Zerstörungsfreie Überwachung der abbaubaren Gerüst-basierten Tissue-Engineering Blutgefäß Entwicklung mit optischen Kohärenztomographie

Zusammenfassung

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die zerstörungsfreie und langperiodischer Überwachung des Prozesses der vaskulären Umbau und Abbau Gerüst in Echtzeit-Kultur von biologisch abbaubaren Polymeren Gerüst-basierten Tissue-engineering Blutgefäße mit pulsatile stimulation mit der optischen Kohärenztomographie wird hier beschrieben.

Zusammenfassung

Veränderter vascular Grafts mit strukturellen und mechanischen Eigenschaften ähnlich wie natürliche Blutgefäße werden voraussichtlich die wachsende Nachfrage nach arterielle Bypass. Charakterisierung von der Wachstumsdynamik und Umbau Prozess der abbaubaren Polymer Gerüst-basierten Tissue-engineering Blutgefäße (TEBVs) mit pulsatile Stimulation ist entscheidend für das Vascular Tissue Engineering. Optische bildgebende Verfahren zeichnen sich als leistungsfähige Werkzeuge für die Überwachung der Vaskularisierung des technischen Gewebes ermöglicht hochauflösende Bildgebung in Echtzeit-Kultur. Dieses Papier zeigt eine zerstörungsfreie und schnelle Echtzeit-imaging-Strategie, um das Wachstum zu überwachen und Umbau des TEBVs in langfristige Kultur mithilfe optischer Kohärenztomografie (OCT). Geometrische Morphologie wird ausgewertet, darunter Gefäße Umgestaltung Prozess, Wandstärke und Vergleich der TEBV Dicke in verschiedenen Kultur-Zeitpunkte und Anwesenheit der pulsatile Stimulation. Zu guter Letzt OCT bietet praktische Möglichkeiten für Echtzeit-Beobachtung der Abbau des Polymers in die Rekonstruktion Gewebe unter pulsatile Stimulation oder nicht und in jedem Gefäß-Segment, verglichen mit der Bewertung des Polymer Abbau mit scanning Electron microscopic(SEM) und polarisierte Mikroskop.

Einleitung

Tissue-Engineering Blutgefäße (TEBVs) ist die vielversprechendste Material als eine ideale Gefäßprothese¹. Um Transplantate klinisch nützlich mit ähnlichen strukturellen und funktionellen Eigenschaften als native Schiffe zu entwickeln, wurden mehrere Techniken so Gefäßfunktion^2,3zu erhalten. Zwar gab es veränderter Gefäße mit akzeptablen Durchgängigkeit Raten während der Implantation und in Phase III klinische Studie⁴, zeigen langfristige Kultur und hohen Kosten auch die Notwendigkeit der Überwachung der Entwicklung des TEBVs. Verständnis der extrazellulären matrix(ECM) Wachstum, Umbau und Anpassung Prozesse in TEBVs in der biomimetischen Chemo-mechanischen Umgebung bieten wichtige Informationen für die Entwicklung des Vascular Tissue Engineering.

Die ideale Strategie verfolgen die Entwicklung von kleinem Durchmesser veränderter Gefäße⁵ sollte zerstörungsfrei, STERIL, längs-, dreidimensionale und quantitative. TEBVs unter verschiedenen Kulturbedingungen konnte durch diese bildgebende Modalität, sogar einschließlich Änderungen vor und nach der vaskulären Transplantation bewertet werden. Strategien, um die Funktionen des Lebens zu beschreiben, veränderter Gefäße benötigt werden. Optische bildgebende Verfahren ermöglichen die Visualisierung und Quantifizierung von Gewebe Abscheidung und Biomaterialien. Weitere Vorteile sind die Möglichkeit, tiefen Gewebe und markierungsfreie Bildgebung mit hoher Auflösung^6,7zu aktivieren. Bild-spezifische Moleküle und weniger leicht zugängliche optische Geräte zur Echtzeit-Überwachung ist jedoch ein erhebliches praktisches Hindernis, das die umfassende Anwendung der nichtlinearen optischen Mikroskopie begrenzt hat. Optische Kohärenztomografie (OCT) ist ein optischer Ansatz mit intravaskulären bildgebende Modalität als weit verbreitete klinische Instrument zur kardialen interventionellen Therapie⁸führen. In der Literatur berichtete die OCT-Methode als eine Möglichkeit, die Wandstärke des TEBVs^9,10, gepaart mit affirmativen bildgebender Verfahren für Vascular Tissue engineering Research zu bewerten. In der Erwägung, dass die Dynamik der vaskulären entwickelt wurde Wachstum und Umbau nicht beobachtet.

In dieser Handschrift die, ausführlich wir die Erstellung von biologisch abbaubaren Polymeren Gerüst-basierte TEBVs für vier Wochen Kultur. Menschlichen Nabelschnur Arterien vaskulären glatten Muskelzellen (HUASMCs) sind erweitert und in eine poröse abbaubaren Polyglycolic Säure (PGA) Gerüste im Bioreaktor ausgesät. Biologisch abbaubare Polymere die Rolle in einem temporären Substrat für das Tissue Engineering und haben eine gewisse Verschlechterung Rate¹¹. Um entsprechende Übereinstimmung zwischen Gerüst Abbau und Neo-gewebsneubildung zu gewährleisten, sind ECM und PGA Gerüste entscheidende Faktoren für die effektive Gefäße Umgestaltung. Die Perfusion System simuliert der biomechanischen Mikroumgebung von einheimischen Schiffen und unterhält eine konsequente Verformung unter Druck-Stimulation.

Das Ziel des vorliegenden Protokolls ist eine relativ einfache und zerstörungsfreie Strategie für TEBVs imaging und Langzeitüberwachung der Kultur zu beschreiben. Dieses Protokoll kann zur Visualisierung der morphologischen Veränderungen und Dickenmessung von veränderter Gefäße unter verschiedenen Kulturbedingungen genutzt werden. Darüber hinaus können die Analysen der Polymer-basierten Materialien Abbau in der Gewebetechnik Gerüste für die Identifizierung durchgeführt werden. Durch die Kombination von Methoden des Scannens Elektron können microscopic(SEM) und polarisierte Mikroskop verwendet in diesem Protokoll, Korrelation und Quantifizierung der extrazellulären Matrix Verteilung und PGA Abbau erfolgen die Bewertung Gerüst erleichtern kann, Abbau in Kombination mit OCT-Bildgebung.

Protokoll

(1) abbaubar PGA Gerüst basierte Tissue-Engineering Schiffe Kultur

1. PGA-Gerüst Herstellung
   1. Nähen Sie PGA-Netz (19 mm Durchmesser und 1 mm dick) um Silikonschlauch sterilisiert mit Ethylenoxid (17 cm lang, Durchmesser 5,0 mm und 0,3 mm dick) mit 5: 0 Naht.
   2. Nähen Sie Polytetrafluorethylen (ePTFE, 1cm Länge) mit 4: 0 Naht auf jedem Ende des PGA-Netzes und von 2 mm überlappt.
   3. Tauchen Sie PGA Gerüste mit der Hand in 1 Mol/L NaOH für 1 min, passen die räumliche Struktur des Netzes und mit Gewebekultur Grade Wasser drei Mal für 2 min einweichen. Trocknen Sie das Gerüst mit einem Papiertuch sanft pat jedes Mal. Dann vertrocknen Sie Gerüste in eine Kapuze mit einem Gebläse für 1 h.
2. Montage der Bioreaktor und der Y-Kreuzung für die OCT-Bildgebung
   1. Einweichen der selbstentwickelten Glas zylindrische Bioreaktor (10 cm Durchmesser und 11,7 cm Höhe mit vier Lippen innen und vier Seitenarme außerhalb des Reaktors, wie in Abbildung 1dargestellt), PGA Gerüste, Silikonschlauch (Außendurchmesser 5 mm, Stärke 0,3 mm), biokompatible Rohre, Anschlüsse, Stir Bar und Ausrüstung für die Montage in einem 95 % Ethanol Tank für 2 h.
   2. Ziehen Sie PGA Gerüst durch Seitenarme des Bioreaktors verbunden zu einer Seite mit einem Stecker als auch eine andere Seite mit der Y-Kreuzung verwendet, OCT Führungsdraht zu liefern. Montieren Sie eine weitere PGA-Gerüst im Bioreaktor auf die gleiche Weise. Siehe Abbildung 1.
   3. Passen Sie ePTFE Bioreaktor Lippen durch das Anziehen mit 4: 0 Nahtmaterial.
   4. Den Bioreaktor in Ethanol Tank wieder für 1 h und Trocknen über Nacht in Haube mit Gebläse auf.
3. Aussaat von HUASMCs und statischen Bioreaktor Klimaanlage
   1. HUASMCs von menschlichen Nabelschnur Arterien durch standard Explant Techniken isolieren.
   2. Zu erweitern Sie und zu pflegen Sie, dass Zellen im glatten Muskel Zelle Wachstumsmedium bestehend aus DMEM Medium, 20 % fötalen Rinderserum, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL Penicillin G, 50 µg/mL Prolin, 20 µg/mL Alanin, 50 µg/mL Glycin, 1,5 µg/mL CuSO4, 50 µg/mL Ascorbinsäure , grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor mit 10 ng/mL und 10 ng/mL Platelet-derived Wachstumsfaktor.
   3. Samen HUASMCs in einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/mL in den oben genannten Kulturmedium auf der PGA-Gerüste.
   4. Setzen Sie einen Stir bar (1,5 cm Länge) im Bioreaktor. Legen Sie eine Ernährungssonde (Durchmesser 5 mm, Länge 15 cm) und drei kurze Schläuche Segmente (5 mm Durchmesser, 7 cm Länge) für Gasaustausch durch den Silikon-Stopper-Deckel.
   5. Jede Änderung Luftschlauch und ein Heparin-Kappe, um die Einfüllöffnung PTFE 0,22 µm Filter zuordnen. Anpassen der Stir Bar mit einer mitreißenden Geschwindigkeit von 13 Schuss pro Minute. Montieren Sie die Glas Bioreaktor, Silikon Stopper Deckel und PGA Gerüst in der Kultursystem.
   6. HUASMCs für 45 Minuten zu halten, indem Sie lehnen den Bioreaktor alle 15 min mit Ständer, nach links und rechts zu ermöglichen. Der Reaktor Häfen und Gelenke sind alle mit Paraffin Film versiegelt.
   7. Schließen Sie die Luo-Ye Pumpe, PBS Tasche, den Fahrer mit biokompatiblen Röhren als die Perfusion System. Öffnen Sie das Laufwerk, die Rohre mit PBS zu füllen.
   8. Ort der gesamten Bioreaktor in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 ° C. Füllen Sie die Kultur-Kammer mit 450 mL Kulturmedium HUASMCs.
   9. Drücken Sie die Stopptaste und schalten Sie die Stromversorgung der Antriebseinrichtung. Wachsen Sie die gesäten Gerüste unter Statische Kultur für eine Woche.
   10. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3-4 Tage durch Absaugen die Hälfte des alten Mediums durch die Einfüllöffnung und Nachfüllen des Reaktors mit eine äquivalente Menge an frischem Nährmedium.
4. Vorbereitung der Perfusion System für OCT-Bildgebung
   1. Pumpen Sie Flüssigkeiten in der PBS-Tasche durch biokompatible Röhren und zurück in den Beutel zu zirkulieren.
   2. Öffnen Sie die Kraft des Fahrers und regulieren Sie Pumpe-Einstellung mit einer Frequenz von 60 Schlägen pro Minute und Output systolischen Druck von 120 MmHg zu. Passen Sie die mechanischen Parameter entsprechend den Anforderungen der technischen Kreislauf Gewebekultur.
   3. Klicken Sie auf Ausführen, um die Perfusion System funktioniert. Geben Sie die oben genannten feste pulsatile Stimulation zu den Schiffen für 3 Wochen durch Druckbeaufschlagung iterativ biokompatible Röhren^10,12 nach 1 Woche statische Kultur.

2. Durchführung der optischen Bildgebung mit OCT

1. Verwenden Sie eine Lichtquelle um die axiale Auflösung des 10-20µm und die Bildtiefe von 1-2 mm Ermittlung die Struktur des TEBV basierend auf den Frequenzbereich OCT intravaskulären imaging System⁹sicherzustellen.
2. Schalten Sie den Ein-/Ausschalter und öffnen Sie die Bild-Capture-Software zu.
3. Verbinden Sie den Fiber optic imaging Katheter an den Antriebsmotor und optische Controller (DOC) mit Katheter automatischer Rückzug Funktion.
4. Eingestellten Parameter des Bildes Erfassungsrate auf 10 Bilder pro Sekunde mit einer automatischen Rückzug Geschwindigkeit 10 mm/s.
5. Legen Sie imaging Katheter auf Y-Kreuzung über Heparin Kappe mit einer Nadel 18G.
6. Legen Sie den Katheter in den Silikonschlauch und identifizieren Sie die Naht Dichtheit der PGA Netz vor dem Laden PGA Gerüst auf den Bioreaktor zu.
7. Platzieren Sie die Katheterspitze über der Region von Interesse. Passen Sie die Pullback-Gerät und überprüfen Sie für die Bild-Qualität-⁸.
8. Abrufen von Bildern auf 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 Tage in Kultur für jede einzelne TEBV und sparen gegenüber dem Vorquartal mit Echtzeit-Beobachtung des TEBV Mikrostruktur, einschließlich Oberflächenmorphologie, interne Struktur und Zusammensetzung.
9. Wiederholen Sie die Messung für 3 Mal, um zuverlässige Messung der technischen Schiffe jedes Mal bekommen. Erfassen Sie eine Serie von Bildern während der Testphase mit dem Bild-Capture-Software.

3. bildgebende Analyse

1. Verwenden Sie Bildanalyse-Software TEBV Wandstärke messen. Wählen Sie das Bild analysiert werden. Klicken Sie auf die Tracking-Tool, um die innere Seite des TEBV von der Software automatisch zu identifizieren und manuell Skizze der äußeren Seite. Ein Diagramm der Dicke wird auf dem Bildschirm angezeigt.
2. Wiederholen Sie die Messung für 5mal um zuverlässige Messung der Konstrukte zu erhalten. Die OCT-Analyse wurde von zwei unabhängigen Ermittlern geblendet, die erhaltenen Informationen durchgeführt.

4. Ernte von TEBV und Gewebe Verarbeitung

1. Offen Silikon Stopper Deckel über den Bioreaktor gelegt, nach Beendigung die Kultur und das Kulturmedium zu verwerfen. EPTFE vom Bioreaktor Lippen lösen und die Silikonschläuche von der äußeren Seite der ePTFE mit einer Schere durchschneiden. Ernten Sie TEBVs aus dem Bioreaktor zu und schneiden Sie in Abschnitte für das Scannen von Elektronenmikroskopie Prüfung.
2. Nehmen Sie den Rest des TEBVs und in 4 µm Dicke Abschnitte geschnitten. Unterstützendes Silikonschlauch herausziehen und Abschnitte mit 4 % Paraformaldehyd befestigen. Führen Sie regelmäßige histologische Färbung von Masson trichrome und Sirius rote zu prüfen, die Morphologie von Kollagen und PGA^10,13,14.
3. Um PGA Inhalte und Kollagen-Komponente zu beurteilen, beobachten Sie histologische Proben mit Sirius rote Färbung durch eine polarisierte Mikroskop. PGA-Reste sind klar abgegrenzt durch Doppelbrechung und Überrest Bereich basierend auf die Querschnittsfläche¹⁰quantifiziert werden kann.

Ergebnisse

Die dreidimensionalen Kultursystems bestand aus einer Kultur Kammer in den Bioreaktor und die Perfusion System mit einem geschlossenen Kreislauf Flüssigkeit^10,13 (Abbildung 1). Die OCT-Bildgebung-Katheter eingefügt in das distale Ende des Y-Kreuzung und zog sich zurück in den Silikonschlauch für die Bildgebung. OCT-Bildgebung wurde zuerst verwendet, um die strukturelle Charakterisierung von biolog...

Diskussion

Zu generieren entwickelt Schiffe mit strukturellen und mechanische Eigenschaften ähnlich denen von native Blutgefäße führen um zu verkürzen die Zeit für die klinische Anwendung und ist das ultimative Ziel des vaskulären Engineering. Optische bildgebende Verfahren ermöglichen die Visualisierung von Gewebezüchtungen vaskulären spezifische Komponenten, die einzelnen Konstrukte in der gesamten Kultur und Belichtung Transplantate zu einer Kultur-Umgebung überwachen kann, ohne Kompromisse bei der Sterilität

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PGA mesh	Synthecon
silicone tube	Cole Parmer
connector	Cole Parmer
intravascular OCT system	St. Jude Medical, Inc	ILUMIEN™ OPTIS™ SYSTEM
scanning electron microscopic	Philips	FEI Philips XL-30
polarized microscope	Olympus	Olympus BX51
sutures	Johnson & Johnson
pulsatile pump	Guangdong Cardiovascular Institute
LightLab Imaging software	St. Jude Medical, Inc