Oxygénation par Membrane extracorporelle veino-veineuse chez une souris

Résumé

Nous présentons ici un protocole décrivant les technique d’oxygénation par membrane extracorporelle veino-veineuse (ECMO) dans un non-intubés, spontanément les souris de la respiration. Ce modèle murin d’ECMO peut être implémenté efficacement dans des études expérimentales de l’aigu et les pneumopathies terminale.

Résumé

L’utilisation d’oxygénation extracorporelle (ECMO) a considérablement augmenté ces dernières années. ECMO est devenu une thérapie efficace et fiable pour les aigus ainsi que les pneumopathies terminale. Avec l’augmentation de la demande clinique et l’utilisation prolongée d’ECMO, optimisation procédurale et prévention des dommages de plusieurs organes sont d’une importance cruciale. Le but du présent protocole est de présenter une technique détaillée d’une ECMO veino-veineuse dans un non-intubés, respirant spontanément des souris. Ce protocole illustre la conception technique de l’ECMO et étapes chirurgicales. Ce modèle murin d’ECMO facilitera l’étude de la physiopathologie associé à ECMO (p. ex., inflammation, événements hémorragiques et thromboemboliques). En raison de l’abondance des souris génétiquement modifiées, les mécanismes moléculaires impliqués dans les complications liées à l’ECMO peuvent également être disséqués.

Introduction

Oxygénation extracorporelle (ECMO) est un système de support de vie temporaire qui reprend les fonctions des poumons et cœur pour permettre la perfusion et échanges gazeux adéquat. Hill et al.¹ décrit la première utilisation de l’ECMO chez les patients en 1972 ; Cependant, il seulement est devenu employé couramment après sa candidature est retenue au cours de la grippe H1N1 en 2009². Aujourd'hui, l’ECMO est régulièrement utilisée comme une procédure de sauvetage dans le coeur de terminale et de maladies pulmonaires³. ECMO veino-veineuse est plus en plus employée comme alternative à une ventilation mécanique invasive dans éveillé, non-intubés, respirant spontanément des patients présentant une insuffisance respiratoire réfractaire⁴.

Malgré son adoption généralisée, diverses complications ont été signalées pour ECMO^5,6,7. Les complications qui peuvent être vécues par les patients sous ECMO incluent hémorragie, thrombose, septicémie, thrombocytopénie, dysfonctionnements liés au dispositif et embolie gazeuse. En outre, un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) dommages multi-organes est bien décrit, tant sur le plan clinique et des études expérimentales^8,9. Complications neurologiques tels qu’infarctus du cerveau sont également fréquemment rapportées chez les patients suivant une thérapie à long terme de l’ECMO. Pour compliquer les questions, il est souvent difficile de distinguer si les complications sont provoquées par ECMO lui-même ou surviennent des troubles sous-jacents accompagnant aiguë et maladies de terminale.

Etudier précisément les effets d’une ECMO sur un organisme en bonne santé, un modèle animal expérimental fiable s’impose. Il y a très peu de rapports sur le rendement d’une ECMO sur petits animaux et sont tous limités à des rats. A ce jour, aucun modèle de souris de l’ECMO n’a été décrite dans la littérature. En raison de la disponibilité d’un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiées, mise en place d’un modèle de souris ECMO permettrait davantage investigation des mécanismes moléculaires impliqués dans les complications liées à l’ECMO^10,11.

Basés sur notre modèle murin décrite précédemment extra-corporelle (CEC)¹², nous avons développé une méthode stable ECMO veino-veineuse dans non-intubés, respirant spontanément des souris. Le circuit ECMO (Figure 1), contenant les flux sortant et canules d’afflux, pompe péristaltique, oxygénateur et réservoir d’air-piégeage, est similaire à notre modèle décrit antérieurement de murin CPB¹² , à l’exception d’avoir un amorçage plus petit volume (0,5 mL). Ce protocole montre les techniques détaillées, monitorage physiologique et analyse des gaz sanguins impliqué dans une procédure d’ECMO réussie.

Protocole

Des expériences ont été effectuées sur des souris C57BL/6 mâles, âgés de 12 semaines. Cette étude a été réalisée conformément aux directives de la loi allemande de Animal sous protocole TSA 16/2250.

1. matériel préparation

Remarque : Toutes les étapes sont effectuées dans des conditions propres, non stériles. Il faudrait des conditions stériles si l’animal doit être survécu après l’opération.

1. Introduire 3 fenestrations dans un tube polyuréthane 2-Fr en utilisant une lame chirurgicale sous une loupe avec un grossissement de 16 X.
   Remarque : Tous les fenestrations doivent se trouver dans le tiers distal de la canule pour assurer un drainage sanguin optimal.
2. Préparer la solution d’amorçage (Table des matières). Parmi 30 UI/mL héparine et 2,5 % v/v d’une solution de 8,4 % de NaHCO₃. Réfrigérer cette solution à 4 ° C jusqu'à ce qu’il est prêt à l’emploi. Réamorcer le circuit avec 500 uL de solution d’amorçage.
3. Placer la canule de sortie dans la solution d’amorçage et remplir la machine en activant la pompe péristaltique. Continuer à faire circuler la solution d’amorçage par le biais de la machine pendant le prochaine 30 min à un débit de 1 mL/min.
4. Donne 0,5 L/min d’oxygène de 100 % à l’oxygénateur.

2. anesthésie

1. Place l’animal dans une chambre à induction rempli d’un mélange d’isoflurane/oxygène 2.5 % v/v. Fournir 0,5 L/min d’oxygène de 100 % pour le vaporisateur. Avant l’opération, vérifier que l’anesthésie complète est obtenue en testant les réflexes de retrait et de la douleur pédales. Appliquer le gel ophtalmique pour éviter d’endommager de séchage.
2. Utiliser un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à 37 ° C.
3. Réaliser l’anesthésie de masque d’inhalation à l’aide d’un vaporisateur isoflurane et injecter le carprofène 5 mg/kg par voie sous-cutanée.
4. Observer la respiration spontanée et régulièrement ajuster la concentration d’isoflurane, afin qu’il soit entre 1,3 et 2,5 %.

3. chirurgie

1. Exposer la veine jugulaire gauche à l’aide d’une incision de la peau latérale de 4 mm à l’aide de ciseaux fines sur le côté gauche du cou. Avec tranchant et contondant préparation à l’aide de tampons de coton et micro-pinces, utiliser la coagulation bipolaire des petits vaisseaux.
2. Une fois la veine jugulaire gauche affleure, ligaturer la partie distale à l’aide d’une suture de soie de 8-0 avec l’aide de micro-pinces.
3. Placez un noeud de glissement à l’extrémité proximale de la veine. Inciser la paroi antérieure de la veine à l’aide de micro-ciseaux.
4. Pour atteindre la pleine héparinisation, injecter héparine 2,5 UI/g dans la veine jugulaire via un braunula de 26 G.
5. Soulever le côté tête du pad animal de 30° pour éviter la perte excessive de sang de la veine lors de l’insertion de la canule.
6. Insérer une canule (PU) en polyuréthane de 2-Fr dans la partie proximale de la veine jugulaire, tournant légèrement tout en poussant à une profondeur de 4 cm ; Ce faisant, la bifurcation iliaque de la veine cave inférieure (VCI) sera atteint.
7. Fixer la canule avec noeuds de soie 8-0 à l’aide des Micropinces.
8. Exposer la veine jugulaire droite en suivant les étapes décrites dans 3.1, 3.2 et 3.3.
9. Cathétériser la veine jugulaire droite avec une canule de PU 1-Fr et déplacez-la doucement 5 mm dans la direction de l’oreillette droite.
10. Répétez l’étape 3,7.
11. Section de l’artère fémorale gauche avec un autre canule de PU 1-Fr et utilisez-le pour invasive de la pression de surveillance ainsi que des prélèvements pour analyse des gaz sanguins (BGA).
12. Emmancher électrocardiogramme (ECG) connecté à un périphérique d’acquisition de données par voie sous-cutanée dans les deux pattes avant et dans la paroi thoracique gauche.
13. Insérez un thermomètre rectal, connecté à un périphérique d’acquisition de données.

4. oxygénation extracorporelle veino-veineuse et analyse des gaz sanguins

Remarque : Pour une représentation schématique du circuit ECMO complet, voir la Figure 1.

1. Initier une ECMO sur l’animal en activant la pompe avec un débit initial de 0,1 mL/min. ajuster le débit de la pompe dans les prochaine 2 min à 3 à 5 mL/min.
2. En cas d’aspiration d’air dans la canule de sortie via le site de canulation, réduire la circulation et ajouter 0,1 mL de solution d’amorçage du circuit via un réservoir d’air-piégeage.
3. Sous flux stable, continuent de surveiller en temps réel tous les paramètres vitaux via le matériel d’acquisition de données.
4. Constamment observer disconnecteur du drainage veineux et de surveiller le niveau du sang dans le réservoir d’air-trapper.
5. Recueillir le sang suinte du plaies dans une seringue de 1 cc avec la pointe d’un G 24 branula andreturn il au circuit ECMO par le réservoir d’air-piégeage.
6. Pour BGA, utiliser une cartouche de prélèvement d’échantillons de sang pour collecter environ 75 µL de sang artériel aux points suivants de temps et à partir des emplacements suivants :
   1. 10 min après l’ouverture de l’ECMO, recueillir le sang de l’IVC via un tube supplémentaire construit en avant de l’oxygénateur, par l’intermédiaire de tube supplémentaire analogue après oxygénateur (contrôle) et directement de l’artère fémorale.
   2. 30 min après l’ouverture de l’ECMO, recueillir le sang de l’artère fémorale.
7. Donner une supplémentaire 0,1 mL de solution d’amorçage pour compenser la perte liquide intravasal toutes les 45 min via l’air-trappeur ou un cathéter dans l’artère fémorale ou en suçant les bulles d’air dans la canule de drainage sanguin.
8. Pour BGA, utiliser une cartouche de prélèvement d’échantillons de sang pour collecter environ 75 µL de sang artériel :
   1. 1 h après l’ouverture d’une ECMO de l’artère fémorale.
   2. 2 h après le début de l’ECMO, recueillir le sang de l’IVC via un tube supplémentaire construit en avant de l’oxygénateur, par l’intermédiaire de tube supplémentaire analogue après oxygénateur (contrôle) et directement de l’artère fémorale.
9. Après 2 h, réduire le débit de la pompe progressivement (au cours de 5 min), donc arrêt ECMO.
10. Continuent d’enregistrer des paramètres vitaux pendant 10 min.
11. Terminer l’expérience en exsanguinating de l’animal et la récolte du sang et des organes.

Résultats

Ce protocole décrit la méthode de l’ECMO veino-veineuse chez une souris. Ce modèle est fiable et reproductible et par rapport à notre modèle décrit antérieurement de CEC avec arrêt respiratoire et circulatoire^12,13, il est moins techniquement difficile à établir.

ECMO débit dans le système veineux a été maintenu entre 1.5 et 5 mL/min. La pression artérie...

Discussion

Nous avons décrit précédemment, un modèle réussi de la DGPC dans une souris^12,13. Pour mettre en œuvre un tel modèle pour aiguë ou des troubles pulmonaires de terminale nous avons développé un circuit ECMO veino-veineuse de facile à utiliser pour la souris. Différentes du modèle de la DGPC, veino-veineuse ECMO n’exige pas des interventions chirurgicales complexes comme sternotomie et clampage de l’aorte, réduisant ainsi le risque de blessure sai...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterofundin	B.Braun Petzold GmbH	PZN:8609189	in 1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 05565416	in 1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000	Ratiopharm GmbH	PZN: 3029843	2,5 IU per ml of priming
NaHCO3 8,4% Solution	B. Braun Melsungen AG	PZN: 1579775	3% in priming solution
Carprofen	Zoetis Inc., USA	PZN:00289615	5mg/kg/BW
1 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C10PU-MCA1301	carotide artery
2 Fr PU Catheter	Instechlabs INC., USA	C20PU-MJV1302	jugular vein
8-0 Silk suture braided	Ashaway Line & Twine Co., USA	75290	ligature
Isoflurane	Piramal Critical Care GmbH	PZN:9714675	narcosis
Spring Scissors - 6mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15020-15	instruments
Spring Scissors - 2mm Blades	Fine Science Tools GmbH	15000-03	instruments
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools GmbH	13009-12	instruments
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools GmbH	11295-51	instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm	Fine Science Tools GmbH	12060-02	instruments
Micro Serrefines	Fine Science Tools GmbH	18555-01	instruments
Bulldog Serrefine	Fine Science Tools GmbH	18050-28	instruments
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1	Drägerwerk AG & Co. KGaA		anesthesia 1,3 -2,5%
Multichannel Data Aquisition Device with ISOHEART Software	Hugo Sachs Elektronik GmbH, Germany		invasive pressure, ECG, t °C
i-STAT portable device	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
i-STAT CG4+ and CG8+ cartridges	Abbott Laboratories, Lake Bluff, Illinois, USA		blood gas analysis
C57Bl/6 mice, male, 30 g, 14 weeks old	Charles River Laboratories		housed 1 week before