Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Riepilogo

Interazioni cellulari paracrine e juxtacrine gioca un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Qui, un metodo di coltura prossimale viene utilizzato per studiare segnalazione paracrina dove le concentrazioni localizzate dei fattori secreti sono mantenute, evitando il diretto contatto cellulare.

Abstract

Le interazioni intercellulari svolgono un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Paracrino o juxtacrine segnalazione media tali interazioni. L'uso di un medium condizionato e coculture studi sono i metodi più comuni di discriminare tra questi due tipi di interazioni. Tuttavia, l'effetto di localizzate elevate concentrazioni di fattori secreti nel microambiente durante le interazioni paracrine con precisione non è ricapitolata dal medium condizionato e, così, può portare a conclusioni imprecise. Per ovviare a questo problema, abbiamo messo a punto un metodo di cultura prossimale per studiare segnalazione paracrina. I due tipi cellulari sono coltivati su entrambe le superfici di una membrana di policarbonato spessore µm 10 con 0,4 µm pori. I pori consentono lo scambio di fattori secreti e, allo stesso tempo, inibiscono la segnalazione di juxtacrine. Le cellule possono essere raccolte e lisate sull'endpoint per determinare gli effetti della segnalazione di paracrine. Oltre a consentire per gradienti di concentrazione localizzate di fattori secreti, questo metodo è favorevole agli esperimenti che coinvolgono periodi prolungati di cultura, così come l'uso di inibitori. Mentre usiamo questo metodo per studiare le interazioni tra cellule tumorali ovariche e le cellule mesoteliali che incontrano nel sito di metastasi, può essere adattato a qualsiasi due tipi di cellule aderenti per i ricercatori a studiare paracrine segnalazione in vari campi, compreso lo sviluppo, immunologia e microambiente tumorale.

Introduzione

Il ruolo di produttivi interazioni reciproche tra cellule tumorali e del microambiente tumorale nella progressione del tumore è stata ben stabilito ed è diventato degli obiettivi principali della ricerca nel cancro biologia¹. Casi simili di segnalazione bidirezionale sono cruciali durante la guarigione delle ferite, le risposte immunitarie, angiogenesi, nicchie di cellule staminali e durante lo sviluppo^{2,3,4,5,6 , 7 , 8}. un tema comune a tutti questi processi biologici è che le cellule rispondono in vari modi a segnali extracellulari da loro microambiente che determinano il destino delle cellule, la fisiologia del tessuto e progressione della malattia. Pertanto, la messa a fuoco, diventato sempre più verso lo sviluppo di una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti in tali comunicazioni cellula-cellula. Una maggioranza di tali interazioni coinvolgono paracrine o juxtacrine segnalazione tra le cellule. Segnalazione di paracrine coinvolge la secrezione di fattori di segnalazione specifici da una cella che sono percepiti da recettori corrispondenti su un'altra cella nelle vicinanze, innescando una risposta in esso^9,10, mentre juxtacrine segnalazione richiede un contatto diretto tra componenti cellulari delle due cellule coinvolte^11,12.

Tale segnalazione è una componente fondamentale nell'omeostasi del tessuto, così come nel microambiente tumorale. Le cellule tumorali beneficiano di fattori paracrini e juxtacrine dalle cellule nello stroma del tumore, compreso cancro-collegati di fibroblasti (CAFs), cellule immunitarie e adipociti^13,14,15,16. Il paracrine segnalazione può essere mediata da citochine, chemochine, fattori di crescita, ecc., mentre la segnalazione di juxtacrine coinvolge giustapposti ligandi e recettori come tacca di segnalazione, o interazioni tra integrine e delle loro rispettive proteine della matrice extracellulare. Abbiamo dimostrato l'importanza delle interazioni reciproche tra cellule tumorali ovariche e CAFs, progressione e la metastasi del tumore¹⁴. Allo stesso modo, le interazioni delle cellule di carcinoma ovarico metastatico con le cellule mesoteliali che copre il sito delle metastasi regolano chiavi microRNA e fattori di trascrizione nelle cellule tumorali che promuovono la colonizzazione metastatica^{17, 18}.

Maggior parte degli studi sulla segnalazione di paracrine implicano l'uso di un raccolto da tipo una cella per trattare il secondo tipo di cella con il medium condizionato. Mentre questo approccio è stato ampiamente utilizzato, non vengono replicate in modo efficace i livelli di alta concentrazione localizzati del fattore secernuto nel microambiente della cellula ricevente. Inoltre non riesce a riprodurre la cinetica del flusso continuo del fattore secreto prodotto da una cellula e ricevuto dalla cella vicina. Paracrino segnalazione è efficace su brevi distanze in quanto i fattori secreti sono alle concentrazioni necessarie solo in prossimità della cella di origine e tendono a diffondere e diluire fuori come la distanza aumenta. Questa alta concentrazione localizzata di fattore secernuto è essenziale per innescare una reazione nella cella del ricevitore. Inoltre, la risposta nelle cellule del destinatario è anche dipenda l'equilibrio dei fattori appena secrete e loro svuotamento continuo attraverso la degradazione, l'associazione e interiorizzazione nella cellule recettive e diffusione dalla cella di origine. Il medium condizionato può essere concentrato sul conto per le più alte concentrazioni localizzate presenti nel microambiente, ma che non può replicare con precisione l'esatta concentrazione. Inoltre, esso non può simulare la cinetica naturale della produzione e lo svuotamento del fattore coinvolto. Per maggiore precisione replicare segnalazione paracrina e separarla da juxtacrine meccanismi di segnalazione, abbiamo messo a punto un metodo novello cultura prossimale, che coinvolge coltivare due tipi cellulari su entrambe le superfici di una membrana porosa. I pori sono abbastanza piccoli per evitare interazioni juxtacrine e ancora permettere lo scambio di fattori secreti alle alte concentrazioni localizzate. In questo modo, questo sistema mantiene la cinetica di produzione e lo svuotamento dei fattori paracrini.

Protocollo

Il protocollo segue le linee guida del Consiglio normativo istituzionale dell'Università Indiana.

1. cella preparazione

1. Isolamento e coltura di cellule mesoteliali primarie umane
   1. Cellule mesoteliali primarie umane isolate (HPMCs) dall'omento umano come descritto in precedenza^17,18 e farle crescere in completano crescita medio [dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino, 1% penicillina-streptomicina, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% vitamine] a 37 ° C e 5% CO₂.
      Nota: I HPMCs sono in genere cresciuta fino a 100% confluenza (Figura 1A).
2. Condizioni di crescita delle cellule tumorali ovariche
   1. Crescere le cellule tumorali ovariche HeyA8 nel mezzo di crescita completa a 37 ° C e 5% CO₂.
      Nota: Uso HeyA8 cellule coltivate a circa 80% confluenza (Figura 1B).

2. coltura cellulare

1. Set-up cultura prossimale
   1. Uso Transwell inserti per piastre da 6 pozzetti con una membrana di 10 μm di spessore del tessuto-cultura-trattati in policarbonato con 0,4 μm pori (10⁸ pori/cm²) e una zona di crescita di 4,67 cm² . Se necessario, ottimizzare per diverse misure ridimensionando il numero delle cellule seminate secondo l'area di superficie di crescita. Medium di crescita completa calda, tripsina e tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C prima dell'uso.
2. Preparare gli inserti
   1. Per le cellule di HeyA8 sulla superficie inferiore della membrana dell'inserto del seme, rimuovere l'inserto dalla confezione usando pinze sterili e posizionarlo invertito in una piastra di coltura sterile cm 15.
   2. Utilizzare un piatto di 15 cm, come ha la profondità di ospitare l'inserto invertito, o sostituirlo con qualsiasi contenitore sterile appropriato. A seconda dell'esperimento, è necessario inserire il numero desiderato di inserti nel piatto 15 cm.
   3. Etichetta di conseguenza i tre controlli e tre condizioni sperimentali con un pennarello sul bordo degli inserti.
3. Preparare le cellule tumorali
   1. Tripsinizzano le cellule di HeyA8 cresciute alla confluenza di 80% in un pallone da² di 25 cm (~ 2 x 10⁶ cellule), aggiungere 1 mL di tripsina (0,25%) per 40-60 s e neutralizzare la tripsina con 6 mL di medium di crescita completa.
   2. Centrifugare le cellule a 500 x g a temperatura ambiente (TA) per 3 min, eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di crescita completa. Contare le celle dal vivo utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di trypan.
4. Semina le cellule tumorali
   1. Sospendere 100.000 cellule/mL di cellule vive HeyA8 nel mezzo di crescita completa. Attentamente seme 80.000 HeyA8 cellule sospese in 800 μL di medium di crescita completa sul fondo dell'inserto (che è ora rivolto verso l'alto, poiché esso è invertito).
   2. Seme le cellule per formare una forma a cupola, così le cellule rimangono sull'inserto (Figura 1). Iniziare dal centro della membrana e spostare verso l'esterno in cerchi concentrici, mentre lentamente il pipettaggio. Evitare di andare più di 3 mm dal bordo per impedire qualsiasi fuoriuscita del mezzo.
      Nota: Il numero delle cellule seminate dipenderà il tasso di crescita delle cellule e la durata dell'esperimento. Il numero di cellule HeyA8 seminato per questa cultura prossimale sono stato ottimizzato e le cellule sarà 80 – 90% confluenti alla fine del terzo giorno.
5. Collegamento delle cellule di cancro
   1. Coprire il piatto di 15cm e spostare con cautela il piatto contenente gli inserti per l'incubatrice di CO₂ . È fondamentale per non disturbare la goccia di medium e cellule sull'inserto in questa fase. Lasciare le cellule a 37 ° C per 4 h per consentire le cellule tumorali di allegare all'inserto.
6. Preparare le cellule mesoteliali
   1. Dopo circa 4 h, tripsinizzano la HPMCs cresciuta alla confluenza del 100% in un pallone da² cm 75 (~ 4 x 10⁶ cellule) con 2 mL di tripsina (0,25%) per 1 – 2 min e neutralizzare la tripsina con 12 mL di medium di crescita completa.
   2. Centrifugare le cellule a 500 x g per 3 min a RT, risospendere il pellet cellulare in 10 mL di medium di crescita completa e contare le celle dal vivo utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di trypan.
7. Semina le cellule mesoteliali
   1. Sospendere 300.000 cellule/mL di HPMCs live nel mezzo di crescita completa. Aggiungere 2,5 mL di mezzi freschi di sviluppo completo in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Attentamente e portare il piatto di 15cm contenente gli inserti fuori alla cappa di biosicurezza. Utilizzando pinze sterili, capovolgere l'inserto e posizionarlo nel pozzetto della piastra 6 pozzetti in modo che è in posizione verticale, con le cellule di HeyA8 attaccate alla superficie inferiore immersa nel mezzo di crescita completa (Figura 1).
   2. HPMCs seme 450.000 sospeso in 1,5 mL di terreno di crescita all'interno degli inserti con le cellule di HeyA8 attaccate alla superficie rivolta verso la parte inferiore del pozzo (Figura 1) o agli inserti senza eventuali cellule di HeyA8 per i controlli HPMC. Aggiungere 1,5 mL di terreno di coltura senza cellule ai controlli HeyA8.
8. Cresce la cultura prossimale
   1. Lasciate che la cultura prossimale crescere nell'incubatore CO₂ a 37 ° C e 5% CO₂ per 72 h. Se necessario, le medie possono essere ricostituite come segue.
      1. Per l'interno dell'inserto, rimuovere µ l 750 e 750 µ l di terreno di coltura fresco completo.
      2. Per l'esterno dell'inserto (la piastra 6 pozzetti), prelevare 1 mL e aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco completo. 1 mL è stato scelto per la comodità di cambiare il mezzo in un unico passaggio. Se lo si desidera, 1,25 mL può essere rimosso e sostituito invece.
9. Raccogliendo le cellule
   1. Raccogliere le cellule dopo 72 h della cultura prossimale. Faccia particolare attenzione in questa fase per evitare contaminazioni delle cellule HeyA8 e HPMCs. Trypsinize le cellule, centrifugare li e lisare il pellet invece di fare l'elettrolisi le cellule sulla membrana per evitare una contaminazione incrociata.
10. Trypsinizing le cellule
    1. Risciacquare entrambi i lati dell'inserto con PBS 1X.
    2. Trasferire gli inserti per un nuovo pozzo e aggiungere tripsina. Aggiungere 0,5 mL di tripsina all'interno dell'inserto e aggiungere 2 mL di tripsina alla piastra 6 pozzetti per tripsinizzano le cellule tumorali fissate alla superficie inferiore dell'inserto. Incubare la piastra per 2 min a 37 ° C.
11. Neutralizzare la tripsina
    1. Aggiungere 1 mL di medium di crescita completa all'interno dell'inserto per neutralizzare la tripsina, pipettare su e giù e poi prendere le cellule e trasferirli in una provetta di raccolta contrassegnati. Aggiungere un ulteriore 2 mL di medium di crescita completa per una completa neutralizzazione. Dovrebbe prestare attenzione a non forare la membrana durante il pipettaggio per evitare una contaminazione incrociata delle cellule.
    2. Per raccogliere le cellule sul fondo dell'inserto, dispensare la tripsina 2 mL che è stato aggiunto nel passaggio 12.2 sulla superficie inferiore 2 – 3 x affinché le cellule cadono nella parte inferiore della piastra 6 pozzetti. Neutralizzare la tripsina sul fondo del piatto con 6 mL di terreno di coltura e trasferire il contenuto della piastra in una provetta di raccolta contrassegnati.
12. Raccolta e la lisi delle cellule
    1. Centrifugare le cellule a 500 x g per 3 min e aspirare i media. Risospendere e lisare il pellet cellulare con 0,7 mL di fenolo e guanidina tiocianato-basati - reagente di lisi per l'estrazione di RNA. Isolare il RNA usando qualsiasi kit adatto.

3. quantitativa Real-Time Polymerase Chain Reaction

Nota: I passaggi seguenti descrivono una reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) per studiare i cambiamenti di espressioni del gene come risultato la cultura prossimale.

1. Preparare cDNA da campioni di RNA per qPCR. Utilizzare qualsiasi adatto della trascrittasi inversa con un buffer corrispondente e casuale primer per assicurare la trascrizione inversa di tutti gli mRNA (Vedi Tabella materiali).
2. Valutare i cambiamenti nei livelli di espressione di mRNA di fibronectina (FN1) ed E-caderina (CDH1) e trasformare il fattore di crescita beta 1 (TGFβ1) da qPCR con gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come controllo interno. È possibile utilizzare standardizzato analisi di espressione genica disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali) o per disegnare primers.
3. Confrontare le cellule HeyA8 in coltura prossimale con HPMCs con i controlli di HeyA8 e il HPMCs in coltura prossimale con i controlli HPMC.

Risultati

Le cellule di cancro ovarico metastatico ritrovarvi con cellule mesoteliali presso il sito di metastasi all'interno della cavità peritoneale¹⁹. Interazioni paracrine e juxtacrine produttive con l'aiuto di cellule mesoteliali nell'indurre risposte adattative nelle cellule del cancro ovarico, che consentono di riuscita metastasi^17,18,20,21

Discussione

La comprensione del meccanismo di paracrine e juxtacrine segnalazione tra cellule è essenziale per lo sviluppo di una migliore conoscenza del tessuto normale omeostasi e malattia condizioni^7,8. Maggior parte paracrine studi vengono condotti attraverso la raccolta di segnalazione condizionata medio da una cella tipo e usarlo per trattare l'altro tipo di cellula. Questo metodo ha un vantaggio nella sua intrinseca semplicità. Tuttavia, esso non accuratamente ricap...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert	Corning (Costar)	3412	• 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation
6 well plate	Corning (Falcon)	353046	Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish	Corning (Falcon)	353025	Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI
MEM Nonessential amino acids	Corning (Cellgro)	25-025-CI
MEM Vitamins	Corning (Cellgro)	25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Pipets			Any make is fine
CO2 Incubator			Any make is fine
Biosafety level II cabinet			Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit	Qiagen	217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells	Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody	R&D Systems	MAB1835-100