VENO-venöse extrakorporalen Membran Sauerstoffversorgung in eine Maus

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll beschreibt die Technik der Veno-venöse extrakorporalen Membran Sauerstoffanreicherung (ECMO) in einem nicht intubiert, spontan atmen Maus. Diese Mausmodell der ECMO kann effektiv in experimentellen Studien von akuten und terminaler Lungenerkrankungen implementiert werden.

Zusammenfassung

Der Einsatz der extrakorporalen Membran Sauerstoffanreicherung (ECMO) hat in den letzten Jahren deutlich erhöht. ECMO geworden ist eine zuverlässige und effektive Therapie für akute sowie terminaler Lungenerkrankungen. Mit der Zunahme der klinischen Bedarf und längerem Gebrauch ECMO sind verfahrenstechnische Optimierung und Vermeidung von Multi-Organ-Schäden von entscheidender Bedeutung. Das Ziel dieses Protokolls ist eine detaillierte Technik des Veno-venöse ECMO präsentieren in einer nicht intubiert, spontan atmen Maus. Dieses Protokoll zeigt die technische Auslegung der ECMO und OP-Schritte. Diese Mausmodell ECMO erleichtert das Studium der Pathophysiologie, die im Zusammenhang mit ECMO (z. B. Entzündungen, Blutungen und thromboembolische Ereignisse). Wegen der Fülle an genetisch veränderten Mäusen können die molekularen Mechanismen in ECMO-Komplikationen auch seziert.

Einleitung

Extrakorporalen Membran Sauerstoffversorgung (ECMO) ist eine temporäre Lebenserhaltungssystem, die Funktionen von Lunge und Herz übernimmt, um ausreichenden Gasaustausch und Perfusion zu ermöglichen. Hill Et al.¹ beschrieben die erste Anwendung von ECMO bei Patienten im Jahr 1972; jedoch wurde es nur nach seiner erfolgreichen Anwendung während der H1N1-Influenza-Pandemie 2009²genutzt. ECMO wird heute routinemäßig als lebensrettende Verfahren im Endstadium Herz und Lunge Erkrankungen³eingesetzt. VENO-venöse ECMO wird zunehmend als Alternative zur invasiven Beatmung in eingesetzt spontan atmende Patienten mit refraktärer respiratorische Insuffizienz⁴wach, nicht intubiert.

Trotz der weit verbreiteten Annahme wurden diverse Komplikationen für ECMO^5,6,7beschrieben. Komplikationen, die bei Patienten auf ECMO werden können gehören Blutungen, Thrombose, Sepsis, Thrombozytopenie, gerätebezogene Störungen und Luftembolien. Darüber hinaus ist eine systemische entzündliche Reaktion-Syndrom (SIRS) zu Multi-Organ-Schäden gut beschrieben, sowohl klinisch als auch in experimentellen Studien^8,9. Neurologische Komplikationen wie Hirninfarkt sind auch häufig bei Patienten mit ECMO-Langzeit-Therapie berichtet. Um Angelegenheiten zu verwirren, ist es oft schwierig zu unterscheiden, ob Komplikationen durch ECMO selbst entstehen oder ergeben sich aus der zugrunde liegenden Erkrankungen begleitend akute und terminalen Krankheiten.

Um speziell die Auswirkungen der ECMO auf einem gesunden Organismus untersuchen, muss eine zuverlässige experimentellen Tiermodell hergestellt werden. Auf die Leistung der ECMO auf Kleintiere und sind alle begrenzten Ratten gibt es sehr wenige Berichte. Bislang wurde keine Maus-Modell der ECMO in der Literatur beschrieben. Aufgrund der Verfügbarkeit einer großen Anzahl von genetisch veränderte Mausstämme würde Einrichtung ein Mausmodell ECMO weitere Untersuchung der molekularen Mechanismen beteiligt ECMO-Komplikationen^10,11ermöglichen.

Basierend auf unserer oben beschriebenen Mausmodell der kardiopulmonalen Bypass (CPB)¹², haben wir eine stabile Methode der Veno-venöse ECMO in nicht intubiert, spontan atmen Mäuse. Die ECMO-Schaltung (Abbildung 1), mit Abfluss und Zufluss Kanülen, einer peristaltischen Pumpe Oxygenator und Air-Trapping Reservoir ist ähnlich wie unser zuvor beschriebene Modell der murinen CPB¹² mit Ausnahme haben eine kleinere Grundierung Volumen (0,5 mL). Dieses Protokoll zeigt die detaillierte Techniken, physiologisches monitoring und Blut-Gas-Analyse in einem erfolgreichen ECMO-Verfahren.

Protokoll

Experimente wurden an männlichen C57BL/6 Mäusen, im Alter von 12 Wochen durchgeführt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des deutschen Tier Gesetzes unter Protokoll TSA 16/2250.

1. Vorbereitung

Hinweis: Alle Schritte sind sauber, unsterilen Bedingungen durchgeführt. Sterile Bedingungen wäre erforderlich, wenn Tier postoperativ überlebten.

1. Führen Sie 3 Fenestrationen in einem 2-Fr Polyurethan-Schlauch mit einer chirurgischen Klinge unter dem Mikroskop mit 16 X Vergrößerung ein.
   Hinweis: Alle Fenestrationen müssen im distalen Drittel der Kanüle um optimale Blut Entwässerung zu gewährleisten befinden.
2. Bereiten Sie die Grundierung-Lösung (Materialtabelle). Gehören Sie 30 IU/mL Heparin und 2,5 % V/V einer 8.4 % Lösung von Nahco3₃. Kühlen Sie diese Lösung bei 4 ° C, bis es einsatzbereit ist. Grundieren Sie die Schaltung mit 500 μl Priming-Lösung.
3. Legen Sie die Abfluss-Kanüle in das Priming-Lösung und Befüllen Sie das ECMO-Gerät durch die peristaltischen Pumpe einschalten. Weiterhin die Grundierung-Lösung durch die Maschine für die nächsten 30 min bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min zu verteilen.
4. Der Oxygenator geben Sie 0,5 L/min 100 % Sauerstoff.

(2) Anästhesie

1. Ort das Tier in einer Induktion Kammer mit einer 2,5 % V/V Isofluran/Sauerstoff-Gemisch gefüllt. Geben Sie 0,5 L/min 100 % Sauerstoff zum Verdampfer. Überprüfen Sie vor der Operation, dass die Vollnarkose erreicht wird, durch das Pedal Rückzug und Schmerz Reflexe testen. Tragen Sie Augengel trocknen Schaden zu verhindern.
2. Verwenden Sie eine wärmende Unterlage, um die Körpertemperatur auf 37 ° C.
3. Führen Sie einatmen Maske Anästhesie mit einem Verdampfer Isoflurane und injizieren Sie Carprofen 5 mg/kg subkutan zu.
4. Regelmäßig beobachten Sie Spontanatmung und passen Sie die Konzentration von Isofluran an, so dass es zwischen 1,3 und 2,5 %.

(3) Chirurgie

1. Setzen Sie die linke Halsschlagader durch über einen seitlichen Hautschnitt von 4 mm mit Hilfe von feinen Schere auf der linken Seite des Halses. Verwenden Sie zusammen mit scharfen und stumpfen Vorbereitung mit Mikro-Pinzetten und Baumwolle Tupfer bipolare Koagulation von kleinen Gefäßen.
2. Sobald die linke Halsschlagader ausgesetzt ist, verbinden Sie die distale Teil über eine 8-0 Seide Naht mit Hilfe von Mikro-Pinzetten.
3. Platzieren Sie ein Belegknoten am proximalen Ende der Vene. Einzuschneiden Sie die vordere Wand der Vene mit Mikro-Schere.
4. Zur Erreichung der vollen Heparinisierung injizieren Sie 2,5 IU/g Heparin in die Halsschlagader über einen 26 G Braunula.
5. Erhöhen Sie die Kopfseite des tierischen Pads um 30°, übermäßigen Blutverlust aus der Vene beim Einführen der Kanüle zu vermeiden.
6. Legen Sie eine 2-Fr Polyurethan (PU) Kanüle in proximalen Teil der Halsschlagader, es leicht drehen und schieben es bis zu einer Tiefe von 4 cm; Dabei wird die Beckenkamm Bifurkation der unteren Hohlvene (IVC) erreicht werden.
7. Sichern Sie die Kanüle mit 8: 0 Seide Knoten mit Mikrozangen.
8. Aussetzen der rechten Halsschlagader mit 3.1, 3.2 und 3.3 beschriebenen Schritte.
9. Cannulate der rechten Halsschlagader mit einer 1-Fr-PU-Kanüle und verschieben Sie ihn sanft 5 mm in Richtung des rechten Vorhof.
10. Wiederholen Sie Schritt 3.7.
11. Katheterisieren Sie die linke Femoral Arterie mit einer anderen 1-Fr-PU-Kanüle und nutzen Sie es für invasive Drucküberwachung sowie Blutentnahme für Blut-Gas-Analyse (BGA).
12. Fügen Sie ein Elektrokardiogramm (EKG) Nadeln verbunden zu einem Datenerfassungsgerät subkutan in beide Vorderbeine und in der linken Brustwand.
13. Legen Sie eine rektale Thermometer mit einem Datenerfassungsgerät verbunden.

4. Veno-venöse extrakorporalen Membran Sauerstoffversorgung und Blut-Gas-Analyse

Hinweis: Für eine schematische Darstellung der komplette ECMO-Schaltung, siehe Abbildung 1.

1. Durch Einschalten der Pumpe mit einer anfänglichen Durchfluss von 0,1 mL/min einstellen der Volumenstrom der Pumpe innerhalb der nächsten 2 min, 3-5 mL/min ECMO auf das Tier zu initiieren.
2. Reduzieren Sie bei Luftansaugung in den Abfluss Kanüle über die Kanülierung Website die Strömung und die Schaltung über ein Air-Trapping-Reservoir fügen Sie 0,1 mL Grundierung-Lösung hinzu.
3. Unter stabile Strömung weiterhin im Echtzeit-Modus alle Vitalparameter über das Datenerfassungsgerät überwachen.
4. Ständig beobachten Rückfluss aus der venösen Drainage und das Niveau des Blutes in der Luft-Trapper-Stausee.
5. Sammeln Sie kein Blut aus Wunden in eine 1 cc Spritze mit der Spitze einer 24 G-Branula-Andreturn es um die ECMO-Schaltung über das Air-Trapping-Reservoir undicht.
6. Verwenden Sie für BGA eine Blut-Probenahme-Patrone ca. 75 µL des arteriellen Blutes zu den folgenden Zeitpunkten und aus den folgenden Speicherorten zu sammeln:
   1. 10 min nach der Einleitung der ECMO, sammeln Blut aus der IVC über einen zusätzlichen Schlauch vor dem Oxygenator über ähnliche zusätzlichen Schlauch nach Oxygenator (Kontrolle), Baujahr und direkt von der Femoral Arterie.
   2. 30 min nach der Einleitung der ECMO, sammeln Blut von der Femoral Arterie.
7. Geben Sie eine zusätzliche 0,1 mL Grundierung Lösung zum Ausgleich von intravasaler Flüssigkeitsverlust alle 45 min über die Luft-Trapper oder Femoral Arterie Katheter oder durch das Saugen der Luftblasen durch die Blut-Entwässerung-Kanüle.
8. Verwenden Sie für BGA eine Blut-Probenahme-Patrone ca. 75 µL arterielles Blut zu sammeln:
   1. 1 h nach der Einleitung der ECMO von der Femoral Arterie.
   2. 2 h nach der Einleitung der ECMO, sammeln Blut aus der IVC über einen zusätzlichen Schlauch vor dem Oxygenator über ähnliche zusätzlichen Schlauch nach Oxygenator (Kontrolle), Baujahr und direkt von der Femoral Arterie.
9. Reduzieren Sie nach 2 h die Durchflussmenge an der Pumpe schrittweise (im Laufe von 5 min), dadurch stoppen ECMO.
10. Weiterhin wichtige Parameter für weitere 10 Minuten aufzeichnen.
11. Beenden Sie das Experiment durch das Tier exsanguinating und Ernte, Blut und Organen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Methode der Veno-venöse ECMO in eine Maus. Dieses Modell zuverlässig und reproduzierbar und im Vergleich zu unserer oben beschriebenen Modell der CPB mit Atem-und Herz-Kreislauf-^12,-¹³ist, ist es technisch weniger anspruchsvoll, zu etablieren.

ECMO fließen in das venöse System wurde zwischen 1,5 und 5 mL/min beibehalten. Der mittlere a...

Diskussion

Zuvor beschrieben wir ein erfolgreiches Modell der CPB in Maus^12,13. Ein solches Modell für implementieren akute oder terminaler Lungenerkrankungen wir eine einfach zu bedienende Veno-venöse ECMO Schaltung für Mäuse entwickelt. Anders als das CPB-Modell, Veno-venöse ECMO komplizierte chirurgische Eingriffe wie Sternotomie und Klemmen der Aorta, erfordert keine wodurch das Risiko einer Wunde Blutung in ein vollständig heparinisierten Tier. Zur Vermeidung von...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	in 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	in 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2,5 IU per ml of priming
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615	5mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotide artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care GmbH	PZN:9714675	narcosis
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1,3 -2,5%
Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software	Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany		invasive pressure, ECG, t °C
i-STAT portable device	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old	Charles River Laboratories		housed 1 week before