אדום מכתים על ידי מיקרוסקופ מקוטב. מלון PGA שרידים קיבלו את התחום בבירור דרך שבירה כפולה, האזור שריד ניתן לכמת בהתבסס על שטח חתך הרוחב¹⁰.

תוצאות

מערכת תלת מימדי התרבות כללה תא תרבות את ביוריאקטור ובמערכת זלוף עם מחזור נוזל סגור^10,13 (איור 1). הקטטר הדמיה OCT היה מוכנס לתוך בקצה הדיסטלי של Y-הצומת, התרחקה בצינור סיליקון עבור הדמיה. הדמיה OCT שימשה תחילה ניסחו אפיון מבניים TEBV...

Discussion

כדי ליצור מהונדסים כלי עם מבנה, תכונות מכניות דומים לאלה של כלי הדם יליד יכול להוביל לקצר את הזמן לשימוש קליני הוא המטרה הסופית של הנדסת כלי הדם. טכניקות דימות אופטי היתר הפריט החזותי של רקמות מהונדסים וסקולרית רכיבים ספציפיים, אשר לא יכול לפקח על מבנים בודדים ברחבי תרבות וחשיפה בשתלי סביב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PGA mesh	Synthecon
silicone tube	Cole Parmer
connector	Cole Parmer
intravascular OCT system	St. Jude Medical, Inc	ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic	Philips	FEI Philips XL-30
polarized microscope	Olympus	Olympus BX51
sutures	Johnson & Johnson
pulsatile pump	Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software	St. Jude Medical, Inc