Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

Resumo

Parácrina e justácrina interacções celulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Aqui, um método de cultura proximal é usado para estudar a sinalização parácrina onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas, evitando o contato direto do celular.

Resumo

Interações intercelulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Parácrina ou sinalização justácrina Medeia tais interações. O uso de um meio condicionado e estudos coculture são os métodos mais comuns para discriminar entre estes dois tipos de interações. No entanto, o efeito de concentrações elevadas localizadas dos fatores secretados para o microambiente durante as interações parácrina não é instaurado com precisão por meio condicionado e, assim, pode levar a conclusões imprecisas. Para superar este problema, criámos um método de cultura proximal para estudar a sinalização parácrina. Os tipos de duas células são cultivados em qualquer superfície de uma membrana de policarbonato µm de espessura 10 com 0,4 µm de poros. Os poros permitem a troca de fatores secretados e, ao mesmo tempo, inibem a sinalização justácrina. As células podem ser coletadas e lysed no ponto de extremidade para determinar os efeitos da sinalização parácrina. Além de permitir para localizadas gradientes de concentração dos fatores secretados, este método é passível de experimentos que envolvem períodos prolongados de cultura, bem como o uso de inibidores. Enquanto nós usamos este método para estudar as interações entre as células de câncer de ovário e as células mesoteliais que encontram no local da metástase, pode ser adaptado para qualquer dois tipos de células aderentes aos pesquisadores estudar parácrina sinalização em vários campos, incluindo desenvolvimento, imunologia e microambiente do tumor.

Introdução

O papel de produtivas interações recíprocas entre as células cancerosas e o microambiente do tumor na progressão do tumor foi bem estabelecido e tornou-se um grande foco de pesquisa em câncer biologia¹. Instâncias similares de sinalização bidirecional são cruciais durante o ferida cura, respostas imunes, angiogênese, nichos de células-tronco e desenvolvimento^{2,3,4,5,6 , 7 , 8}. um tema comum em todos estes processos biológicos é que células respondem de várias maneiras para sinais extracelulares de seu microambiente que determinam o destino de celular, fisiologia do tecido e progressão da doença. Portanto, o foco tornou-se cada vez mais em direção a desenvolver uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em tais comunicações célula-célula. A maioria de tais interações envolvem parácrina ou justácrina sinalização entre as células. Sinalização parácrina envolve a secreção de fatores específicos sinalização por uma célula que são percebidas pelos receptores correspondentes na outra célula na vizinhança, desencadeando uma resposta dentro de^9,10, Considerando que justácrina sinalização requer o contato direto entre os componentes celulares das duas células envolvidas^11,12.

Essa sinalização é um componente crucial na homeostase do tecido, bem como o microambiente do tumor. As células cancerosas beneficiam parácrina e justácrina fatores de células do estroma do tumor, incluindo cancro associado fibroblastos (CAFs), células do sistema imunológico e adipócitos^13,14,15,16. A sinalização pode ser mediada por fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, etc., enquanto a sinalização justácrina envolve justapostos ligantes e receptores como sinalização Notch, ou interações entre integrinas e seus respectivos parácrina proteínas da matriz extracelular. Nós demonstramos a importância das interações recíprocas entre as células de câncer de ovário e CAFs no¹⁴, de progressão e metástase tumor. Da mesma forma, as interações de células de câncer de ovário metástase com as células mesoteliais, cobrindo o local da metástase regulam chave microRNAs e fatores de transcrição em células cancerosas que promovem a colonização metastático^{17, 18}.

A maioria dos estudos na sinalização parácrina envolvem o uso de um meio condicionado coletado de tipo de uma célula para tratar o segundo tipo de célula com. Enquanto esta abordagem tem sido amplamente utilizada, ele não Replica eficazmente os níveis de alta concentração localizados do fator secretado no microambiente da célula receptora. Também não consegue reproduzir a cinética do fluxo contínuo do fator secretado sendo produzido por uma célula e recebido pela célula vizinha. Parácrina é eficaz em distâncias curtas, como os fatores secretados são nas concentrações necessárias apenas nas imediações da célula de origem e tendem a difundir e diluir para fora à medida que aumenta a distância de sinalização. Esta alta concentração localizada do fator secretado é essencial para desencadear uma resposta na célula do receptor. Além disso, a resposta nas células destinatários também é dependente o equilíbrio dos fatores secretados recentemente e seu esgotamento contínuo através de degradação, vinculação e internalização no destinatários células e difusão longe da célula de origem. Meio condicionado pode ser concentrado a conta para as altas concentrações localizadas presentes no microambiente, mas que exatamente não pode replicar as concentrações exatas. Além disso, ele não pode imitar a cinética natural de produção e depleção do fator envolvido. Para mais precisão replicar sinalização parácrina e separá-lo de justácrina mecanismos de sinalização, criámos um método de cultura proximal romance, que envolve os tipos de duas células em qualquer superfície de uma membrana porosa a crescer. Os poros são pequenos o suficiente para evitar interações justácrina e ainda permitir a troca de fatores secretados em concentrações elevadas localizadas. Dessa forma, este sistema retém a cinética da produção e depleção dos fatores parácrina.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes do Conselho regulamentação institucional da Indiana University.

1. preparação da pilha

1. Isolamento e cultura de células mesoteliais primárias de
   1. Isolado primárias mesoteliais células humanas (HPMCs) de omento humana como descrito anteriormente,^17,18 e cultivá-las em completar o meio de crescimento [modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) contendo 10% de soro bovino fetal, 1% penicilina-estreptomicina, 1% não aminoácidos essenciais e vitaminas 1%] a 37 ° C e 5% de CO₂.
      Nota: Os HPMCs são normalmente cultivadas para a confluência de 100% (figura 1A).
2. Condições de crescimento de células de câncer de ovário
   1. Desenvolvem-se células de câncer de ovário HeyA8 meio de crescimento completa em 37 ° C e 5% de CO₂.
      Nota: Uso HeyA8 células cultivadas para cerca de 80% confluência (figura 1B).

2. cultura de pilha

1. Set-up cultura proximal
   1. Uso Transwell insere para placas boas 6 com uma membrana de policarbonato μm de espessura de tecido-cultura-tratados 10 com 0,4 μm poros (10⁸ poros/cm²) e uma área de crescimento 4,67 cm² . Se necessário, otimize para inserção de diferentes tamanhos, dimensionando o número de células semeado de acordo com a área de superfície de crescimento. Meio quente completo crescimento, tripsina e fosfato salino (PBS) a 37 ° C antes do uso.
2. Preparando as inserções
   1. Para propagar as células HeyA8 na superfície da membrana da inserção inferior, remova o encaixe de sua embalagem utilizando Pinças esterilizadas e coloque-invertida em um prato de cultura estéril de 15 cm.
   2. Use um prato de 15 cm, pois tem a profundidade para acomodar a inserção invertida, ou substituí-lo com qualquer recipiente estéril apropriado. Dependendo do experimento, coloque o número necessário de inserções no prato 15 cm.
   3. Rotule os três controles e três condições experimentais em conformidade com um marcador na borda das pastilhas.
3. Preparando as células cancerosas
   1. Para trypsinize as HeyA8 células cultivadas na confluência de 80% em um balão de² 25 cm (~ 2 x 10⁶ células), adicionar 1 mL de tripsina (0,25%) para 40-60 s e neutralizar a tripsina com 6 mL de meio de cultura completo.
   2. Centrifugar as células a 500 x g , à temperatura ambiente (RT) por 3 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 mL de meio de cultura completo. Conte as células ao vivo usando o método de exclusão do corante azul de Tripan.
4. Semeando as células cancerosas
   1. Suspenda a 100.000 células/mL de células de HeyA8 ao vivo no meio de crescimento completo. Cuidadosamente semente 80.000 HeyA8 células suspendidas em 800 μL de meio de cultura completo na parte inferior da inserção (que está agora virada para cima, uma vez que está invertida).
   2. As sementes das células para formar uma forma de cúpula, como assim as células permanecem na pastilha (Figura 1). Iniciar a partir do centro da membrana e mover-se para fora em círculos concêntricos ao Pipetar lentamente. Evite passar mais de 3 mm da borda para prevenir qualquer derramamento de médio porte.
      Nota: O número de células semeadas dependerá da taxa de crescimento das células e a duração do experimento. O número de células HeyA8 semeado para esta cultura proximal foram otimizado e as células será confluente 80 – 90% no final do terceiro dia.
5. Acessório de células de câncer
   1. Cubra o prato de 15 cm e cuidadosamente mover o prato contendo as inserções para a incubadora de CO₂ . É fundamental para que não perturbe a gota de médio e células na pastilha nesta etapa. Embora as células a 37 ° C por 4 h permitir que as células cancerosas anexar para a inserção.
6. Preparando as células mesoteliais
   1. Após cerca de 4 h, trypsinize as HPMCs crescidos na confluência de 100% em um balão de² 75cm (~ 4 x 10⁶ células) com 2 mL de tripsina (0,25%) por 1 – 2 min e neutralizar a tripsina com 12 mL de meio de crescimento completo.
   2. Centrifugar as células a 500 x g em RT por 3 min, Ressuspender as células em 10 mL de meio de cultura completo e contagem de células vivas, usando o método de exclusão do corante azul de Tripan.
7. Semeando as células mesoteliais
   1. Suspenda a 300.000 células/mL de HPMCs ao vivo no meio de crescimento completo. Adicione 2,5 mL de meio fresco completo de crescimento para cada poço de uma placa de 6. Cuidadosamente trazer o prato de 15 cm, contendo as inserções para fora para o bairro de biossegurança. Usando pinça estéril, a inserção da aleta e colocá-lo no poço da placa de 6-bem para que fique na posição vertical, com as células de HeyA8 ligadas à superfície inferior imergida no meio de crescimento completo (Figura 1).
   2. Semente de 450.000 HPMCs suspendidos em 1,5 mL do meio de crescimento no interior dos implantes com as células de HeyA8 ligadas à superfície, virado para o fundo do poço (Figura 1) ou para inserções sem quaisquer células HeyA8 para os controles HPMC. Adicione 1,5 mL de meio de crescimento sem pilhas para os controles HeyA8.
8. Crescer a cultura proximal
   1. Deixe a cultura proximal crescem a incubadora de CO₂ a 37 ° C e 5% de CO₂ por 72 h. Se necessário, o meio pode ser reposto da seguinte forma.
      1. Para o interior da inserção, remover 750 µ l e adicionar 750 µ l de meio fresco crescimento completo.
      2. Para o exterior da inserção (a 6 placa), retire 1 mL e adicionar 1 mL de meio fresco crescimento completo. O 1 mL foi escolhido para a conveniência de mudar o meio em uma única etapa. Se desejado, 1,25 mL pode ser removido e substituído em vez disso.
9. Recolha as células
   1. Recolha as células após 72 h da cultura proximal. Tome especial cuidado nesta etapa para evitar a contaminação cruzada de células HeyA8 e HPMCs. Trypsinize as células, centrifugue-los e lyse a pelota em vez de Lise das células na membrana para evitar uma contaminação cruzada.
10. Trypsinizing as células
    1. Enxágue ambos os lados da inserção com PBS 1x.
    2. As inserções de transferência para um novo poço e adicionar a tripsina. Adicionar 0,5 mL de tripsina no interior da inserção e adicionar 2 mL de tripsina para a placa de 6 para trypsinize as células de câncer ligadas à superfície inferior da inserção. Incubar a placa por 2 min a 37 ° C.
11. Neutralizando a tripsina
    1. Adicione 1 mL de meio de cultura completo no interior da inserção para neutralizar a tripsina, Pipetar para cima e para baixo e depois levar as células e transferi-los para um tubo de recolha rotulado. Adicione um adicional 2 mL do meio de crescimento completo de uma neutralização completa. Tenha cuidado para não perfurar a membrana enquanto pipetagem para evitar uma contaminação cruzada das células.
    2. Para coletar as células na parte inferior da inserção, pipete a tripsina 2ml que foi adicionada na etapa 12.2 para a superfície inferior 2 – 3 x para que as células cair na parte inferior da placa 6-poços. Neutralizar a tripsina na parte inferior da placa com 6 mL de meio de crescimento e transferir o conteúdo da placa para um tubo de recolha rotulado.
12. Coletando e lise das células
    1. Centrifugar as células a 500 x g por 3 min e Aspire os meios de comunicação. Resuspenda e lyse as pelotas de célula com 0,7 mL de reagente de Lise fenol e guanidina tiocianato-baseada para a extração de RNA. Isole o RNA usando qualquer kit apropriado.

3. reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa

Nota: As etapas a seguir descrevem uma reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR) para estudar as mudanças de expressões do gene como resultado a cultura proximal.

1. Prepare o cDNA de amostras de RNA para qPCR. Usar qualquer apropriado transcriptase reversa com um buffer correspondente e primers aleatórios para garantir a transcrição reversa do mRNA todos (ver Tabela de materiais).
2. Avaliar as alterações dos níveis de expressão de RNAm de fibronectina (FN1) e E-caderina (CDH1) e transformar o fator de crescimento beta 1 (TGFβ1) por qPCR com gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como um controle interno. É possível usar padronizados ensaios de expressão de gene comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) ou para projetar primers.
3. Compare as HeyA8 células crescidas na cultura proximal com HPMCs com os controles HeyA8 e as HPMCs crescidos em cultura proximal com os controles HPMC.

Resultados

Metástase de células de câncer de ovário encontram células mesoteliais no local da metástase dentro da cavidade peritoneal¹⁹. Produtivo parácrina e justácrina interações com a ajuda de células mesoteliais na indução de respostas adaptáveis nas células de câncer de ovário, que permitem sucesso metástase^17,18,20,21 . Para ...

Discussão

Compreender o mecanismo de parácrina e justácrina sinalização entre as células é essencial para o desenvolvimento de um melhor conhecimento do tecido normal homeostase e doença condições^7,8. Parácrina a maioria dos estudos são conduzidos através da recolha de sinalização condicionado médio de uma célula tipo e usá-lo para tratar o outro tipo de célula. Este método tem uma vantagem em sua simplicidade inerente. No entanto, isso não com precisã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert	Corning (Costar)	3412	• 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation
6 well plate	Corning (Falcon)	353046	Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish	Corning (Falcon)	353025	Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI
MEM Nonessential amino acids	Corning (Cellgro)	25-025-CI
MEM Vitamins	Corning (Cellgro)	25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Pipets			Any make is fine
CO2 Incubator			Any make is fine
Biosafety level II cabinet			Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit	Qiagen	217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells	Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody	R&D Systems	MAB1835-100