Ossigenazione extracorporea veno-venoso in un Mouse

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo che descrive la tecnica di ossigenazione extracorporea veno-venoso della membrana (ECMO) in un non intubati, spontaneamente la respirazione mouse. Questo modello murino di ECMO può essere efficacemente attuato in studi sperimentali di acuto e malattie polmonare di stadio finale.

Abstract

L'uso dell'ossigenazione extracorporea della membrana (ECMO) è aumentato sostanzialmente negli ultimi anni. ECMO è diventata una terapia efficace ed affidabile per acuto così come malattie polmonare di stadio finale. Con l'aumento della domanda clinica e l'uso prolungato di ECMO, ottimizzazione procedurale e la prevenzione del danno multi-d'organo sono di importanza critica. L'obiettivo di questo protocollo è di presentare una tecnica dettagliata di ECMO veno-venoso in un non intubati, respirazione spontanea del mouse. Questo protocollo viene illustrato il progetto tecnico del ECMO e la procedura chirurgica. Questo modello murino di ECMO faciliterà lo studio della fisiopatologia legata alla ECMO (ad es., infiammazione, eventi tromboembolici e sanguinamenti). A causa dell'abbondanza di topi geneticamente modificati, i meccanismi molecolari coinvolti in complicanze correlate alla ECMO possono anche essere sezionati.

Introduzione

Ossigenazione extracorporea della membrana (ECMO) è un sistema di supporto di vita temporanea che assume le funzioni dei polmoni e del cuore per consentire di aspersione e lo scambio di gas adeguata. Collina et al.¹ descritto il primo uso di ECMO in pazienti nel 1972; Tuttavia, esso solo è diventato ampiamente usato dopo la sua applicazione successo durante la pandemia di H1N1 nel 2009². Oggi, ECMO è usato ordinariamente come una procedura salvavita in stadio finale cuore e polmone malattie³. ECMO veno-venoso è sempre più impiegato come alternativa alla ventilazione meccanica invasiva nel sveglio, non intubati, pazienti con guasto respiratorio refrattario⁴che respirano spontaneamente.

Nonostante la sua adozione diffusa, varie complicazioni sono state segnalate per ECMO^5,6,7. Le complicazioni che possono essere sperimentate dai pazienti su ECMO comprendono sanguinamento, trombosi, sepsi, trombocitopenia, mancato funzionamento della periferica e l'embolia gassosa. Inoltre, una sindrome di risposta infiammatoria sistemica (SIRS) con conseguente danneggiamento del multi-organo è ben descritta sia clinicamente che in studi sperimentali^8,9. Le complicazioni neurologiche quali infarto del cervello sono segnalate anche frequentemente in pazienti sottoposti a terapia a lungo termine di ECMO. Per confondere le questioni, spesso è difficile distinguere se le complicazioni sono causate da ECMO sé o derivano dai disordini di fondo che accompagna acuta e le malattie di stadio finale.

In particolare studiare gli effetti di ECMO su un organismo sano, deve essere stabilito un affidabile modello sperimentale animale. Ci sono molto pochi rapporti sulle prestazioni di ECMO su piccoli animali e sono tutti limitati ai ratti. Fin qui, nessun modello del mouse di ECMO è stato descritto nella letteratura. A causa della disponibilità di un gran numero di ceppi di topi geneticamente modificati, istituzione di un modello di topo ECMO consentirebbe ulteriore indagine dei meccanismi molecolari coinvolti in complicanze correlate alla ECMO^10,11.

Basato sul nostro modello murino precedentemente descritto di esclusione cardiopolmonare (CPB)¹², abbiamo sviluppato un metodo stabile di ECMO veno-venoso in non intubati, topi che respirano spontaneamente. Il circuito ECMO (Figura 1), contenente il deflusso e afflusso cannule, una pompa peristaltica, ossigenatore e serbatoio aria-intrappolamento, è simile al nostro modello precedentemente descritto di murino CPB¹² ad eccezione di avere un innesco più piccolo volume (0,5 mL). Questo protocollo viene illustrato le tecniche dettagliate, monitoraggio fisiologico e analisi di gas del sangue coinvolta in una procedura riuscita di ECMO.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati effettuati su topi C57BL/6 maschi, 12 settimane di età. Questo studio è stato condotto nel rispetto delle linee guida della legge animale tedesca sotto protocollo TSA 16/2250.

1. i materiali preparazione

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni non sterili, pulite. Condizioni di sterilità sarebbe necessarie se l'animale è di essere sopravvissuto postoperatorio.

1. Introdurre 3 fenestrazioni in un tubo in poliuretano 2-Fr utilizzando una lama chirurgica sotto un microscopio con ingrandimento X 16.
   Nota: Tutte le fenestrazioni devono trovarsi nel terzo distale della cannula per assicurare il drenaggio del sangue ottimale.
2. Preparare la soluzione di adescamento (Tabella materiali). Sono 30 IU/mL eparina e 2,5% v/v di una soluzione di 8,4% di NaHCO₃. Refrigerare, questa soluzione a 4 ° C fino a quando è pronto per l'uso. Caricare il circuito con 500 µ l di soluzione di adescamento.
3. Inserire la cannula di deflusso della soluzione di adescamento e riempire la macchina ECMO accendendo la pompa peristaltica. Continuano a circolare la soluzione di adescamento attraverso la macchina per il prossimo 30 min ad una portata di 1 mL/min.
4. Dare 0,5 L/min di ossigeno 100% per l'ossigenatore.

2. anestesia

1. Posto l'animale in una camera di induzione riempito con una miscela di ossigeno/isoflurano 2,5% v/v. Forniscono 0,5 L/min di ossigeno 100% per il vaporizzatore. Prima dell'intervento, verifica che l'anestesia completa avviene mediante test pedali riflessi ritiro e dolore. Applicare il gel occhio per evitare danni di essiccazione.
2. Utilizzare un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C.
3. Eseguire anestesia maschera di inalazione utilizzando un vaporizzatore di isoflurano e iniettare il carprofen 5 mg/kg per via sottocutanea.
4. Osservare il respiro spontaneo e regolare la concentrazione di isoflurano in modo che sia tra 1.3 e 2,5% regolarmente.

3. chirurgia

1. Esporre la vena giugulare di sinistra tramite un'incisione cutanea laterale di 4 mm con l'aiuto di forbici bene sul lato sinistro del collo. Insieme a sharp e smussato preparazione utilizzando tamponi di cotone e micro-forcipe, utilizzare coagulazione bipolare dei piccoli vasi.
2. Una volta che la vena giugulare di sinistra è esposto, legare la parte distale utilizzando una sutura seta 8-0 con l'aiuto di micro-forcipe.
3. Posto un nodo scorsoio all'estremità prossimale della vena. Incidere la parete anteriore della vena utilizzando micro-forbici.
4. Per raggiungere eparinizzazione completa, iniettare l'eparina 2,5 IU/g nella vena giugulare tramite un braunula 26 G.
5. Sollevare il lato testa del pad animale di 30° per evitare l'eccessiva perdita di sangue dalla vena durante l'inserimento della cannula.
6. Inserire una cannula di 2-Fr in poliuretano (PU) nella parte prossimale della vena giugulare, ruotandolo leggermente e contemporaneamente spingerlo ad una profondità di 4 cm; mentre così facendo, si otterrà la biforcazione iliaca della vena cava inferiore (IVC).
7. Fissare la cannula con nodi di seta 8-0 utilizzando Micropinze.
8. Esporre la vena giugulare di destra utilizzando la procedura descritta in 3.1, 3.2 e 3.3.
9. Incannulare la vena giugulare di destra con una cannula di PU 1-Fr e spostarlo delicatamente 5 mm nella direzione dell'atrio di destra.
10. Ripetere il punto 3.7.
11. Cateterismo l'arteria femorale di sinistra con un'altra cannula di PU 1-Fr e utilizzarlo per pressione invasiva monitoraggio così come il prelievo di sangue per analisi di gas del sangue (BGA).
12. Inserire aghi elettrocardiogramma (ECG) collegati ad un dispositivo di acquisizione dati per via sottocutanea in entrambi gli arti anteriori e nella parete toracica sinistra.
13. Inserire un termometro rettale connesso a un dispositivo di acquisizione dati.

4. ossigenazione extracorporea a membrana Veno-venoso e l'emogasanalisi

Nota: Per un schema del circuito ECMO completo, vedere la Figura 1.

1. Avviare ECMO sull'animale attivando la pompa con una portata di iniziale di 0,1 mL/min regolare la portata della pompa entro il prossimo 2 min a 3-5 mL/min.
2. In caso di aspirazione di aria nella cannula deflusso tramite il sito di inserimento di una canula, ridurre il flusso e aggiungere 0,1 mL di soluzione di innesco al circuito tramite un serbatoio di intrappolamento dell'aria.
3. Sotto flusso stabile, continuare a monitorare in tempo reale tutti i parametri vitali tramite il dispositivo di acquisizione dati.
4. Costantemente osservare riflusso da drenaggio venoso e monitorare il livello del sangue nel serbatoio aria-trapper.
5. Raccogliere qualsiasi fuoriuscita dalle ferite in una siringa da 1 cc con la punta di un 24 G branula andreturn esso al circuito ECMO tramite il serbatoio dell'aria-intrappolamento di sangue.
6. Per BGA, utilizzare una cartuccia di campionamento di sangue per raccogliere circa 75 µ l di sangue arterioso presso i seguenti punti di tempo e dai seguenti percorsi:
   1. 10 min dopo l'inizio dell'ECMO, raccogliere i campioni da IVC tramite un tubo supplementare costruito prima l'ossigenatore, via simile tubo supplementare dopo ossigenatore (controllo) e direttamente dall'arteria femorale.
   2. 30 min dopo l'inizio dell'ECMO, raccogliere sangue dall'arteria femorale.
7. Dare un extra 0,1 mL di soluzione di adescamento per compensare la perdita di liquido intravasal ogni 45 minuti via l'aria-trapper del catetere dell'arteria femorale o succhiare le bolle di aria attraverso la cannula di drenaggio del sangue.
8. Per BGA, utilizzare una cartuccia di campionamento di sangue per raccogliere circa 75 µ l di sangue arterioso:
   1. 1 h dopo l'inizio dell'ECMO dall'arteria femorale.
   2. 2 h dopo l'inizio dell'ECMO, raccogliere i campioni da IVC tramite un tubo supplementare costruito prima l'ossigenatore, via simile tubo supplementare dopo ossigenatore (controllo) e direttamente dall'arteria femorale.
9. Dopo 2 h, ridurre la portata della pompa gradualmente (nel corso di 5 min), quindi arresto ECMO.
10. Continuare a registrare i parametri vitali per altri 10 min.
11. Finire l'esperimento da exsanguinating l'animale e la raccolta del sangue e degli organi.

Risultati

Questo protocollo descrive il metodo di ECMO veno-venoso in un mouse. Questo modello è affidabile e riproducibile e rispetto al nostro modello precedentemente descritto del CPB con arresto respiratorio e circolatorio^12,13, è tecnicamente meno esigente stabilire.

Flusso ECMO nel sistema venoso è stata mantenuta tra 1,5 e 5 mL/min. La pressione arteriosa media è stata ...

Discussione

In precedenza, abbiamo descritto un modello di successo di CPB in un mouse^12,13. Per implementare tale modello per acuto o disordini del polmone stadio finale abbiamo sviluppato un circuito ECMO veno-venoso easy-to-use per i topi. Diversi al modello CPB, veno-venoso ECMO non richiede complicate procedure chirurgiche quali sternotomy e la pressione dell'aorta, riducendo così il rischio di ferita sanguinante in un animale completamente eparinizzato. Per evitare il...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	in 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	in 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2,5 IU per ml of priming
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615	5mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotide artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care GmbH	PZN:9714675	narcosis
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1,3 -2,5%
Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software	Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany		invasive pressure, ECG, t °C
i-STAT portable device	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old	Charles River Laboratories		housed 1 week before