Oxigenação de membrana extracorpórea veno-venosa em um rato

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a técnica de oxigenação de membrana extracorpórea veno-venosa (ECMO) em um não-intubado, espontaneamente respiração mouse. Este modelo murino de ECMO pode ser efetivamente implementado em estudos experimentais de aguda e doenças pulmonares de estágio final.

Resumo

O uso de oxigenação de membrana extracorpórea (ECMO) tem aumentado substancialmente nos últimos anos. ECMO tornou-se uma terapia eficaz e confiável para aguda, bem como doenças de pulmão estágio final. Com o aumento da demanda de clínica e uso prolongado de ECMO, otimização processual e prevenção de danos em vários órgãos são de importância crucial. O objectivo do presente protocolo é apresentar uma técnica detalhada de ECMO veno-venosa em um não-entubada, respirando espontaneamente do mouse. Este protocolo demonstra o desenho técnico do ECMO e etapas cirúrgicas. Este modelo murino de ECMO facilitará o estudo da fisiopatologia relacionada com ECMO (por exemplo, inflamação, eventos tromboembólicos e sangramento). Devido à abundância de ratos geneticamente modificados, os mecanismos moleculares envolvidos nas complicações relacionadas com o ECMO podem também ser dissecados.

Introdução

Oxigenação de membrana extracorpórea (ECMO) é um sistema de suporte de vida temporária que assume as funções dos pulmões e coração para permitir que a perfusão e a troca gasosa adequada. Hill et al¹ descreveu o primeiro uso do ECMO em pacientes em 1972; no entanto, só se tornou amplamente utilizada após a sua aplicação bem sucedida durante o H1N1 da gripe pandêmica em 2009². Hoje, o ECMO rotineiramente é usada como um procedimento de salva-vidas em estágio final coração e pulmão doenças³. ECMO veno-venosa é cada vez mais empregado como uma alternativa para a ventilação mecânica invasiva em acordada, não-entubada, respirando espontaneamente a pacientes com insuficiência respiratória refratários⁴.

Apesar da sua adopção generalizada, diversas complicações têm sido relatadas para o ECMO^5,6,7. Complicações que podem ser experienciadas por pacientes em ECMO incluem hemorragia, trombose, sepse, trombocitopenia, disfunções relacionadas ao dispositivo e embolia gasosa. Além disso, uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), resultando em danos nos órgãos multi é bem descrita clinicamente e em estudos experimentais^8,9. Complicações neurológicas como infarto cerebral são também frequentemente relatadas em pacientes submetidos a terapia a longo prazo do ECMO. Para confundir matérias, muitas vezes é difícil distinguir se as complicações são causadas pelo ECMO em si ou surgem os distúrbios subjacentes que acompanha aguda e doenças da fase final.

Para estudar especificamente os efeitos do ECMO em um organismo saudável, deve ser estabelecido um modelo animal experimental confiável. Há muito poucos relatórios sobre o desempenho do ECMO em pequenos animais e são todos limitados aos ratos. Até à data, nenhum modelo do rato do ECMO tem sido descrito na literatura. Devido à disponibilidade de um grande número de estirpes de rato geneticamente modificado, estabelecimento de um modelo de ECMO mouse permitiria mais investigação dos mecanismos moleculares envolvidos em complicações relacionadas à ECMO^10,11.

Com base no nosso modelo murino descrito anteriormente de extracorpórea (CEC)¹², nós desenvolvemos um método estável de ECMO veno-venosa em não-entubada, respirando espontaneamente ratos. O circuito ECMO (Figura 1), que contém o efluxo e cânulas de afluência, uma bomba peristáltica, oxigenador e retêm o ar reservatório, é semelhante ao nosso modelo descrito anteriormente de murino CPB¹² com exceção de ter uma menor escorva volume (0,5 mL). Este protocolo demonstra as técnicas detalhadas, monitorização fisiológica e gasometria arterial envolvida em um processo bem sucedido de ECMO.

Protocolo

Experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6 machos, com idade de 12 semanas. Este estudo foi realizado em conformidade com as diretrizes da lei alemã Animal sob protocolo TSA 16/2250.

1. materiais preparação

Nota: Todas as etapas são executadas em condições limpas, não estéril. Condições estéreis seria necessárias se o animal é para ser sobreviveu no pós-operatório.

1. Introduza um tubo de poliuretano 2-Fr usando uma lâmina cirúrgica sob um microscópio com ampliação de 16 X 3 fenestrações.
   Nota: Todas as fenestrações devem estar localizadas no terço distal da cânula para garantir a drenagem de sangue ideal.
2. Prepare a solução de escorva (Tabela de materiais). Incluem 30 UI/mL heparina e 2,5% v/v de uma solução de 8,4% do NaHCO₃. Leve à geladeira esta solução a 4 ° C até que esteja pronto para usar. Prime do circuito com 500 uL de solução de escorva.
3. Coloque a cânula de saída para a solução de escorva e encher a máquina ECMO por ligar a bomba peristáltica. Continuam a circular a solução de escorva através da máquina para o próximo 30 min a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
4. Dê 0,5 L/min de oxigênio a 100% para o oxigenador.

2. anestesia

1. Lugar do animal em uma câmara de indução preenchido com uma mistura de oxigênio/isoflurano 2,5% v/v. Fornece 0,5 L/min de oxigênio a 100% para o vaporizador. Antes da cirurgia, verificar que a anestesia completa é alcançada através do teste de pedais reflexos de retirada e dor. Aplica o gel de olho para evitar danos de secagem.
2. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo em 37 ° C.
3. Realizar a anestesia de máscara de inalação usando um vaporizador de isoflurano e injetar carprofeno 5 mg/kg por via subcutânea.
4. Regularmente, observar a respiração espontânea e ajustar a concentração de isoflurano, de modo que é entre 1,3 e 2,5%.

3. cirurgia

1. Expor a veia jugular esquerda, usando uma incisão de pele lateral de 4 mm, com a ajuda de uma tesoura bem no lado esquerdo do pescoço. Juntamente com a preparação afiada e contundente, usando cotonetes de algodão e microfórceps, use bipolar coagulação dos pequenos vasos.
2. Uma vez que a veia jugular esquerda é exposta, ligate a parte distal, usando uma sutura de seda de 8-0, com a ajuda de microfórceps.
3. Coloque um nó de deslizamento na extremidade proximal da veia. Incise a parede anterior da veia utilizando microtesoura.
4. Para atingir a heparinização plena, injete heparina de 2,5 UI/g em veia jugular através de um braunula de 26 G.
5. Levante o lado da cabeça do animal pad 30 ° para evitar a perda excessiva de sangue da veia durante a inserção da cânula.
6. Introduza uma cânula de (PU) poliuretano 2-Fr a parte proximal da veia jugular, gire-o levemente enquanto empurra-lo a uma profundidade de 4 cm; Enquanto isso, se alcançará a bifurcação ilíaca da veia cava inferior (VCI).
7. Fixe a cânula com nodos seda 8-0, usando um microfórceps.
8. Expor a veia jugular direita, usando as etapas descritas em 3.1, 3.2 e 3.3.
9. Canule a veia jugular direita com uma cânula de PU 1-Fr e movê-lo suavemente 5 mm na direção do átrio direito.
10. Repita a etapa 3.7.
11. Cateterismo da artéria femoral esquerda com outra cânula de PU 1-Fr e usá-lo para pressão invasiva, monitorização, bem como a amostra de sangue para gasometria arterial (BGA).
12. Inserir agulhas de eletrocardiograma (ECG) conectadas a um dispositivo de aquisição de dados por via subcutânea, em ambas as patas dianteiras e na parede torácica esquerda.
13. Inserir um termômetro retal, conectado a um dispositivo de aquisição de dados.

4. oxigenação de membrana extracorpórea Veno-venosa e arterial

Nota: Para um diagrama esquemático do circuito de ECMO completo, veja a Figura 1.

1. Inicie o ECMO do animal ao ligar a bomba com uma taxa de fluxo inicial de 0,1 mL/min. Ajuste a taxa de fluxo da bomba dentro o próximo 2 min para 3-5 mL/min.
2. No caso de sucção de ar na cânula de saída através de cânulas, reduzir o fluxo e adicionar 0,1 mL de solução de escorva ao circuito através de um reservatório de ar-caça com armadilhas.
3. Sob fluxo estável, continue a monitorar o modo em tempo real todos os parâmetros vitais através do dispositivo de aquisição de dados.
4. Observar o refluxo da drenagem venosa e constantemente monitorar o nível de sangue no reservatório de ar-caçador.
5. Colete sangue vazando de feridas em uma 1 cc seringa com a ponta de um 24 G branula andreturn-para o circuito ECMO através do reservatório de ar retêm.
6. Para BGA, use um cartucho de recolha de amostras de sangue para coletar aproximadamente 75 µ l de sangue arterial para os seguintes pontos de tempo e nos seguintes locais:
   1. 10 min após o início do ECMO, coletar sangue da veia cava inferior através de um tubo extra construído em antes o oxigenador, através do tubo extra semelhante após oxigenador (controle) e diretamente da artéria femoral.
   2. 30 min após o início do ECMO, coletar sangue da artéria femoral.
7. Dar um extra 0,1 mL da solução de escorva para compensar a perda de líquido intravasal cada 45 min através do ar-caçador ou cateter da artéria femoral ou sugando as bolhas de ar através da cânula de drenagem do sangue.
8. Para BGA, use um cartucho de recolha de amostras de sangue para coletar aproximadamente 75 µ l de sangue arterial:
   1. 1 h após o início do ECMO da artéria femoral.
   2. 2 h após o início do ECMO, coletar sangue da veia cava inferior através de um tubo extra construído em antes o oxigenador, através do tubo extra semelhante após oxigenador (controle) e diretamente da artéria femoral.
9. Após 2 h, reduza a taxa de fluxo da bomba gradualmente (ao longo de 5 min), assim parando ECMO.
10. Continue a gravar parâmetros vitais por mais 10 minutos.
11. Termine o experimento por corrermos o animal e colheita de sangue e órgãos.

Resultados

Este protocolo descreve o método de ECMO veno-venosa em um rato. Este modelo é confiável e reprodutível e em relação ao nosso modelo descrito anteriormente de CEC com detenção respiratória e circulatória^12,13, é tecnicamente menos exigente estabelecer.

Fluxo ECMO no sistema venoso foi mantido entre 1,5 e 5 mL/min. A pressão arterial média foi mantida entre 7...

Discussão

Anteriormente, nós descrevemos um modelo bem sucedido de CEC em um rato^12,13. Para implementar esse modelo para aguda ou doenças de pulmão estágio final desenvolvemos um circuito ECMO veno-venosa easy-to-use para ratos. Diferente para o modelo do CPB, veno-venosa ECMO não requer procedimentos cirúrgicos complicados como esternotomia e aperto da aorta, reduzindo assim o risco de sangramento de ferimento em um animal totalmente heparinizado. Para evitar a emb...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	in 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	in 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2,5 IU per ml of priming
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615	5mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotide artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care GmbH	PZN:9714675	narcosis
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1,3 -2,5%
Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software	Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany		invasive pressure, ECG, t °C
i-STAT portable device	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old	Charles River Laboratories		housed 1 week before