一种研究细胞间分泌信号的近距离培养方法

摘要

分泌和 juxtacrine 细胞相互作用在许多生物学过程中起着重要作用, 包括肿瘤的进展、免疫反应、血管生成和发育。在这里, 一种近端培养方法用于研究分泌信号, 其中的分泌因子的局部浓度保持, 而防止直接细胞接触。

摘要

细胞间相互作用在许多生物学过程中起着重要作用, 包括肿瘤进展、免疫反应、血管生成和发育。分泌或 juxtacrine 信号介导这种相互作用。使用条件中等和共培养研究是区分这两种相互作用的最常见的方法。然而, 在分泌相互作用过程中, 局部高浓度分泌因子在微环境中的作用不是通过条件培养基准确概括的, 因此可能导致不精确的结论。为了克服这一问题, 我们设计了一种近端培养方法来研究分泌信号。两种细胞生长在10µm 厚的聚碳酸酯膜的任何表面, 0.4 µm 毛孔。毛孔允许交换分泌因子, 同时抑制 juxtacrine 信号。可以在端点收集和裂解细胞, 以确定分泌信号的影响。除了允许分泌因子的局部浓度梯度外, 这种方法还能经受长时间的培养以及抑制剂的使用的实验。利用这种方法研究卵巢癌细胞与转移部位间皮细胞的相互作用, 可以适应任何两种黏附细胞类型, 研究分泌信号在各个领域的应用,包括肿瘤微环境、免疫学和发育。

引言

癌细胞与肿瘤微环境的相互作用在肿瘤进展中的作用已经得到了很好的确立, 并已成为癌症生物学研究的主要重点¹。在伤口愈合、免疫应答、血管生成、干细胞龛位和发育过程中, 双向信号的相似情况是至关重要的,^{2、3、4、5、6,7,8}. 在所有这些生物过程中, 一个共同的主题是细胞以各种方式对其微环境中的细胞外信号作出反应, 这决定了体细胞的命运、组织生理学和疾病进展。因此, 重点日益转向发展对这种细胞通讯所涉及的机制的更好的了解。大多数这种相互作用涉及细胞之间的分泌或 juxtacrine 信号。分泌信号涉及特定信号因子的分泌由一个细胞, 这是由相应的受体在附近的另一个细胞感知, 触发反应, 在它^9,10, 而 juxtacrine信号要求两个细胞的细胞成分之间的直接接触涉及^11,12。

这种信号是组织稳态以及肿瘤微环境中的重要组成部分。癌细胞从肿瘤基质细胞中的分泌和 juxtacrine 因子中受益, 包括肿瘤相关的成纤维细胞 (咖啡馆)、免疫细胞和脂肪瘤^{13、14、15、16}。分泌信号可以由生长因子、细胞因子、趋化因子等介导, 而 juxtacrine 信号则包括在凹槽信号中并列配体和受体, 或整合与其各自的相互作用细胞外基质蛋白。我们已经证明了卵巢癌细胞与咖啡馆在肿瘤进展和转移中相互作用的重要性¹⁴。同样, 转移卵巢癌细胞与覆盖转移部位的间皮细胞的相互作用, 调节癌细胞的关键 microRNAs 和转录因子, 促进转移性殖民化^17,18。

大多数关于分泌信号的研究涉及使用从一个细胞类型收集的条件培养基来治疗第二细胞类型。虽然这种方法已被广泛使用, 但它并没有有效地复制在接收细胞微环境中分泌因子的局部高浓度水平。它也无法重现由一个细胞产生的分泌因子连续流动的动力学, 相邻细胞接收。分泌信号是有效的短距离, 因为分泌因子是在所需浓度仅在源细胞附近, 并倾向于扩散和稀释, 随着距离的增加。这种局部高浓度的分泌因子对于触发受体细胞的反应至关重要。此外, 受体细胞的反应也依赖于新分泌因子的平衡, 以及它们在受体细胞中的退化、束缚和内化以及从源细胞扩散的持续损耗。条件培养基可以集中在微环境中存在的较高的局部浓度, 但不能准确地复制准确的浓度。此外, 它不能模仿生产的自然动力学和所涉及的因素的耗尽。为了更准确地复制分泌信号并将其与 juxtacrine 信号机制分开, 我们设计了一种新的近距离培养方法, 它涉及在多孔膜的任一表面上生长两种细胞类型。毛孔小到足以防止 juxtacrine 相互作用, 但允许在局部高浓度下交换分泌因子。这样, 系统就保留了生产的动力学和分泌因素的损耗。

研究方案

该议定书遵循印第安纳大学机构管理委员会的指导方针。

1. 细胞制剂

1. 人原发性间皮细胞的分离与培养
   1. 从人网膜中分离人原发性间皮细胞 (HPMCs), 如前所述^17、18和生长在完全生长培养基 [Dulbecco 的改良鹰的培养基 (DMEM) 含有10% 胎牛血清, 1%青霉素-链霉素, 1% 非必需氨基酸, 1% 维生素] 在37摄氏度和 5% CO₂。
      注: HPMCs 通常生长到100% 汇合处 (图 1A)。
2. 卵巢癌细胞生长条件的研究
   1. 生长 HeyA8 卵巢癌细胞在完全生长培养基在37°c 和 5% CO₂。
      注意: 使用 HeyA8 细胞生长到大约80% 汇合处 (图 1B)。

2. 细胞培养

1. 近端区域性设置
   1. 使用 Transwell 插入6井板与10微米厚的组织培养处理聚碳酸酯膜与0.4 微米毛孔 (10⁸毛孔/cm²) 和4.67 厘米²生长区。如果需要, 可通过缩放根据生长表面积来播种的细胞数量来优化不同的插入尺寸。热完全生长培养基, 胰蛋白酶, 和磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 到37摄氏度使用前。
2. 准备插入
   1. 要将插入膜下部表面的 HeyA8 细胞播种, 请使用无菌钳从包装中取出插入物, 并将其倒置在不育的15厘米培养皿中。
   2. 使用15厘米的菜, 因为它有深度容纳倒置插入, 或替代任何适当的无菌容器。根据实验, 将所需的插入数放置在15厘米的盘子中。
   3. 标签三控制和三实验条件相应地与标记在刀片的边缘。
3. 准备癌细胞
   1. 为了胰蛋白酶处理在25厘米²瓶 (~ 2 x 10⁶细胞) 的80% 汇合处生长的 HeyA8 细胞, 添加1毫升的胰蛋白酶 (0.25%) 用于 40–60 s, 中和胰蛋白酶与6毫升完全生长培养基。
   2. 将细胞以室温 (RT) 500 x g的速度离心成3分钟, 丢弃上清, 并在5毫升的完全生长培养基中并用重悬细胞颗粒。用台盼蓝染料排除法对活细胞进行计数。
4. 培养癌细胞
   1. 在完全生长培养基中悬浮10万细胞/毫升活 HeyA8 细胞。小心种子 8万 HeyA8 细胞悬浮在 800 ul 的完全生长培养基上的插入 (现在正朝上, 因为它是倒置)。
   2. 种子单元格形成一个圆顶状形状, 使单元格保持在插入上 (图 1C)。从膜的中心开始, 在同心圆内向外移动, 慢慢吹打。避免超过3毫米从边缘, 以防止任何溢出的介质。
      注: 种子细胞数量将取决于细胞的生长速率和实验的持续时间。对近端培养的 HeyA8 细胞数量进行了优化, 在第三天结束时, 细胞将80–90% 汇合。
5. 肿瘤细胞附件
   1. 盖上15厘米的盘子, 小心地将含有插入物的盘子移到 CO₂孵化器中。在这个步骤中, 不中断插入的介质和单元格的放置非常关键。将细胞保持在37°c 4 小时, 使癌细胞附着在插入物上。
6. 准备间皮细胞
   1. 在大约 4 h 以后, 胰蛋白酶处理 HPMCs 生长在100% 汇合在 75 cm²瓶 (~ 4 x 10⁶个细胞) 与2毫升胰蛋白酶 (0.25%) 为对的中最小和中和胰蛋白酶与12毫升完全生长培养基。
   2. 离心细胞在 500 x g在 RT 3 分钟, 并用重悬细胞颗粒在10毫升的完全生长培养基, 并计数的活细胞使用台盼蓝染料排除方法。
7. 将间皮细胞播种
   1. 在完全生长培养基中悬浮30万细胞/毫升活 HPMCs。将2.5 毫升新鲜完整的生长介质添加到6井板的每一个井中。小心地把15厘米的盘子里装有插入物的生物安全罩。使用无菌钳, 翻转插入和放置在6井板的井, 使其直立, 与 HeyA8 细胞附着在较低的表面浸入完全生长介质 (图 1C)。
   2. 种子 45万 HPMCs 悬浮在1.5 毫升的生长培养基内的插入与 HeyA8 细胞附着在表面上面对井底 (图 1C) 或插入没有任何 HeyA8 细胞的 HPMC 控制。添加1.5 毫升的生长培养基, 没有细胞的 HeyA8 控制。
8. 成长的近端文化
   1. 让近端文化生长在 CO₂孵化器在37°c 和 5% CO₂为 72 h。如有需要, 可按如下方式补充介质。
      1. 对于内插入, 删除750µL 和添加750µL 新鲜完整的生长培养基。
      2. 对于插入的外部 (6 井板), 去除1毫升和增加1毫升新鲜完全生长培养基。1毫升的选择是为了方便改变的媒介在一步。如果需要, 可以删除1.25 毫升, 取而代之。
9. 收集单元格
   1. 在近端培养72小时后采集细胞。在这一步骤中特别小心, 以防止交叉污染的 HeyA8 细胞和 HPMCs. 胰蛋白酶处理细胞, 离心, 并溶解颗粒, 而不是株溶藻细胞膜上的细胞, 以防止交叉污染。
10. Trypsinizing 细胞
    1. 用 1x PBS 冲洗插入件的两侧。
    2. 将插入件转移到新井中, 加入胰蛋白酶。加入0.5 毫升的胰蛋白酶到内插入, 并添加2毫升胰蛋白酶到6井板, 以胰蛋白酶处理癌细胞附着在下部的插入。在37摄氏度孵育2分钟的盘子。
11. 中和胰蛋白酶
    1. 加入1毫升的完全生长培养基内的插入, 以中和的胰蛋白酶, 吸管向上和向下, 然后采取细胞和转移到一个标记的收集管。添加额外的2毫升完整的生长培养基, 完全中和。应注意不要在吹打时刺穿细胞膜, 以防止细胞交叉污染。
    2. 要收集插入底部的单元格, 请将步骤12.2 中添加的2毫升胰蛋白酶移到下表面 2–3x, 使细胞落入6井板的底部。将该板块底部的胰蛋白酶与6毫升的生长培养基中和, 将该板块的内容转移到标记的收集管上。
12. 收集和株溶藻细胞
    1. 离心细胞在 500 x g 3 分钟, 并吸入介质。并用重悬和溶解以0.7 毫升苯酚-硫氰酸胍为基础的裂解试剂进行 RNA 提取。使用任何合适的工具包隔离 RNA。

3. 定量实时聚合酶链反应

注: 以下步骤描述了定量的实时聚合酶链反应 (qPCR), 以研究基因表达的变化, 由于近端培养。

1. 从 RNA 样品中制备 qPCR 的 cDNA。使用任何合适的逆转录酶与相应的缓冲和随机引物, 以确保所有 mRNA 的反向转录 (见材料表)。
2. 通过 qPCR 与甘油 3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 作为内部控制, 评估纤维连接蛋白 (FN1) 和 e-钙黏蛋白 (CDH1) mRNA 表达水平的变化和转化生长因子 beta 1 (TGFβ1)。可以使用标准化的商用基因表达化验 (见材料表) 或设计底漆。
3. 比较近端培养中的 HeyA8 细胞与 HPMCs 的 HeyA8 控制和近端培养的 HPMCs 与 HPMC 的对照。

结果

转移卵巢癌细胞在腹膜腔内的转移部位出现间皮细胞¹⁹。生产分泌和 juxtacrine 与间皮细胞的相互作用有助于诱导卵巢癌细胞的适应性反应, 从而成功转移^17,18,20,21.为了检验近端培养方法的有效性, 我们测试了 HeyA8 卵巢癌细胞与 HPMCs 的分泌相互作用。以前有报?...

讨论

了解细胞间分泌和 juxtacrine 信号的机制对于培养对正常组织稳态和疾病状况的更好的认识是至关重要的,^7,8。大多数分泌信号的研究是通过收集条件培养基从一个细胞类型和使用它来治疗其他细胞类型。这种方法在其固有的简单性方面具有优势。然而, 它并没有准确地重述细胞微环境中分泌因子的局部浓度, 或所涉及因素的产生和消耗的动力学。虽然前者...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert	Corning (Costar)	3412	• 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation
6 well plate	Corning (Falcon)	353046	Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish	Corning (Falcon)	353025	Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI
MEM Nonessential amino acids	Corning (Cellgro)	25-025-CI
MEM Vitamins	Corning (Cellgro)	25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Pipets			Any make is fine
CO2 Incubator			Any make is fine
Biosafety level II cabinet			Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit	Qiagen	217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells	Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody	R&D Systems	MAB1835-100