Un método de cultura Proximal para el estudio de señalización paracrina entre células

Resumen

Paracrina y yuxtacrina interacciones celulares juegan un papel importante en muchos procesos biológicos, incluyendo la progresión del tumor, respuesta inmune, angiogénesis y desarrollo. Aquí, un método de cultura proximal se utiliza para el estudio de señalización paracrina donde se mantienen las concentraciones localizadas de los factores secretados evitando contacto celular directo.

Resumen

Interacciones intercelulares juegan un papel importante en muchos procesos biológicos, incluyendo la progresión del tumor, respuesta inmune, angiogénesis y desarrollo. Paracrina o señalización yuxtacrina interviene en tales interacciones. El uso de un medio condicionado y cocultivo estudios son los métodos más comunes para discriminar entre estos dos tipos de interacciones. Sin embargo, el efecto de las altas concentraciones localizadas de factores secretados en el microambiente durante las interacciones paracrinas no es exactamente recapitulado por medio condicionado y, por lo tanto, puede conducir a conclusiones imprecisas. Para superar este problema, hemos ideado un método de cultivo próximo para estudiar la señalización paracrina. Los dos tipos celulares son cultivados en cualquier superficie de una membrana de policarbonato de espesor μm 10 con 0,4 μm poros. Los poros permiten el intercambio de factores secretados y, al mismo tiempo, inhiben la señalización yuxtacrina. Las células pueden ser recogidas y lisis en el criterio de valoración para determinar los efectos de la señalización paracrina. Además de permitir para gradientes de concentración localizados de factores secretados, este método es sensible a los experimentos que implican largos períodos de la cultura, así como el uso de inhibidores. Mientras que utilizamos este método para estudiar las interacciones entre las células de cáncer de ovario y las células mesoteliales que se encuentran en el sitio de metástasis, puede ser adaptado a cualquier dos tipos de células adherentes a los investigadores estudiar paracrina señalización en varios campos, incluyendo el desarrollo, Inmunología y microambiente tumoral.

Introducción

El papel de productivas interacciones recíprocas entre células cancerosas y el microambiente tumoral en la progresión tumoral ha sido bien establecido y se ha convertido en un importante foco de investigación en cáncer biología¹. Casos similares de señalización bidireccional son cruciales durante la cicatrización, respuesta inmune, angiogénesis, nichos de células madre y en desarrollo^{2,3,4,5,6 , 7 , 8}. un tema común en todos estos procesos biológicos es que las células responden de diversas maneras a las señales extracelulares de su microambiente que determinan el destino celular, fisiología de tejidos y progresión de la enfermedad. Por lo tanto, el enfoque se ha convertido cada vez más hacia el desarrollo de una mejor comprensión de los mecanismos implicados en las comunicaciones de la célula. La mayoría de estas interacciones implican paracrina o yuxtacrina señalización entre las células. Señalización paracrina consiste en la secreción de factores específicos de la señalización por una célula que se perciben por los receptores correspondientes en otra célula en las proximidades, desencadenando una respuesta en él^9,10, mientras que yuxtacrina señalización requiere contacto directo entre los componentes celulares de las dos células implicadas^11,12.

Dicha señalización es un componente vital en la homeostasis del tejido, así como en el microambiente del tumor. Las células de cáncer se benefician de los factores paracrinos y yuxtacrina de células en el estroma del tumor, incluyendo fibroblastos asociada al cáncer (CAFs), las células inmunes y adipocitos^13,14,15,16. Paracrina de señalización puede estar mediado por citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, etc., mientras que la señalización yuxtacrina implica yuxtapuestas ligandos y receptores como en señalización de Notch, o interacción entre las integrinas y sus respectivas proteínas de matriz extracelular. Hemos demostrado la importancia de las interacciones recíprocas entre las células de cáncer de ovario y CAF en progresión y metástasis de tumor¹⁴. Del mismo modo, las interacciones de extenderse por metástasis de las células de cáncer de ovario con las células mesoteliales que cubren el sitio de la metástasis regulan microRNAs claves y factores de transcripción en las células de cáncer que promueven la colonización metastásica^{17, 18}.

Mayoría de los estudios sobre la señalización paracrina implica el uso de un medio condicionado de tipo de una célula para tratar el segundo tipo de célula con. Mientras que este enfoque ha sido ampliamente utilizado, efectivamente reproduce los niveles de alta concentración localizados del factor secretado en el microambiente de la célula receptora. También es incapaz de reproducir la cinética del flujo continuo del factor secretado producido por una célula y recibido por la célula vecina. Paracrina de señalización es eficaz en distancias cortas como los factores secretados en las concentraciones requeridas sólo en las proximidades de la célula de origen y tienden a difundir y diluir a medida que aumenta la distancia. Esta alta concentración localizada de la factor secretado es esencial para desencadenar una respuesta en la célula del receptor. Por otra parte, la respuesta en las células del receptoras también es dependiente en el equilibrio de los factores recién secretados y su agotamiento continuo a través de degradación, vinculante y la internalización en las células del receptoras y difusión de la célula de origen. Medio condicionado puede ser concentrado para tener en cuenta las altas concentraciones localizadas presentes en el microambiente, pero que no pueden replicar con precisión las concentraciones exactas. Por otra parte, no puede imitar la cinética natural de la producción y el agotamiento del factor implicado. Para mayor precisión replicar señalización paracrina y separarlo de los mecanismos de señalización yuxtacrina, hemos ideado un método de cultura próxima novela, que implica el crecimiento de los dos tipos celulares en cualquier superficie de una membrana porosa. Los poros son lo suficientemente pequeños para prevenir interacciones yuxtacrina y todavía permiten el intercambio de factores secretados a altas concentraciones localizadas. De esta manera, este sistema conserva la cinética de la producción y el agotamiento de los factores paracrinos.

Protocolo

El protocolo sigue las pautas de la institucional Consejo Regulador de la Universidad de Indiana.

1. preparación de la célula

1. Aislamiento y cultivo de células mesothelial primarias humanas
   1. Aislamiento primarias mesothelial células humanas (HPMCs) del epiplón humano como se ha descrito anteriormente^17,18 y cultivarlas en completan medio [modificado Eagle de Dulbecco Medium (DMEM) que contiene 10% suero fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina, los de aminoácidos no esenciales 1% y 1% vitaminas] en 37 ° C y 5% CO₂.
      Nota: El HPMCs típicamente crecen hasta confluencia 100% (figura 1A).
2. Condiciones de crecimiento de las células de cáncer de ovario
   1. Crecen las células de cáncer de ovario de HeyA8 en medio de mas crecimiento a 37 ° C y 5% CO₂.
      Nota: Uso HeyA8 células cultivadas a cerca de 80% de confluencia (figura 1B).

2. cultivo celular

1. Configuración de la cultura proximal
   1. Uso Transwell insertos para placas de 6 pocillos con una membrana de policarbonato tratado con cultura de tejido μm de espesor 10 con 0,4 μm poros (10⁸ poros/cm²) y un área de crecimiento de² cm de 4,67. Si es necesario, optimizar para insertar diferentes tamaños por el escalamiento del número de células sembradas según la superficie de crecimiento. Medio de cultivo completo caliente, tripsina y solución salina con tampón fosfato (PBS) a 37 ° C antes de usar.
2. Preparación de los rellenos
   1. Para las células HeyA8 en la parte inferior de la membrana del parte movible de la semilla, retire el inserto del envase utilizando pinzas estériles y colóquela invertida en una placa de cultivo estéril 15 cm.
   2. Use un plato de 15 cm, ya que tiene la profundidad para acomodar la inserción invertida o sustituirlo con cualquier contenedor estéril apropiado. Según el experimento, colocar el número de inserciones en el plato de 15 cm.
   3. Etiquetar los tres controles y tres condiciones experimentales por consiguiente con un marcador en el borde de los insertos.
3. Preparación de las células cancerosas
   1. Trypsinize las células HeyA8 cultivadas en confluencia del 80% en un matraz de² de 25 cm (~ 2 x 10⁶ células), agregar 1 mL de tripsina (0,25%) para 40 a 60 s y neutralizar la tripsina con 6 mL de medio de cultivo completo.
   2. Centrifugar las células a 500 x g a temperatura ambiente (RT) por 3 min, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 5 mL de medio de cultivo completo. Contar las células vivas utilizando el método de exclusión de colorante azul de trypan.
4. Siembra de las células cancerosas
   1. Suspensión 100.000 células/mL de células vivas de la HeyA8 en medio de cultivo completo. Cuidadosamente semillas 80.000 HeyA8 las células suspendidas en 800 μL de medio de cultivo completo en la parte inferior del parte movible (que ahora es hacia arriba, ya que se invierte).
   2. Semilla de las células para formar una bóveda-como así las células permanecen en el inserto (figura 1). Desde el centro de la membrana y mover hacia afuera en círculos concéntricos mientras lentamente el pipeteo. Evite pasar más de 3 mm desde el borde para evitar cualquier derrame del medio.
      Nota: El número de células sembradas dependerá de la tasa de crecimiento de las células y la duración del experimento. El número de células de HeyA8 sembrado para esta cultura proximal fueron optimizado y las células será confluente de 80-90% al final del tercer día.
5. Accesorio de la célula de cáncer
   1. Cubrir el plato de 15 cm y mueva con cuidado el plato que contenga los insertos a la incubadora de CO₂ . Es fundamental no perturbar la gota del medio y las células de la cubierta en este paso. Salir de las células a 37 ° C durante 4 horas permitir que las células cancerosas sujetar a la pieza de inserción.
6. Preparación de las células mesoteliales
   1. Después de alrededor de 4 h, trypsinize HPMCs crecidos en confluencia 100% en un matraz de² 75 cm (~ 4 x 10⁶ células) con 2 mL de tripsina (0,25%) durante 1-2 min y neutralizar la tripsina con 12 mL de medio de cultivo completo.
   2. Centrifugar las células a 500 x g a temperatura ambiente durante 3 min., Resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo completo y contar las células vivas utilizando el método de exclusión de colorante azul de trypan.
7. Siembra de las células mesoteliales
   1. Suspender 300.000 células/mL de HPMCs vivo en medio de cultivo completo. Añadir 2,5 mL de medio fresco crecimiento completo a cada pocillo de una placa de 6 pozos. Llevar con cuidado el plato de 15 cm que contenga los insertos a la campana de bioseguridad. Utilizando pinzas estériles, tapa el relleno y colocar en el pozo de la placa de 6 pozos para que sea vertical, con las células de HeyA8 Unidas a la superficie más baja en el medio de cultivo completo (figura 1).
   2. Semilla 450.000 HPMCs suspendidos en 1,5 mL de medio de cultivo en el interior de los rellenos con las células de HeyA8 fijadas a la superficie hacia el fondo del pozo (figura 1) o con insertos sin las células HeyA8 de los controles de la HPMC. Añadir 1,5 mL de medio de cultivo sin las células a los controles de HeyA8.
8. Creciente cultura proximal
   1. Dejar la cultura proximal crecer en el CO₂ incubadora a 37 ° C y 5% CO₂ para 72 h. Si es necesario, el medio puede ser reemplazado como sigue.
      1. Para el interior del inserto, 750 μl de quitar y añadir 750 μl de medio de cultivo completo fresco.
      2. Para el exterior de la estufa (placa de 6 pozos), sacar 1 mL y añadir 1 mL de medio completo fresco. 1 mL fue elegido para la conveniencia de cambiar el medio en un solo paso. Si lo desea, 1,25 mL puede ser quitado y substituido en su lugar.
9. Recolección de las células
   1. Recoger las células después de 72 h de la próxima cultura. Tenga especial cuidado en este paso para evitar la contaminación cruzada de las células HeyA8 y HPMCs. Trypsinize las células de centrífuga les y lyse la pastilla en vez de lisis de las células en la membrana para evitar una contaminación cruzada.
10. Trypsinizing las células
    1. Enjuague ambos lados de la plaquita con PBS 1 x.
    2. Los insertos de la transferencia a un nuevo pozo y añadir tripsina. Agregar 0,5 mL de tripsina en el interior del inserto y agregar 2 mL de tripsina a la placa de 6 pozos para trypsinize las células cancerosas a la parte inferior del parte movible. Incubar la placa por 2 min a 37 ° C.
11. Neutralización de la tripsina
    1. Añadir 1 mL de medio de cultivo completo en el interior del relleno para neutralizar la tripsina, pipeta hacia arriba y hacia abajo y luego tomar las células y transferirlos a un tubo de recogida etiquetados. Agregar un adicional 2 mL de medio de cultivo completo para una neutralización completa. Debe tener cuidado de no perforar la membrana mientras que pipetear para evitar una contaminación cruzada de las células.
    2. Para recoger las células en la parte inferior del parte movible, pipetear la tripsina de 2 mL que se agregó en el paso 12.2 sobre la superficie inferior 2 – 3 x para que las células caigan en la parte inferior de la placa de 6 pozos. Neutralizar la tripsina en la parte inferior de la placa con 6 mL de medio de crecimiento y transferir el contenido de la placa a un tubo de recogida etiquetados.
12. Recogida y lisis de las células
    1. Centrifugar las células a 500 x g durante 3 min y aspirar los medios de comunicación. Suspender y lyse los pellets de células con 0,7 mL de fenol y guanidina-tiocianato-basada en el reactivo de lisis para la extracción de RNA. Aislar el RNA usando cualquier kit adecuado.

3. cuantitativa de polimerasa en tiempo real la reacción en cadena

Nota: Los pasos siguientes describen una reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (qPCR) para estudiar los cambios de expresiones de genes como resultado de la cultura proximal.

1. Preparar el cDNA de las muestras de RNA para qPCR. Use cualquier conveniente de la transcriptasa inversa con un tampón correspondiente y cartillas al azar para asegurar la transcripción reversa del mRNA todos (véase Tabla de materiales).
2. Evaluar los cambios en los niveles de expresión de mRNA de fibronectina (FN1) y E-cadherina (CDH1) y transformar el factor de crecimiento beta 1 (TGFβ1) por qPCR con gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno. Es posible utilizar estandarizadas ensayos de expresión genética disponible en el mercado (véase Tabla de materiales) o para el diseño de primers.
3. Comparar las células HeyA8 cultivadas en cultura proximal con HPMCs con los controles HeyA8 y HPMCs crecidos en cultura proximal con los controles de la HPMC.

Resultados

Extenderse por metástasis de las células de cáncer de ovario encuentran células mesoteliales en el sitio de la metástasis en la cavidad peritoneal¹⁹. Interacciones paracrinas y yuxtacrina productivas con la ayuda de células mesoteliales en la inducción de respuestas adaptativas en las células de cáncer de ovario, que permiten la metástasis exitosa^17,18,20,

Discusión

Entender el mecanismo de paracrina, yuxtacrina señalización entre las células es esencial para el desarrollo de un mejor conocimiento del tejido normal homeostasis y enfermedad condiciones^7,8. Paracrina la mayoría señalización estudios se llevan a cabo recogiendo acondicionado medio de una célula tipo y usarlo para tratar a otro tipo de célula. Este método tiene una ventaja en su simplicidad inherente. Sin embargo, no precisa recapitular las concentracio...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert	Corning (Costar)	3412	• 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation
6 well plate	Corning (Falcon)	353046	Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish	Corning (Falcon)	353025	Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI
MEM Nonessential amino acids	Corning (Cellgro)	25-025-CI
MEM Vitamins	Corning (Cellgro)	25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Pipets			Any make is fine
CO2 Incubator			Any make is fine
Biosafety level II cabinet			Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit	Qiagen	217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells	Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody	R&D Systems	MAB1835-100