Une méthode de Culture Proximal pour étudier la signalisation Paracrine entre cellules

Résumé

Interactions cellulaires paracrine et juxtacrine jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Ici, une méthode de culture proximale est utilisée pour étudier la signalisation paracrine où les concentrations localisées des facteurs sécrétés sont entretenues tout en empêchant le contact cellulaire direct.

Résumé

Les interactions intercellulaires jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la progression tumorale, réponse immunitaire, l’angiogenèse et le développement. Paracrine ou juxtacrine signalisation intervient dans ces interactions. L’utilisation d’un milieu conditionné et co-culture études sont les méthodes les plus courantes d’établir une distinction entre ces deux types d’interactions. Cependant, l’effet des concentrations élevées localisées des facteurs sécrétés dans le microenvironnement durant les interactions paracrines n’est pas précisément récapitulé par milieu conditionné et, par conséquent, peut conduire à des conclusions imprécises. Pour contourner ce problème, nous avons mis au point une méthode de culture proximal pour étudier la signalisation paracrine. Les deux types de cellules sont cultivées sur une surface d’une membrane de 10 µm d’épaisseur en polycarbonate avec 0,4 µm pores. Les pores permettent l’échange de facteurs sécrétés et, en même temps, inhibent juxtacrine signalisation. Les cellules peuvent être collectées et lysées au point de terminaison pour déterminer les effets de la signalisation paracrine. En plus de permettre des gradients de concentration localisées de facteurs sécrétés, cette méthode se prête aux expériences portant sur des périodes prolongées de la culture, ainsi que l’utilisation d’inhibiteurs. Bien que nous utilisions cette méthode pour étudier les interactions entre les cellules de cancer de l’ovaire et les cellules mésothéliales qu’ils rencontrent sur le site de la métastase, il peut être adapté à n’importe quel deux types de cellules adhérentes aux chercheurs d’étudier paracrine signalisation dans divers domaines, y compris développement, immunologie et microenvironnement tumoral.

Introduction

Le rôle des interactions réciproques productives entre cellules cancéreuses et le microenvironnement tumoral dans la progression tumorale a été clairement établi et est devenu un axe majeur de la recherche en biologie de cancer¹. Des cas semblables de bidirectionnel de signalisation sont essentiels pendant la cicatrisation, les réponses immunitaires, angiogenèse, niches de cellules souches et développement^{2,3,4,5,6 , 7 , 8}. un thème commun à tous ces processus biologiques, c’est que les cellules réagissent de différentes façons à des signaux extracellulaires de leur microenvironnement qui déterminent le sort de la cellule, physiologie des tissus et progression de la maladie. Par conséquent, l’accent a plus en plus tourné vers l’élaboration d’une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les communications de ces cellules. Une majorité de ces interactions impliquent paracrine ou juxtacrine de signalisation entre les cellules. Signalisation paracrine implique la sécrétion de facteurs de signalisation spécifiques par une cellule qui sont perçus par des récepteurs correspondants sur une autre cellule dans les environs, déclenchant une réaction dedans^9,10, tandis que juxtacrine signalisation nécessite un contact direct entre les composants cellulaires des deux cellules impliqués^11,12.

Cette signalisation est une composante essentielle dans l’homéostasie tissulaire, ainsi que dans le microenvironnement tumoral. Les cellules cancéreuses bénéficient de facteurs paracrines et juxtacrine des cellules dans le stroma tumoral, y compris les fibroblastes associés au cancer (CAFs), les cellules immunitaires et les adipocytes^13,14,15,16. Le paracrine signalisation peut être médiée par des facteurs de croissance, cytokines, chimiokines, etc., tandis que la signalisation juxtacrine implique des ligands juxtaposés et récepteurs comme signalisation Notch, ou les interactions entre les intégrines et leurs respectifs protéines de la matrice extracellulaire. Nous avons démontré l’importance des interactions réciproques entre les cellules de cancer de l’ovaire et CAFs en tumeur la progression et la métastase¹⁴. De même, les interactions entre les cellules métastases de cancer de l’ovaire avec les cellules mésothéliales portant sur le site de la métastase réglementent les microARN clés et facteurs de transcription dans les cellules cancéreuses qui favorisent la colonisation métastatique^{17, 18}.

La plupart des études sur la signalisation paracrine impliquent l’utilisation d’un milieu conditionné prélevé sur un type de cellule pour traiter le deuxième type de cellule avec. Bien que cette approche a été largement utilisée, il ne réplique pas efficacement les niveaux de haute concentration localisées du facteur sécrété dans le microenvironnement de la cellule réceptrice. Aussi, il ne parvient pas à reproduire la cinétique de l’écoulement continu du facteur sécrété produit par une cellule et reçue par la cellule voisine. Paracrine signalisation est efficace sur de courtes distances, comme les facteurs sécrétés sont aux concentrations requises uniquement dans le voisinage de la cellule source et ont tendance à diffuser et diluer à mesure que la distance augmente. Cette forte concentration localisée du facteur sécrété est indispensable pour déclencher une réponse dans la cellule réceptrice. En outre, la réponse dans les cellules réceptrices dépend aussi l’équilibre des facteurs nouvellement sécrétées et leur épuisement continu par le biais de dégradation, une liaison et internalisation dans les cellules réceptrices et la diffusion de la cellule source. Un milieu conditionné peut être concentré pour tenir compte des plus fortes concentrations localisées présentes dans le micro-environnement, mais qui ne peut pas reproduire avec précision les concentrations exactes. En outre, il ne peut pas imiter la cinétique naturelle de la production et l’épuisement du facteur impliqué. Pour mieux reproduire la signalisation paracrine et séparer de juxtacrine mécanismes de signalisation, nous avons mis au point une méthode de culture de proximal roman, ce qui implique de plus en plus les deux types de cellules sur chaque surface d’une membrane poreuse. Les pores sont suffisamment petits pour empêcher les interactions juxtacrine et encore permettre l’échange de facteurs sécrétés à des concentrations élevées localisées. De cette manière, ce système conserve la cinétique de la production et l’épuisement des facteurs paracrines.

Protocole

Le protocole suit les directives du Conseil réglementaire institutionnel de l’Université Indiana.

1. préparation de la cellule

1. Isolement et culture des cellules mésothéliales primaires humaines
   1. Toutes les isolat primaires mesothelial cellules humaines (HPMCs) d’épiploon humaine telle que décrite précédemment^17,18 et de les cultiver en milieu [de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) contenant du sérum de veau fœtal 10 %, 1 % de la croissance pénicilline-streptomycine, 1 % des acides aminés non essentiels et les vitamines 1 %] à 37 ° C et 5 % de CO₂.
      Remarque : Les HPMCs sont généralement cultivés au confluent de 100 % (Figure 1 a).
2. Conditions de croissance des cellules de cancer de l’ovaire
   1. La croissance de cellules de cancer de l’ovaire HeyA8 dans un milieu complet de croissance à 37 ° C et 5 % de CO₂.
      Remarque : Utilisation HeyA8 cellules cultivées à environ 80 % de confluence (Figure 1 b).

2. Culture cellulaire

1. Set-up proximale de la culture
   1. Utilisation Transwell insère pour plaques 6 puits avec une membrane de 10 μm d’épaisseur tissu-culture-traitée en polycarbonate avec 0,4 μm pores (10⁸ pores/cm²) et une zone de croissance de² cm de 4,67. Le cas échéant, optimiser pour insertion de différentes tailles en réduisant le nombre de cellules ensemencées selon la surface de croissance. Milieu de culture complet chaud, la trypsine et solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C avant utilisation.
2. Préparer les inserts
   1. Pour amorcer les cellules HeyA8 sur la surface inférieure de la membrane de l’insert, retirez l’insert de son emballage à l’aide de la pince stérile et placez-le en position inversée dans une boîte de Petri stérile de 15 cm.
   2. Utilisez un plat de 15 cm, car il a la profondeur pour accueillir le foyer inversé, ou remplacer par n’importe quel récipient stérile. Selon l’expérience, placer le nombre requis d’insertions dans le plat de 15 cm.
   3. Étiqueter les trois contrôles et trois conditions expérimentales en conséquence avec un marqueur sur le bord des inserts.
3. Préparer les cellules cancéreuses
   1. Trypsinize les HeyA8 les cellules cultivées à confluence de 80 % dans un ballon jaugé de 25 cm² (~ 2 x 10⁶ cellules), ajouter 1 mL de la trypsine (0,25 %) pour 40 à 60 s et neutraliser la trypsine avec 6 mL de milieu de culture complet.
   2. Centrifuger les cellules à 500 g à la température ambiante (RT) pendant 3 min, jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu de culture complet. Compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan.
4. Ensemencer les cellules cancéreuses
   1. Suspendre 100 000 cellules/mL de cellules vivantes de HeyA8 dans le milieu de culture complet. Soigneusement les semences 80 000 cellules HeyA8 suspendus en 800 μL de milieu de culture complet sur le fond de l’insert (qui est maintenant vers le haut, car il est inversé).
   2. Les semences des cellules pour former une forme de dôme-comme si les cellules restent sur l’insert (Figure 1). Démarrez à partir du centre de la membrane et se déplacer vers l’extérieur en cercles concentriques tandis que lentement pipetage. Éviter d’aller plus de 3 mm du bord afin d’éviter toute effusion du milieu.
      Remarque : Le nombre de cellules ensemencées dépendra du taux de croissance des cellules et la durée de l’expérience. Le nombre de cellules HeyA8 ensemencées pour cette culture proximale ont été optimisé et les cellules seront confluente de 80 à 90 % à la fin de la troisième journée.
5. Fixation des cellules du cancer
   1. Couvrir le plat de 15 cm et déplacer délicatement le plat contenant les inserts à l’incubateur à CO₂ . On critique ne pas de perturber la goutte de milieu et cellules sur l’insert à cette étape. Laissez les cellules à 37 ° C pendant 4 h permettre les cellules cancéreuses attacher à l’insert.
6. Préparer les cellules mésothéliales
   1. Après environ 4 h, trypsinize les HPMCs cultivés au confluent de 100 % dans une fiole de² 75 cm (~ 4 x 10⁶ cellules) avec 2 mL de trypsine (0,25 %) pendant 1 à 2 min et neutraliser la trypsine avec 12 mL de milieu de culture complet.
   2. Centrifuger les cellules à 500 x g RT pendant 3 min, resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture complet et compter les cellules vivantes à l’aide de la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan.
7. Ensemencement des cellules mésothéliales
   1. Suspendre les 300 000 cellules/mL d’HPMCs direct dans le milieu de culture complet. Ajouter 2,5 mL de milieu de culture complet frais dans chaque puits d’une plaque de 6 puits. Soigneusement mettre le plat de 15 cm contenant les inserts sur la hotte de la prévention des risques biotechnologiques. À l’aide d’une pince stérile, retourner l’insert et placez-le dans le puits de la plaque 6 puits afin qu’elle soit verticale, avec les cellules de HeyA8 attachés à la surface inférieure, immergée dans le milieu de culture complet (Figure 1).
   2. HPMCs graine 450 000 suspendus dans 1,5 mL de milieu de croissance à l’intérieur des inserts avec les cellules de HeyA8 attachés à la surface vers le fond du puits (Figure 1) ou à plaquettes sans les cellules HeyA8 pour les contrôles HPMC. Ajouter 1,5 mL de milieu de culture sans cellules aux contrôles HeyA8.
8. De plus en plus la culture proximale
   1. Laissez la culture proximale pousser dans l’incubateur à CO₂ à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 72 h. Si nécessaire, le support peut être réapprovisionné comme suit.
      1. Pour l’intérieur de l’insert, retirer 750 µL et ajouter 750 µL de milieu de culture complet frais.
      2. Pour l’extérieur de l’insert (la plaque 6 puits), prélever 1 mL et ajouter 1 mL de milieu de culture complet frais. Le mL 1 a été choisie pour la commodité de changer le support en une seule étape. Si vous le souhaitez, 1,25 mL peut être enlevé et remplacé à la place.
9. Le prélèvement de cellules
   1. Recueillir les cellules après 72 h de culture proximale. Faites attention à cette étape afin d’éviter la contamination croisée des cellules HeyA8 et HPMCs. Trypsinize les cellules, centrifuger eux et lyser le culot au lieu de lyser les cellules sur la membrane afin d’éviter une contamination croisée.
10. Trypsinisation des cellules
    1. Rincer les deux côtés de l’insert avec du PBS 1 x.
    2. Les inserts de transfert d’un nouveau puits et ajouter la trypsine. Ajouter 0,5 mL de trypsine à l’intérieur de l’insert et ajouter 2 mL de trypsine à la plaque de 6 puits à trypsinize les cellules cancéreuses, attachés à la face inférieure de l’insert. Incuber la plaque pendant 2 min à 37 ° C.
11. Neutralisation de la trypsine
    1. Ajouter 1 mL de milieu de culture complet à l’intérieur de l’insert pour neutraliser la trypsine, pipette de haut en bas, puis prenez les cellules et transférez-les sur un tube de prélèvement étiquetées. Ajouter 2 mL de milieu de culture complet pour une neutralisation complète supplémentaire. Il faut ne pas de percer la membrane lors de pipetage pour éviter une contamination croisée des cellules.
    2. Afin de recueillir les cellules sur le fond de l’insert, distribuer la trypsine de 2 mL qui a été ajoutée à l’étape 12,2 sur la surface inférieure 2 – 3 x afin que les cellules entrent dans la partie inférieure de la plaque 6 puits. Neutraliser la trypsine sur le fond de la plaque avec 6 mL de milieu de croissance et transférer le contenu de la plaque dans un tube de prélèvement étiquetées.
12. Collecte et lyser les cellules
    1. Centrifuger les cellules à 500 x g pendant 3 min et aspirer les médias. Resuspendre et lyser les granules cellulaires avec 0,7 mL de réactif de lyse phénol guanidine thiocyanate-base et pour l’extraction de l’ARN. Isoler l’ARN à l’aide de n’importe quel kit adapté.

3. quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction

Remarque : Les étapes suivantes décrivent une quantitative PCR en temps réel (qPCR) pour étudier les changements d’expressions de gène à la suite de la culture proximale.

1. Préparer les ADNc provenant des échantillons d’ARN pour qPCR. Utiliser n’importe quel convenable de la transcriptase inverse avec un tampon correspondant et amorces aléatoires afin d’assurer la transcription inverse de tous les ARNm (voir Table des matières).
2. Évaluer les changements dans les niveaux d’expression de mRNA de la fibronectine (FN1) et de la E-cadhérine (CDH1) et transformer le facteur de croissance bêta 1 (TGFβ1) par qPCR avec glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) comme un contrôle interne. Il est possible d’utiliser normalisé essais d’expression de gène disponibles dans le commerce (voir Table des matières) ou de concevoir des amorces.
3. Comparer les HeyA8 de cellules cultivées en proximal avec HPMCs avec les commandes HeyA8 et les HPMCs cultivés en proximal avec les contrôles HPMC.

Résultats

Des cellules de cancer de l’ovaire métastases rencontrent des cellules mésothéliales sur le site de métastases dans la cavité péritonéale¹⁹. Interactions paracrines et juxtacrine productives avec l’aide de cellules mésothéliales en induisant des réponses adaptatives dans les cellules de cancer de l’ovaire, qui permettent des métastases réussi^17,18,20...

Discussion

Comprendre le mécanisme de paracrine et juxtacrine de signalisation entre les cellules est essentielle pour développer une meilleure connaissance du tissu normal homéostasie et maladie conditions^7,8. Plupart paracrine signalisation études sont menées en recueillant conditionné milieu à partir d’un type de cellule et l’utiliser pour traiter l’autre type de cellule. Cette méthode a un avantage dans sa simplicité inhérente. Cependant, ce ne pas exact...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert	Corning (Costar)	3412	• 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation
6 well plate	Corning (Falcon)	353046	Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish	Corning (Falcon)	353025	Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI
MEM Nonessential amino acids	Corning (Cellgro)	25-025-CI
MEM Vitamins	Corning (Cellgro)	25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Pipets			Any make is fine
CO2 Incubator			Any make is fine
Biosafety level II cabinet			Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit	Qiagen	217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells	Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody	R&D Systems	MAB1835-100