银纳米粒子法改善小鼠胆道闭锁综合征

摘要

本文详细介绍了一种基于银纳米颗粒改善胆道闭锁综合征的实验性胆道闭锁小鼠模型的方法。对试剂制备过程和新生儿小鼠注射技术的深入了解将有助于使研究人员熟悉新生儿模型研究中使用的方法。

摘要

胆道闭锁 (BA) 是一种严重的胆管炎, 儿童死亡率高, 病因仍未完全了解。病毒感染可能是一个可能的原因。用恒河轮状病毒接种新生鼠, 建立了研究 BA 的典型动物模型。银纳米颗粒已被证明发挥抗菌和抗病毒作用;本研究对其在 BA 小鼠模型中的作用进行了评价。目前, 在 ba 动物实验中, 用于改善 ba 小鼠症状的方法通常是通过食物或其他药物提供的对症治疗。本研究旨在通过腹腔注射银纳米颗粒, 为改善小鼠 BA 综合征提供一种新的方法, 并为制备银纳米颗粒凝胶配方提出详细的方法。该方法简便, 应用广泛, 可用于研究 BA 的机理及临床治疗。基于 BA 小鼠模型, 当小鼠表现出黄疸时, 制备的银纳米颗粒凝胶被注射腹腔到下肝表面。观察了生存状态, 并对生化指标和肝脏组织病理学进行了研究。这种方法可以更直观地了解 ba 模型的建立和新的 ba 处理。

引言

BA 是一种以持续性黄疸为特征的胆汁淤积的形式, 在没有肝移植的情况下死亡率较高。病毒感染与 BA 的发病机制密切相关。巨细胞病毒、呼肠病毒和轮状病毒都被认为是 BA^1、2、3的病原体。在新生儿期, 未成熟的免疫系统对病毒感染的反应导致免疫失调对肝内胆管的影响, 导致胆道上皮细胞凋亡, 门内炎性细胞浸润区, 肝内和肝外胆管梗阻, 最后, 肝纤维化^4,5,6。

BA 研究中常用的动物模型涉及使用恒河轮状病毒 (RRV) 接种新生鼠。小鼠通常在 5-6 天后发展黄疸, 显示低体重和 acholic 凳子。免疫反应在疾病过程中的作用是至关重要的, 特别是对于自然杀伤性细胞;这些细胞与 anti-NKG2D 抗体的耗尽极大地减少了 BA 引起的伤害⁷。此外, 其他细胞, 包括 CD4⁺ t 细胞, CD8⁺ t 细胞, 树突状细胞和调节 T 细胞, 都已被证明在疾病^8,9,10,11发挥作用。所有数据都表明了免疫系统在 BA 过程中的不可缺少的性质。

银纳米颗粒 (AgNPs) 已被证明对某些传染性疾病有有益的效果, 包括细菌感染¹²和病毒^{感染 13,14,15}。然而, 除了皮肤病的使用, 很少有研究使用 AgNPs 在临床治疗, 主要是因为他们的潜在毒性。在动物实验中, 研究人员通常通过口服¹⁶或静脉注射方法来研究 AgNPs 的功效¹⁷。然而, 没有其他研究人员研究过腹腔 (AgNPs) 注射液对新生儿小鼠实验的疗效, 这是一种简单而快速的方法, 可直接影响肝脏和胆管, 同时减少对其他系统的毒性, 如免疫系统。AgNPs 已显示影响 NK 细胞活性¹⁸;因此, 我们测试了 AgNPs 在 BA 小鼠模型中通过ip 注射治疗的效果。

研究方案

所有动物实验规程均已由中山大学动物中心 (#IACUC DB-16-0602) 的机构畜牧护理和使用委员会批准。

1. 建立胆道闭锁小鼠模型

1. 保持怀孕的 BALB 小鼠在一个特定的无病原环境下的12小时黑暗/光循环在25摄氏度下, 使用蒸压的周广告随意。
2. 要准备 RRV 菌株 MMU 18006, 放大 MA104 细胞中的病毒, 并通过斑块测定¹⁹测定病毒滴度。
   注: MA104 细胞在杜尔贝科的改良老鹰培养基 (DMEM) 中培养, 10% 胎牛血清 (FBS) 在一个孵化器中, 含有 5% CO₂的加湿气氛。下面简要介绍了放大步骤。
   1. 感染 MA104 细胞 (1.5 x 10⁷) 在150厘米²培养烧瓶与胰蛋白酶激活 RRV [1.5 x 10⁶斑块形成单位 (PFU)] 在30毫升的无血清培养基。在37摄氏度的加湿孵化器中孵育3天的受感染细胞, 5% CO₂。
   2. 裂解在培养瓶中被感染的细胞由三冻融循环, 20 分钟在-80 摄氏度冰柜为每个冻结阶段, 然后, 解冻细胞回室温;细胞相关的病毒粒子将释放到上清。然后, 收集和转移细胞裂解液和培养上清到一个15毫升锥形管。
   3. 通过低速离心去除裂解液中的大细胞碎片 (300 x g在4摄氏度, 3 分钟)。然后, 将含有病毒 (约6毫升) 的上清液转移到一个新的15毫升锥形管中进行动物实验。
      注意: RRV 然后准备被 titered, 按, 并存储或用于额外的一轮放大。长期暴露在室温下会降低病毒感染能力;病毒应放置在冰上, 储存在-80 摄氏度或液氮中。
3. 将 RRV 装入小体积 (1 毫升) 胰岛素注射器, 用 29 G 针注射新生儿鼠标。
   注: 容积式注射器的粗针容易导致药物泄漏。
4. 在出生后24小时内,通过ip 线路管理每个新生儿20µL 1.2 x 10⁵ PFU/毫升 RRV;使用相同体积的盐水作为控制。
   注: 本实验中使用的注射器是1毫升胰岛素注射器。由于其他原因, 未被母亲喂食的受感染老鼠在分析中未包括在内, 因此在前2天内死亡。
5. 密切观察所有的新生小鼠, 每天称量它们。通常, 在 RRV 接种后的第六天, 黄疸出现在耳朵和裸露的皮肤上, 凳子变成粘土色, 毛皮变得油腻, 建议建立 BA 模型;检查这些症状。
   注: BA 可通过肝组织切片检查与 H & E 和免疫组化说明确认。然后, BA 老鼠就可以 AgNP 治疗了。
   警告: 所提供的协议适用于当代动物和人类 RV 菌株, 必须在生物安全级别 2 (BSL-2) 条件下处理。

2. 银纳米颗粒合成

1. 准备和表征 AgNPs 如前所述^12,20。
   注: 在香港大学化学系的 c.m. (AgNPs) 的研究小组在刊物上介绍了有关制备及表征该等资料的详情.溶液的最终浓度为 1 mM。AgNPs 的平均直径为 10 nm (范围5至 15 nm), 经电子显微镜证实。

3. 银纳米胶原蛋白混合物的制备

注: AgNP 胶原蛋白混合物的制备和特点如前所述²¹和存储在4摄氏度。所有程序必须在冰上执行。

1. 首先, 为胶原蛋白制剂, 添加490µL i 型胶原蛋白 (4 毫克/毫升) 到1.5 毫升管, 并把它放在冰上。
2. 添加100µL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS, 10x) 到胶原蛋白, 并将其与移液器混合。
   1. 要准备 1 L 10x PBS 缓冲器, 结合80克氯化钠, 2 克氯化钾, 和 35.8 g Na₂HPO₄^.12H₂O 至 2.4 g₂PO₄并在室温下存储缓冲器。
3. 然后, 将10µL 的氢氧化钠 (0.2 M) 添加到上述解决方案中。
   1. 为制备 0.2 M 氢氧化钠, 将8克氢氧化钠粉末添加到蒸馏水的 1 L。
4. 最后, 将400µL 的 AgNPs (1 毫米) 添加到胶原蛋白中, 并将其与移液器混合。
   注: 添加 AgNPs 最后一个均匀混合。AgNP 胶原蛋白混合物应贮存在4摄氏度;否则, 在室温下很容易凝固。

4. 鼠标注射方法

1. 在治疗后的 RRV 组中使用50µL 的 AgNP 胶原蛋白混合物, 在黄疸出现后, 对受感染的新生小鼠进行管理;在 3 d 以后执行第二次注射。
   注意: 控制 RRV (受感染控制) 组中的小鼠的生理盐水数量相同, 正常对照组的小鼠未得到任何治疗。
2. 在注射开始时, 用无名指斜过右大腿按压鼠标的腿, 并以15°角缓慢地引入针头 (图 1)。当到达肝脏的下边缘表面 (图 2), 大约0.5 厘米, 注射 AgNP 胶原蛋白混合物;然后, 慢慢地取出针头。
   注意: 小心不要将任何空气引入注射器中, 否则, 新生老鼠可能会被杀死。在新生小鼠中, 胃和脾在左腹部, 胃里满是牛奶。如果注射从这一侧, 针头可以很容易地进入胃, 导致牛奶流入腹腔, 或脾脏, 导致出血。
   小心: 注意针头, 以防止任何手指损伤, 并确保更换针帽, 取出针头, 并将其放置在锐形容器中。
3. 所有注射后, 将老鼠从笼子里取出10分钟, 使 AgNP 胶原蛋白混合物凝胶, 防止母亲舔注射部位。然后, 把老鼠送回笼子里。
4. 观察和记录所有小鼠每天的外貌, 包括黄疸和体重, 以及存活率。

5. 血液样本采集

注: 通过将针头插入心脏, 收集大约120µL 的血液样本。离心后, 采集血清 (约70µL) 进行肝脏功能测试。血液收集方法如下。

1. 在 RRV 接种后的九和第十二天麻醉小鼠 (AgNP 治疗后3天) 使用 0.5-2.5% 七氟醚。
2. 固定老鼠的四肢, 用75% 酒精消毒上腹部和下腹。
3. 用剪刀将小鼠皮肤、肌肉和腹膜沿中线切开, 使隔膜暴露在剑突上;使用无菌棉签去除胃肠道, 充分暴露膈肌。
4. 插入针头 (用1毫升卸载的胰岛素注射器) 进入心脏的左心室, 慢慢地拉回注射器柱塞, 以获得最大的血量。然后, 将血液转移到1.5 毫升管。
5. 允许管子在室温下站立30分钟, 在 400 x g处离心5分钟。然后, 使用转移移液器, 收集并保存血清以供进一步使用。
   注意: 避免损坏隔膜, 因为隔膜缺陷容易导致气胸、死亡和血液凝固, 从而防止血液标本采集。

6. 生化参数检测

1. 使用步骤5.5 中收集的血清进行生化参数检测。
2. 使用自动生化分析仪检测以下生化参数: 丙氨酸转氨酶 (ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶 (AST)、碱性磷酸酶 (ALP)、总蛋白 (TP)、白蛋白 (ALB)、球蛋白 (TBIL)、总胆红素 ()、直接胆红素 (DBIL), 间接胆红素 (IBIL) 和总胆汁酸 (TBA)。

7. 肝外胆道造影观察肝外胆管通畅

注: 在解剖显微镜下执行整个过程。

1. 用棉签充分暴露肝脏、胆囊和肝外胆管。
2. 在解剖显微镜下观察和拍摄肝脏和胆管的外观。
3. 用眼科镊子轻轻握住胆囊底部。
4. 加载1毫升注射器与亚甲基蓝溶液 (0.05 重量% 在 H₂O)。将注射器针慢慢插入胆囊腔;然后, 用眼科钳抓住针头, 慢慢注入亚甲基蓝的10–20µL。
5. 在显微镜下观察是否蓝颜色通过肝外胆管到空肠, 并拍摄照片。

8. 苏木精和伊红染色的新鲜肝标本的收集

1. 修复新鲜的老鼠肝组织在10% 福尔马林过夜。
2. 然后, 将固定肝组织嵌入石蜡切片中。
3. 脱蜡部分, 用乙醇系列 (如100%、95%、80% 和70% 乙醇在蒸馏水中补充水分, 每5分钟), 用苏木精染色组织切片, 并将其与1% 盐酸乙醇区分, 最后, 染色带伊红的部分。
4. 最后, 在40X 显微镜下观察肝脏的组织病理学。

9. 苏木精和伊红染色组织切片的免疫组化染色

1. 脱蜡和再水化切片后, 通过将三 EDTA 缓冲液中的部分浸入 (10 毫米的碱基, 1 毫米 EDTA 溶液; pH 9.0) 并在微波加热10分钟 (95 摄氏度), 进行抗原检索。
2. 通过将组织切片暴露在3% 过氧化氢溶液中, 去除内源过氧化物酶10分钟。
3. 用5% 山羊血清治疗切片, 阻断非特异性结合。
4. 将一抗兔鼠 NKG2D (1:100) 添加到节中, 并在4摄氏度的夜间孵育。
5. 在室温下, 用适当的二抗 (HRP 标记的聚合物抗兔系统) 孵育切片30分钟。
6. 使用 33 '-diaminobenzidine (DAB) 作为色原, 可视化免疫组织化学染色。
7. 观察40X 显微镜下的剖面, 获取图像, 并根据需要进行分析。

10. 流量式细胞术分析

1. 轻轻切碎肝脏组织, 通过70µm 细胞过滤器, 并离心它2x 在 270 x g在4摄氏度4分钟。
2. 在 RPMI 1640 培养基中重悬细胞颗粒, 并用单克隆抗体对其进行双色免疫荧光分析。
3. 使用特定的细胞表面标记, 包括荧光素异氰酸酯和藻红蛋白共轭 anti-NKp46 (NK 淋巴细胞; 1:1, 000) 和 anti-CD4 (T 细胞亚型; 1:1, 000) 进行细胞分型, 并分析数据采用流式细胞仪数据分析软件。
4. 根据前向/侧散点选择细胞种群, 根据同种型控制栅格来考虑任何背景荧光, 并根据单个抗体的荧光信号将数据进行二次分析。

结果

在建立了 BA 小鼠模型的基础上, 对受感染的新生小鼠进行了 AgNP 胶原蛋白混合物的2x 注射, 显示黄疸。每日检查小鼠存活率, 进行肝功能检查、肝病理学和流式细胞术。与未经治疗的对照 BA 小鼠相比, AgNP 治疗的小鼠黄疸减少, 维持正常体重 (图 3)。胆红素代谢和肝转氨酶水平下降到正常控制值, 表明 AgNPs 大大改善肝功能 (表 1)。肝外胆管?...

讨论

AgNPs 表现出较强的广谱抗菌性能和强渗透率²²;此外, 它们还用于生产一系列抗菌医疗产品²³。然而, AgNPs 可能需要很长的时间来清除, 一旦他们积聚在器官, 这种持久性可能导致毒性作用^24,25。在一项大鼠实验中, 对 AgNPs 的急性毒性和遗传毒性进行了研究, 结果表明 AgNPs 可引起急性肝肾损伤。AgNPs 在主要免疫系统器官中?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only