Eine proximale Kultur-Methode zu studieren, Parakrine Signale zwischen Zellen

Zusammenfassung

Parakrine und Juxtacrine zelluläre Interaktionen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Hier ist eine proximale Kultur-Methode zur Untersuchung Parakrine Signalisierung wo sind die lokalisierten Konzentrationen der sezernierten Faktoren beibehalten und zelluläre Direktkontakt zu verhindern.

Zusammenfassung

Interzelluläre Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Tumorprogression, Immunreaktionen, Angiogenese und Entwicklung. Parakrine oder Juxtacrine signalisieren vermittelt diese Wechselwirkungen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums und Coculture Studien sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Arten von Interaktionen. Jedoch die Wirkung der lokalisierten hohe Konzentrationen von sezernierten Faktoren in der Mikroumgebung während die Parakrine Interaktionen ist nicht exakt von konditionierten Medium zusammengefaßt und so zu ungenauen Ergebnissen führen kann. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine proximale Kultur-Methode, um Parakrine Signalisierung studieren entwickelt. Die zwei Zelltypen werden entweder oberflächlich eine 10 µm dicken Polycarbonat-Membran mit 0,4 µm-Poren angebaut. Die Poren ermöglichen den Austausch von sezernierten Faktoren und zur gleichen Zeit hemmen Juxtacrine signalisieren. Die Zellen können gesammelt und am Endpunkt zu bestimmen, welche Auswirkungen die Parakrine Signalisierung lysiert. Darüber hinaus ermöglicht es für lokalisierte Konzentration Steigung von sezernierten Faktoren, ist diese Methode offen für Experimente mit längere Kultur sowie der Einsatz von Inhibitoren. Während wir diese Methode anwenden, um die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs Zellen und die Mesothelzellen stoßen sie auf der Website von Metastasen zu studieren, kann es zwei adhärente Zelltypen für Forscher, Parakrine Signalisierung in verschiedenen Bereichen zu studieren angepasst, einschließlich Tumor Mikroumgebung, Immunologie und Entwicklung.

Einleitung

Die Rolle der produktive gegenseitige Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Tumor Mikroumgebung in Tumorprogression gut etabliert und ist ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung auf Krebs Biologie¹geworden. Ähnliche Fälle der bidirektionalen Signalisierung sind von entscheidender Bedeutung bei der Wundheilung, Immunreaktionen, Angiogenese, Stammzell-Nischen, und während der Entwicklung^{2,3,4,5,6 , 7 , 8}. ein gemeinsames Thema in all diesen biologischen Prozessen ist, dass Zellen reagieren auf verschiedene Weise extrazelluläre Signale aus ihrer Mikroumgebung die Zelle Schicksal, Gewebe-Physiologie und Fortschreiten der Krankheit zu bestimmen. Daher hat der Fokus zunehmend wandte sich an ein besseres Verständnis der Mechanismen, die in solchen Zell-Zell-Kommunikation. Ein Großteil solcher Wechselwirkungen beinhalten Parakrine oder Juxtacrine Signale zwischen Zellen. Parakrine Signalisierung beinhaltet die Sekretion von bestimmten Signalisierung Faktoren durch eine Zelle, die durch entsprechende Rezeptoren auf eine andere Zelle in der Nähe,^9,10, eine Reaktion in ihm auslöst, während Juxtacrine wahrgenommen werden Signalisierung erfordert direkten Kontakt zwischen zellulären Komponenten der beiden Zellen beteiligt^11,12.

Diese Signalisierung ist eine entscheidende Komponente in Gewebe Homöostase sowie in der Tumor-Mikroumgebung. Die Krebszellen profitieren von Parakrine und Juxtacrine Faktoren von Zellen in der Tumor-Stroma, einschließlich Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs), Immunzellen und Adipozyten^13,14,15,16. Die Parakrine Signale von Wachstumsfaktoren, Zytokine, Chemokine, etc., vermittelt werden können, während der Juxtacrine signalisieren nebeneinander angeordneten Liganden und Rezeptoren wie Notch Signalisierung oder Wechselwirkungen zwischen Integrine und deren jeweilige beinhaltet extrazelluläre matrixproteine. Wir haben die Bedeutung der gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs Zellen und CAFs im Tumor Progression und Metastasierung¹⁴gezeigt. In ähnlicher Weise regulieren die Wechselwirkungen von metastasierenden Eierstockkrebs Zellen mit den auf der Website von Metastasen Mesothelzellen wichtige Mikro-RNAs und Transkriptionsfaktoren in den Krebszellen die metastatische Besiedlung^17, zu fördern ¹⁸.

Die meisten Studien über Parakrine Signalisierung beinhalten die Verwendung eines konditionierten Mediums gesammelt von einem Zelltyp, die zweite Zelle Art mit zu behandeln. Während dieser Ansatz weit verbreitet wurde, ist es nicht effektiv lokalisierten hohe Konzentrationen des Faktors abgesondert in der Mikroumgebung von der Empfängerzelle repliziert. Es auch nicht reproduzieren die Kinetik der den kontinuierlichen Fluss des Faktors abgesondert von einer Zelle produziert und erhielt von der benachbarten Zelle. Parakrine Signalisierung über kurze Distanzen effektiv ist wie die sezernierten Faktoren in den erforderlichen Konzentrationen nur in der Nähe der Quellzelle sind und neigen zu diffundieren und verdünnen zunehmender Entfernung. Diese lokalisierten hohe Konzentration des Faktors sekretierten unbedingt eine Antwort in der Empfängerzelle ausgelöst. Darüber hinaus ist die Antwort in den empfängerzellen auch die Balance zwischen neu sezernierten Faktoren und ihre ständige Erschöpfung durch Abbau, Bindung und Internalisierung empfängerzellen und Verbreitung von der Quellzelle abhängig. Konditionierten Medium kann konzentrierter entfallen die höheren lokalisierten Konzentrationen in der Mikroumgebung vorhanden sein, aber, die nicht genau reproduzieren kann die genaue Konzentrationen. Darüber hinaus kann nicht es die natürliche Kinetik der Produktion und die Erschöpfung der beteiligten Faktor imitieren. Um genauer Parakrine Signalisierung zu replizieren und trennen Sie ihn von Juxtacrine signalisieren Mechanismen, haben wir eine neuartige proximalen Kultur-Methode entwickelt, die bringt die beiden Zelltypen entweder oberflächlich eine poröse Membran wachsen. Die Poren sind klein genug, um zu verhindern, dass Juxtacrine Interaktionen und noch ermöglichen den Austausch von sezernierten Faktoren bei lokalisierten hohen Konzentrationen. Auf diese Weise behält dieses System die Kinetik der Produktion und die Erschöpfung der Parakrine Faktoren.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien des institutionellen Regulatory Board der Indiana Universität.

1. Zelle-Vorbereitung

1. Isolation und Kultur der menschlichen primäre Mesothelzellen
   1. Isolieren menschliche primäre Mesothelzellen (HPMCs) von menschlichen Omentum beschriebenen^17,18 und wachsen sie in komplette Wachstumsmedium [Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Vitamine] bei 37 ° C und 5 % CO₂.
      Hinweis: Die HPMCs werden in der Regel zu 100 % Zusammenfluss (Abbildung 1A) angebaut.
2. Wachstumsbedingungen von Eierstockkrebs Zellen
   1. Wachsen Sie HeyA8 Eierstockkrebs Zellen in komplette Nährmedium bei 37 ° C und 5 % CO₂.
      Hinweis: Verwenden HeyA8 Zellen gewachsen auf ca. 80 % Zusammenfluss (Abbildung 1 b).

2. die Zellkultur

1. Proximalen Kultur Einrichtung
   1. Verwendung Transwell Einsätze für 6-Well-Platten mit einem 10 μm Dicke Gewebe-Kultur-behandelten Polycarbonat-Membran mit 0,4 μm Poren (10⁸ Poren/cm²) und ein Wachstumsbereich 4,67 cm² . Bei Bedarf optimieren Sie für verschiedene einfügen Größen durch Skalieren die Anzahl der Zellen, die nach dem Wachstum Fläche ausgesät. Warmen komplette Wachstumsmedium, Trypsin und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 37 ° C vor dem Gebrauch.
2. Vorbereitung der Einsätze
   1. Um die HeyA8 Zellen auf der unteren Fläche der Membran des Einsatzes zu säen, entfernen Sie die Einlage aus der Verpackung mit steriler Pinzette und legen Sie es umgekehrt in der Kulturschale steril 15 cm.
   2. Verwenden Sie eine 15-cm-Schüssel, da es die Tiefe hat, um Platz für die invertierte einfügen oder ersetzen es mit jedem geeigneten sterilen Behälter. Je nach dem Experiment legen Sie die erforderliche Anzahl von Einsätzen in 15 cm Schüssel.
   3. Beschriften Sie die drei Steuerelemente und drei experimentellen Bedingungen entsprechend mit einer Markierung auf der Kante der Einsätze.
3. Vorbereitung der Krebszellen
   1. Trypsinize die HeyA8 Zellen gewachsen an 80 % Einmündung in eine 25 cm² Kolben (~ 2 x 10⁶ Zellen), fügen Sie 1 mL Trypsin (0,25 %) für 40-60 s und neutralisieren die Trypsin mit 6 mL komplette Wachstumsmedium.
   2. Die Zellen bei 500 X g bei Raumtemperatur (RT) für 3 min zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL komplette Wachstumsmedium. Zählen Sie die lebenden Zellen der Trypan blauen Farbstoff Ausschluss-Methode.
4. Aussaat der Krebszellen
   1. 100.000 Zellen/mL von lebenden HeyA8 Zellen in komplette Wachstumsmedium auszusetzen. Sorgfältig 80.000 HeyA8 Samenzellen in 800 μl des vollständigen Wachstumsmedium auf der Unterseite des Einsatzes (was jetzt, konfrontiert ist, da es invertiert) ausgesetzt.
   2. Samen der Zellen, um eine DOM-artige Form zu bilden, so die Zellen auf dem Einsatz (Abbildung 1 bleiben). Ab der Mitte der Membran und nach außen in konzentrischen Kreisen zu bewegen Sie, während Sie langsam pipettieren. Mehr als 3 mm von der Kante, um zu verhindern, dass irgendwelche verschütten des Mediums geht nicht.
      Hinweis: Die Anzahl der Zellen ausgesät hängt von der Wachstumsrate der Zellen und die Dauer des Experiments. Die Anzahl der HeyA8 Zellen für diese proximalen Kultur ausgesät wurden optimiert und die Zellen werden 80 – 90 % Zusammenfluss am Ende des dritten Tages.
5. Krebs-Zellhaftung
   1. Bedecken Sie die Schüssel 15 cm, und ziehen Sie vorsichtig die Schale mit den Einsätzen in den CO-₂ -Inkubator. Es ist wichtig nicht zu stören den Tropfen des Mediums und Zellen auf den Einsatz bei diesem Schritt. Lassen Sie die Zellen bei 37 ° C für 4 h damit der Krebszellen auf den Einsatz aufstecken.
6. Vorbereitung der Mesothelzellen
   1. Nach ca. 4 h trypsinize der HPMCs bei 100 % Zusammenfluss in einem 75 cm² Kolben (~ 4 x 10⁶ Zellen) mit 2 mL Trypsin (0,25 %) für 1 – 2 min. angebaut und neutralisieren die Trypsin mit 12 mL komplette Wachstumsmedium.
   2. Die Zellen bei 500 X g bei RT 3 min zentrifugieren, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL komplette Wachstumsmedium und zählen die lebenden Zellen der Trypan blauen Farbstoff Ausschluss-Methode.
7. Aussaat der Mesothelzellen
   1. 300.000 Zellen/mL live HPMCs in komplette Wachstumsmedium auszusetzen. Jede Vertiefung einer 6-Well-Platte 2,5 mL frische komplette Wachstumsmedien hinzufügen. Sorgfältig die 15 cm Teller, enthält die Einsätze, um die biologische Sicherheit Haube zu bringen. Mit sterilen Pinzette, flip die Einlage und legen Sie sie in den Brunnen des 6-Well-Platte, damit sie aufrecht, mit den HeyA8 Zellen an der unteren Fläche, eingetaucht in das komplette Wachstumsmedium (Abbildung 1) befestigt ist.
   2. Samen 450.000 HPMCs suspendiert in 1,5 mL Wachstumsmedium im Inneren der Einsätze mit den HeyA8 Zellen an der Oberfläche mit Blick auf die Unterseite des Brunnens (Abbildung 1) oder auf Einsätze ohne irgendwelche HeyA8 Zellen für die HPMC-Steuerelemente. 1,5 mL Wachstumsmedium ohne Zellen auf die HeyA8-Steuerelemente hinzufügen.
8. Wächst der proximalen Kultur
   1. Die proximale Kultur im CO₂ Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂ 72 h wachsen zu lassen. Bei Bedarf kann das Medium wie folgt wieder aufgefüllt werden.
      1. Entfernen Sie für die Innenseite des Einsatzes 750 µL und 750 µL frische komplette Wachstumsmedium.
      2. Entfernen Sie für die Außenseite des Einsatzes (6-Well-Platte) 1 mL zu und fügen Sie 1 mL frische komplette Wachstumsmedium. 1 mL wurde für die Bequemlichkeit der Ändern des Mediums in einem Schritt gewählt. Falls gewünscht, kann 1,25 mL entfernt und stattdessen ersetzt werden.
9. Sammeln die Zellen
   1. Sammeln Sie die Zellen nach 72 h der proximalen Kultur. Besondere Vorsicht ist bei diesem Schritt zu Cross-Kontamination der HeyA8 Zellen und HPMCs. Trypsinize zu verhindern, dass die Zellen, Zentrifugieren sie und lösen Sie die Tablette anstelle von Lyse der Zellen auf der Membran um eine Kreuzkontamination zu verhindern.
10. Trypsinizing der Zellen
    1. Spülen Sie beide Seiten des Einsatzes mit 1 X PBS.
    2. Übertragen Sie die Einsätze zu einem neuen Brunnen und fügen Sie Trypsin. Das Innere des Einsatzes 0,5 mL Trypsin hinzu und die 6-Well-Platte, die Krebszellen an der unteren Fläche des Einsatzes befestigt trypsinize fügen Sie 2 mL Trypsin hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 2 min bei 37 ° c
11. Neutralisierung der trypsin
    1. Fügen Sie 1 mL der vollständigen Wachstumsmedium an der Innenseite des Einsatzes zu neutralisieren die Trypsin, pipette rauf und runter, und dann nehmen die Zellen und übertragen Sie sie auf einem beschrifteten sammelröhrchen. Fügen Sie eine zusätzliche 2 mL des vollständigen Wachstumsmedium für eine vollständige Neutralisation. Darauf sollte geachtet werden, nicht auf die Membran durchdringen beim pipettieren um eine Cross-Kontamination der Zellen zu verhindern.
    2. Um die Zellen auf der Unterseite des Einsatzes zu sammeln, pipette 2 mL Trypsin, das in Schritt 12.2 auf der unteren Fläche 2 – 3 X hinzugefügt wurde, so dass die Zellen in den unteren Teil der 6-Well-Platte fallen. Neutralisieren Sie die Trypsin auf der Unterseite der Platte mit 6 mL Wachstumsmedium zu, und übertragen Sie den Inhalt der Platte auf einen beschrifteten sammelröhrchen.
12. Sammeln und Lyse der Zellen
    1. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 3 min und Aspirieren Sie die Medien. Aufschwemmen und lyse der Zelle Pellets mit 0,7 mL Phenol und Guanidin-Thiocyanat-basierten Lyse-Reagenz für die RNA-Extraktion. Isolieren Sie die RNA mit jedem geeigneten Kit.

3. quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion

Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben eine quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) um gen Ausdrücke Veränderungen infolge der proximalen Kultur zu studieren.

1. QPCR cDNA aus den RNA-Proben vorbereiten. Passenden Reverse Transkriptase mit einem entsprechenden Puffer und zufällige Primer verwenden, um der reversen Transkription von allen mRNA sicherzustellen (siehe Tabelle der Materialien).
2. Die Änderungen in der mRNA Ausdruck Fibronektin (FN1) und E-Cadherin (CDH1) zu bewerten und Wachstumsfaktor Beta 1 (TGFβ1) von qPCR mit Glyceraldehyde-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als interne Kontrolle zu verwandeln. Es ist möglich, standardisierte handelsübliche Gen Ausdruck Assays zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) oder Grundierungen zu gestalten.
3. Vergleichen Sie die HeyA8 Zellen gewachsen im proximalen Kultur mit HPMCs mit der HeyA8-Steuerung und die HPMCs im proximalen Kultur mit den Steuerelementen HPMC angebaut.

Ergebnisse

Metastasierenden Eierstockkrebs Zellen stoßen Mesothelzellen am Ort der Metastasen in die Bauchhöhle¹⁹. Produktive Parakrine und Juxtacrine Interaktionen mit Mesothelzellen Hilfe bei der Induktion von adaptive Reaktionen in den Eierstock-Krebs-Zellen, die ermöglichen erfolgreiche Metastasierung^17,18,20,21 . Um die Wirksamkeit der proxi...

Diskussion

Den Mechanismus der Parakrine und Juxtacrine Signale zwischen Zellen zu verstehen ist wichtig für die Entwicklung einer besseren Kenntnis des normalen Gewebes Homöostase und Krankheit Bedingungen^7,8. Die meisten Parakrine signalisieren, dass durch das Sammeln von Studien sind konditioniert Medium aus einer Zelle Art und benutzen, um die anderen Zelltyp zu behandeln. Diese Methode hat einen Vorteil in seiner Einfachheit. Jedoch ist es nicht genau lokalisierten K...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 mm Transwell permeable support with 0.4 µm Pore Polycarbonate Membrane Insert	Corning (Costar)	3412	• 10 µm thick translucent polycarbonate membrane • Treated for optimal cell attachment • Packaged 6 inserts in a 6 well plate, 4 plates per case • Membrane must be stained for cell visibility • Sterilized by gamma radiation
6 well plate	Corning (Falcon)	353046	Flat Bottom, TC-treated, sterile, with Lid
15 cm culture dish	Corning (Falcon)	353025	Sterile, TC-treated Cell Culture Dish
DMEM	Corning (Cellgro)	10-013-CV
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI
MEM Nonessential amino acids	Corning (Cellgro)	25-025-CI
MEM Vitamins	Corning (Cellgro)	25-020-CI
0.25% Trypsin, 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Pipets			Any make is fine
CO2 Incubator			Any make is fine
Biosafety level II cabinet			Any make is fine
FN1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01549976_m1
TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs00998133_m1
CDH1 TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs01023895_m1
GAPDH TaqMan Gene Expression Assay	ThermoFisher Scientific	Hs99999905_m1
miRNeasy mini RNA isolation Kit	Qiagen	217004
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher Scientific	43-688-13
HeyA8 ovarian cancer cells	Obtained from Ernst Lengyel Lab, University of Chicago
TGFβ Neutralizing Antibody	R&D Systems	MAB1835-100