小鼠静脉内膜氧化术

摘要

本文介绍了一种非插管、自发呼吸小鼠静脉-静脉体外膜氧合 (ECMO) 技术的协议。这种小鼠 ECMO 模型可在急性和终末期肺部疾病的实验研究中得到有效的实施。

摘要

近年来, 体外膜氧合 (ECMO) 的使用大幅度增加。ECMO 已成为急性和终末期肺部疾病的可靠和有效的治疗方法。随着临床需求的增加和 ECMO 的长期使用, 对多器官损伤的程序优化和预防具有重要的意义。本协议的目的是在非插管、自发呼吸的小鼠中提出静脉静脉 ECMO 的详细技术。本协议展示了 ECMO 和手术步骤的技术设计。这种小鼠 ECMO 模型将有助于研究与 ECMO 相关的病理生理学 (如炎症, 出血和血栓栓塞事件)。由于基因修饰小鼠的丰富性, ECMO 相关并发症的分子机制也可以被解剖。

引言

体外膜氧化 (ECMO) 是一种临时的生命支持系统, 接管肺和心脏的功能, 以允许适当的气体交换和灌注。希尔 et al¹描述了1972年首次使用 ECMO 患者;然而, 它仅在²2009年在甲型h1n1 流感大流行期间成功应用后才得到广泛使用。今天, ECMO 通常被用作在末期心脏病和肺部疾病³的救生程序。静脉静脉 ECMO 被越来越多地用于在清醒, 非插管, 自发性呼吸衰竭患者⁴的侵入性机械通气的替代。

尽管其广泛采用, ECMO^5,6,7报告了各种各样的复杂化。ECMO 患者可能经历的并发症包括出血、血栓、败血症、血小板减少症、与设备有关的故障和空气栓塞。此外, 全身炎症反应综合征 (sir) 导致多器官损害是很好地描述了临床和实验研究^8,9。在长期 ECMO 治疗的患者中也经常报告神经并发症, 如脑梗死。混淆问题, 通常很难区分并发症是由 ECMO 本身引起的, 还是源于伴随着急性和终末期疾病的基础紊乱。

为了具体研究 ECMO 对健康机体的影响, 必须建立可靠的实验动物模型。很少有关于 ECMO 在小动物身上的性能的报告, 都只限于老鼠。迄今为止, 文献中没有描述 ECMO 的小鼠模型。由于大量的转基因小鼠菌株的可用性, 建立一个小鼠 ECMO 模型将允许进一步调查涉及 ECMO 相关并发症的分子机制^10,11。

根据我们先前描述的小鼠体外循环 (CPB) 模型¹², 我们开发了一种稳定的静脉-静脉 ECMO 的方法, 在非插管, 自发呼吸鼠。ECMO 电路 (图 1), 包含流出和流入套管, 蠕动泵, 肺和气陷油藏, 类似于我们以前描述的小鼠 CPB¹²模型, 除了有一个较小的启动容积 (0.5 毫升)。该协议演示了在成功的 ECMO 过程中涉及的详细技术、生理监测和血气分析。

研究方案

对雄性 C57BL/6 小鼠进行了实验, 年龄为12周。这项研究是按照《 TSA 16/2250 议定书》规定的德国动物法准则进行的。

1. 材料制备

注: 所有步骤均在清洁、非灭菌条件下执行。如果动物在术后存活, 将需要无菌条件。

1. 使用16X 放大显微镜下的手术刀片, 将 3 fenestrations 引入2阻燃聚氨酯管中。
   注意: 所有 fenestrations 必须位于套管的远端第三, 以确保最佳的血液引流。
2. 准备启动液 (材料表)。包括 30 IU/毫升肝素和2.5% 伏/v 的8.4% 溶液的 NaHCO₃。将此解决方案冷藏4摄氏度, 直到它可以使用。使用 500 uL 的启动解决方案对电路进行质数处理。
3. 将流出套管放入启动液中, 并通过切换蠕动泵填充 ECMO 机。以1毫升/分钟的流速继续在机器上循环启动液, 接下来的30分钟。
4. 给肺0.5 升/分钟100% 氧气。

2. 麻醉

1. 将动物放置在充满2.5% 伏异氟醚/氧混合物的感应室中。为蒸发器提供100% 氧气的0.5 升/分钟。在手术前, 检查是否通过测试踏板撤回和疼痛反射来实现全身麻醉。涂抹眼凝胶, 防止干燥损坏。
2. 使用暖垫保持体温在37摄氏度。
3. 使用异氟醚蒸发器进行吸入面罩麻醉, 并注射5毫克/千克卡洛芬皮下注射。
4. 定期观察自发呼吸, 调整异氟醚浓度, 使其介于1.3 和2.5% 之间。

3. 手术

1. 通过在颈部左侧的细剪刀的帮助下, 使用4毫米的侧向皮肤切口暴露左颈静脉。使用微钳和棉签进行尖锐而钝的制备, 用小容器的双极性凝固。
2. 一旦左颈静脉被暴露, 结扎远端部分使用8-0 丝缝合与帮助的微钳。
3. 在静脉的近端放置一个滑移结。用微剪刀切割静脉前壁。
4. 为达到完全肝素化, 通过 26 g braunula, 将 2.5 IU/g 肝素注入颈静脉。
5. 通过30°提高动物垫的头部一侧, 以避免插入套管时静脉过度失血。
6. 将 2-阻燃聚氨酯 (PU) 套管插入颈静脉的近端部, 将其略微旋转, 同时将其推至4厘米的深度;在这样做时, 将达到下腔静脉 (IVC) 的髂分岔。
7. 使用 microforceps 固定8-0 丝结的套管。
8. 使用3.1、3.2 和3.3 中描述的步骤暴露右颈静脉。
9. 加压右颈静脉与 1-Fr PU 套管, 轻轻地移动它5毫米朝向右心房的方向。
10. 重复步骤3.7。
11. 导尿左股动脉与另一个 1-Fr PU 套管, 并使用它进行侵入性压力监测, 以及血液取样的血液气体分析 (BGA)。
12. 插入心电图 (ECG) 针连接到一个数据采集装置皮下注射到两个前肢和左胸壁。
13. 插入与数据采集设备连接的直肠温度计。

4. 静脉导管体外膜氧合及血气分析

注: 有关完整 ECMO 电路的示意图, 请参见图 1。

1. 启动 ECMO 在动物上打开泵的初始流速为0.1 毫升/分钟. 在接下来的2分钟内调节泵的流速至3-5 毫升/分钟。
2. 在排出套管中通过插管现场吸入空气时, 通过气藏储层减少流量并将0.1 毫升的启动溶液添加到电路中。
3. 在稳定的流量下, 通过数据采集装置继续实时监控所有重要参数。
4. 不断观察从静脉引流回流和监测在空气捕手水库的血液水平。
5. 收集从伤口的任何血液泄漏到一个1毫升注射器与尖端的 24 G 布拉努拉返回它到 ECMO 电路通过空气俘获水库。
6. 对于 BGA, 使用血液取样盒在以下时间点和以下位置收集大约75µL 的动脉血:
   1. ECMO 启动后10分钟, 通过肺前内置的额外管, 从静脉内采集血液, 通过肺 (控制) 后的类似额外管, 直接从股动脉中取血。
   2. ECMO 启动后30分钟, 从股动脉中收集血液。
7. 给一个额外的0.1 毫升的启动解决方案, 以补偿 intravasal 液体损失每45分钟通过空气捕手或股动脉导管或通过吸空气气泡通过血液排出套管。
8. 对于 BGA, 使用血液取样盒收集大约75µL 的动脉血:
   1. ECMO 从股动脉启动后1小时。
   2. 2小时 ECMO 启动后, 通过肺前内置的额外管从静脉内采集血液, 通过肺 (控制) 后的类似额外管, 直接从股动脉中取血。
9. 2小时后, 逐渐降低泵的流速 (5 分钟以上), 从而停止 ECMO。
10. 继续记录重要参数10分钟。
11. 通过 exsanguinating 动物和采集血液和器官来完成实验。

结果

本协议描述了小鼠静脉 ECMO 的方法。这个模型是可靠的和可重现的, 并与我们先前描述的体外循环呼吸和循环阻滞模型^12,13, 它是不太技术上要求建立。

ECMO 在静脉系统中的流动保持在1.5 和5毫升/分钟之间。通过在 ECMO 电路中加入额外的启动液, 将平均动脉压力保持在70到85毫米汞柱之?...

讨论

以前, 我们描述了一个成功的模型的 CPB 在鼠标^12,13。为了实现急性或终末期肺部疾病的这种模式, 我们开发了一个易于使用的静脉-静脉 ECMO 电路的小鼠。不同于 CPB 模型, 静脉静脉 ECMO 不需要复杂的手术程序, 如胸骨和夹紧的主动脉, 从而减少伤口出血的风险在一个完全肝素化的动物。为避免肺血栓栓塞, 每只动物可获得 2.5 IU 肝素/千克。这种剂量是基于?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	in 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	in 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2,5 IU per ml of priming
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615	5mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotide artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care GmbH	PZN:9714675	narcosis
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1,3 -2,5%
Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software	Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany		invasive pressure, ECG, t °C
i-STAT portable device	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old	Charles River Laboratories		housed 1 week before