Forma de nanopartículas de plata para paliar el síndrome de Atresia biliar en ratones

Resumen

Este artículo describe detalladamente un método basado en nanopartículas de plata para paliar el síndrome de atresia biliar en un modelo experimental de atresia biliar en ratones. Una sólida comprensión del proceso de preparación de reactivos y la técnica de inyección neonatal ratón ayudará a familiarizar a los investigadores con el método utilizado en estudios con ratones neonatales modelo.

Resumen

Atresia biliar (BA) es un tipo grave de colangitis con alta mortalidad en los niños de que la etiología es todavía no comprendida. Las infecciones virales pueden ser una posible causa. El típico modelo animal utilizado para el estudio de BA se establece por inocular un ratón neonatal con un rotavirus de rhesus. Nanopartículas de plata se ha demostrado para ejercer efectos antibacterianos y antivirales; en este estudio se evaluó su función en el modelo de ratón de BA. Actualmente, en experimentos con animales BA, los métodos utilizados para mejorar los síntomas de los ratones de BA son tratamientos sintomáticos generalmente dada a través de alimentos o a otros medicamentos. El objetivo de este estudio es para demostrar un nuevo método para paliar el síndrome de BA en ratones por la inyección intraperitoneal de nanopartículas de plata y para proporcionar métodos detallados para la preparación de la formulación de gel de nanopartículas de plata. Este método es simple y ampliamente aplicable y se puede utilizar para investigar el mecanismo de BA, así como en tratamientos clínicos. Basado en el modelo de ratón de BA, cuando los ratones presentan ictericia, el gel de nanopartículas de plata preparada se inyecta por vía intraperitoneal a la superficie del hígado más bajo. Se observa el estado de supervivencia, y se examinan los indicadores bioquímicos y la histopatología hepática. Este método permite una comprensión más intuitiva de ambos el establecimiento del modelo de BA y nuevos tratamientos de BA.

Introducción

BA es una forma de colestasis caracterizada por ictericia persistente y tiene alta mortalidad en ausencia de trasplante hepático. Las infecciones virales están estrechamente asociadas con la patogénesis de BA. El citomegalovirus, reovirus y rotavirus se han sugerido como patógenos en BA^1,2,3. Durante el período neonatal, la respuesta del sistema inmune inmaduro a una infección viral produce dysregulation inmune contra extra - e intrahepáticos biliares, conduce a la apoptosis de la célula epitelial biliar, infiltración de células inflamatorias en el portal área, obstrucción del conducto biliar intrahepático y extrahepático y por último, fibrosis hepática^4,5,6.

El modelo animal utilizado para estudios de licenciatura implica la inoculación del ratón neonatal con el rotavirus de rhesus (RRV). El ratón normalmente desarrolla ictericia después de 5-6 días, mostrando un bajo peso corporal y heces acólicas. El papel de la respuesta inmune en el proceso de la enfermedad es fundamental, especialmente para las células naturales del asesinas (NK); el agotamiento de estas células con el anticuerpo anti-NKG2D reduce considerablemente el daño provocado por el BA⁷. Además, otras células, incluyendo CD4⁺ T células de CD8,⁺ T las células, las células dendríticas y células T reguladoras, han demostrado que desempeñan un papel en la enfermedad^8,9,10,11. Todos los datos sugieren el carácter imprescindible del sistema inmune en el curso de BA.

Nanopartículas de plata (AgNPs) se han demostrado para tener efectos beneficiosos contra algunas enfermedades infecciosas, incluyendo infecciones bacterianas¹² y las infecciones virales^13,14,15. Sin embargo, que no sean de uso dermatológico, pocos estudios han utilizado AgNPs en un tratamiento clínico, sobre todo debido a su potencial toxicidad. En experimentos con animales, los investigadores generalmente han estudiado la eficacia de AgNPs administrado via oral¹⁶ o métodos intravenosos¹⁷. Sin embargo, otros investigadores no han estudiado la eficacia de AgNPs administrado mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) en ratones neonatales experimentos, que es un método simple y rápido hacia un efecto más directo sobre el hígado y vías biliares mientras que la reducción de la toxicidad a otros sistemas, como el sistema inmunológico. AgNPs se han demostrado para afectar NK célula actividad¹⁸; por lo tanto, hemos probado los efectos terapéuticos de AgNPs administrado vía inyección i.p. en el modelo de ratón de BA.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales de animales han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité uso del Sun Yat-sensor del laboratorio Animal Centro Universitario (#IACUC-DB-16-0602).

1. establecer el modelo de ratón de Atresia biliar

1. Mantener embarazadas ratones BALB/c en un ambiente libre de patógenos específico en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 25 ° C, con acceso a autoclave chow ad libitum.
2. Para preparar la cepa RRV MMU 18006, amplifican el virus en células MA104 y medir los títulos virales por un ensayo de placa¹⁹.
   Nota: Las células MA104 se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% suero fetal bovino (FBS) en una incubadora con una atmósfera humidificada con 5% CO₂. Los pasos de amplificación se describen brevemente a continuación.
   1. Infectar células MA104 (1,5 x 10⁷) en un matraz de cultivo de 150 cm² con RRV activada por tripsina [1.5 x 10⁶ unidades formadoras de placa (PFU)] en 30 mL de medio sin suero. Incube las células infectadas durante 3 días en un incubador humedecido a 37 ° C con 5% CO₂.
   2. Lisar las células infectadas en el frasco de cultura por tres ciclos de congelación y descongelación, con 20 minutos en un congelador de-80 ° C para congelación de cada fase y, luego, descongelar las células a temperatura ambiente; la partícula de virus asociado a células se liberan en el sobrenadante. A continuación, recoger y transferir el lisado de célula y cultivo sobrenadante a un tubo cónico de 15 mL.
   3. Retire detritos celulares gran lisado por centrifugación a baja velocidad (300 x g a 4 ° C por 3 min). Luego, transferir el sobrenadante que contiene el virus (aproximadamente 6 mL) en un nuevo tubo cónico de 15 mL para los experimentos con animales.
      Nota: El RRV es entonces listo para ser dosificado, alícuotas y almacenado o utilizado para rondas adicionales de amplificación. La exposición prolongada a temperatura ambiente reducirá la capacidad de infección viral; el virus debe ser colocado sobre hielo y almacenado a-80 ° C o en nitrógeno líquido.
3. Carga del RRV en una insulina de pequeño volumen (1 mL) jeringa con una aguja 29 G para la inyección de ratón neonatal.
   Nota: Las gruesas agujas de jeringas volumétricas conducen fácilmente a la salida de la droga.
4. Dentro de las 24 h del nacimiento, administrar a cada recién nacido 20 μl de 1.2 x 10⁵ RRV PFU/mL a través de la ruta i.p.; utilizar el mismo volumen de solución salina como control.
   Nota: La jeringa utilizada en este experimento es una jeringa de insulina 1 mL. Ratones infectados que no fueron alimentados por sus madres murieron en los primeros 2 días debido a otras razones no fueron incluidos en el análisis.
5. Observar de cerca todos los ratones neonatales y pesarlos diariamente. Por lo general, en el sexto día después de la inoculación del RRV, ictericia aparece en los oídos y la piel desnuda, el taburete se convierte en color de la arcilla y la piel se convierte en grasa, lo que sugiere el establecimiento del modelo BA; Echale un vistazo a estos síntomas.
   Nota: BA se puede confirmar por un examen de sección de tejido del hígado con H & E e immunohistochemical indicando. Los ratones BA entonces están listos para el tratamiento de AgNP.
   PRECAUCIÓN: El protocolo presentado es para uso con contemporáneo animales y humanas RV cepas, que debe ser manejado en condiciones de bioseguridad nivel 2 (BSL-2).

2. síntesis de nanopartículas de plata

1. Preparar y caracterizar el AgNPs descrita^12,20.
   Nota: Los detalles de la preparación y caracterización de las AgNPs se han descrito en publicaciones por equipo del C. M. Che en el Departamento de química, Universidad de Hong Kong^12,20. La concentración de la solución final fue de 1 mM. El diámetro medio de las AgNPs fue 10 nm (que van de 5 a 15 nanómetro) y confirmadas por microscopia electrónica.

3. preparación de la mezcla de plata de nanopartículas de colágeno

Nota: La mezcla de colágeno de AgNP es preparada y caracterizada como descrito previamente²¹ y almacenados a 4 ° C. Todos los procedimientos deben realizarse en hielo.

1. En primer lugar, para la elaboración de colágeno, añadir 490 μl de tipo I colágeno (4 mg/mL) a un tubo de 1,5 mL y coloque en hielo.
2. Añada 100 μl de solución salina con tampón fosfato (PBS, 10 x) para el colágeno y mezclar con una pipeta.
   1. Para preparar 1 L de tampón de PBS 10 x, combinar 80 g de NaCl, 2 g de KCl y 35,8 g de Na₂HPO₄^. 12H₂O 2,4 g de KH₂PO₄ y tienda el buffer a temperatura ambiente.
3. A continuación, añadir 10 μl de NaOH (0,2 M) a la solución anterior.
   1. Para preparar 0,2 M NaOH, añadir 8 g de NaOH en polvo en 1 L de agua destilada.
4. Por último, añadir 400 μL de AgNPs (1 mM) que el colágeno y mezclar con una pipeta.
   Nota: Añadir las AgNPs última para una mezcla uniforme. La mezcla de colágeno de AgNP debe almacenarse a 4 ° C; de lo contrario, fácilmente se solidifica a temperatura ambiente.

4. método de inyección de ratón

1. Administrar los ratones neonatales infectados en el grupo tratado del RRV con una inyección intraperitoneal de 50 μl de la mezcla de colágeno de AgNP después de la aparición de ictericia; realizar una segunda inyección 3 d más tarde.
   Nota: Los ratones del grupo control RRV (control infectado) reciben el mismo volumen de solución salina, y los ratones del grupo control normal no reciben ningún tratamiento.
2. Al comienzo de la inyección, presione la pierna del ratón con el dedo anular oblicuamente sobre el muslo derecho e introducir la aguja lentamente en un ángulo de 15° (figura 1). Al llegar a la superficie del borde inferior del hígado (figura 2), alrededor de 0,5 cm en, inyectar la mezcla de colágeno de AgNP; a continuación, retire la aguja lentamente.
   Nota: Tenga cuidado de no introducir aire en la jeringa como, entonces, el ratón neonatal puede ser matado. En ratones neonatales, el estómago y el bazo están en el abdomen izquierdo y el estómago está lleno de leche. Si la inyección se administra desde este lado, la aguja podría entrar fácilmente ya sea el estómago, causando leche a fluir en la cavidad abdominal o en el bazo, causando sangrado.
   Atención: Prestar atención a la aguja para prevenir cualquier lesión del dedo y asegúrese de sustituir el casquillo de la aguja, retire la aguja y coloque en un contenedor de objetos punzantes.
3. Después de todas las inyecciones, mantener los ratones fuera de sus jaulas durante 10 minutos permitir que la mezcla de colágeno de AgNP gel y para evitar que a la madre lamiendo el sitio de inyección. A continuación, volver a los ratones a sus jaulas.
4. Observar y registrar los aspectos físicos de todos los ratones diariamente, incluyendo ictericia y peso corporal, así como la tasa de supervivencia.

5. recogida de muestras de sangre

Nota: Se recogieron muestras de sangre de aproximadamente 120 μl insertando la aguja en el corazón. Después de la centrifugación, el suero es recogido (aproximadamente 70 μl) para las pruebas de función hepática. El método de recogida de sangre es la siguiente.

1. Anestesiar los ratones en el noveno y 12 día después de la inoculación de RRV (que es 3 días después del tratamiento de AgNP) con 0.5-2.5% de sevoflurano.
2. Inmovilizar las extremidades del ratón y esterilizar el abdomen superior e inferior con alcohol al 75%.
3. Exponer la membrana cortando el ratón piel, músculo y peritoneo a lo largo de la línea media para el xifoides con tijeras; Utilice un hisopo de algodón estéril para retirar el tracto gastrointestinal para exponer completamente el músculo diafragma.
4. Insertar la aguja (con una jeringa de 1 mL insulina descargado) en el ventrículo izquierdo del corazón y lentamente tire hacia atrás el émbolo de la jeringa para obtener el volumen máximo de sangre. A continuación, transferir la sangre a un tubo de 1,5 mL.
5. Deje el tubo durante 30 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 5 min a 400 x g. Luego, utilizando una pipeta de transferencia, recoger y guardar el suero para su uso posterior.
   Nota: Evite dañar el diafragma, como diafragma defectos fácilmente llevan a neumotórax, coagulación de la sangre, evitando así la recolección de muestras de sangre y muerte.

6. bioquímicos parámetro detección

1. Uso el suero recogido en el paso 5.5 para la detección de parámetros bioquímicos.
2. Utilice un analizador bioquímico automatizado para detectar los siguientes parámetros bioquímicos: alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP), proteína total (PT), albúmina (ALB), globulina (GLO), bilirrubina total (TBIL) bilirrubina directa (DBIL), bilirrubina indirecta (IBIL) y los ácidos biliares totales (TBA).

7. extrahepática colangiografía para observar la permeabilidad de la vía biliar extrahepática

Nota: Realice todo el proceso bajo un microscopio de disección.

1. Exponga completamente el hígado, vesícula biliar y conductos biliares extrahepáticos con un hisopo de algodón.
2. Observar y fotografiar el aspecto del hígado y vías biliares bajo un microscopio de disección.
3. Use fórceps oftálmicos para sostener suavemente la parte inferior de la vesícula biliar.
4. Cargar una jeringa de 1 mL con solución de azul de metileno (0.05 wt.% en H₂O). Lentamente Inserte la aguja de la jeringa en la cavidad de la vesícula biliar; a continuación, sujete la aguja con el fórceps oftálmico e infundir lentamente 10-20 μl de azul de metileno.
5. Observar bajo el microscopio si el azul pasa a través de los conductos biliares extrahepáticos en yeyuno y tomar una fotografía.

8. colección de muestras de hígado frescas de hematoxilina y eosina

1. Fijar el ratón fresco tejidos del hígado durante la noche en formalina al 10%.
2. A continuación, incrustar los tejidos hígados fijados en parafina y les sección.
3. Dewax las secciones, rehidratar con una serie de etanol (como el etanol 100%, 95%, 80% y 70% en agua destilada, cada 5 min), mancha las secciones de tejido con hematoxilina, someterlas a una diferenciación de alcohol de ácido clorhídrico 1% y por último, la mancha la secciones con eosina.
4. Finalmente, observar la histopatología del hígado bajo un microscopio X 40.

9. Immunohistochemical la coloración de la Hematoxylin y las secciones eosina-manchadas del tejido

1. Después de desparafinado y rehidratar las secciones, realizar una recuperación de antígeno sumergiendo las secciones en tampón Tris-EDTA (10 mM Tris base, solución de EDTA 1 mM; pH 9.0) y calentarlos en el microondas durante 10 minutos a 95 ° C.
2. Retire la peroxidasa endógena exponiendo las secciones de tejido por 10 min a una solución de peróxido de hidrógeno al 3%.
3. Tratar las secciones con 5% de suero de cabra, para bloquear el atascamiento no específico.
4. Añadir anticuerpos primarios de conejo ratón NKG2D (1: 100) las secciones e incúbelos durante la noche a 4 ° C.
5. Incubar las secciones con los anticuerpos secundarios apropiados (sistema de anti-conejo polímero marcado con HRP) durante 30 min a temperatura ambiente.
6. Visualizar la coloración de immunohistochemical usando 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) como cromógeno.
7. Observar las secciones bajo el microscopio X 40, adquisición de imágenes y proceder a analizar como se desee.

10. el análisis cytometric del flujo de

1. Suavemente el tejido del hígado, pasan a través de un tamiz celular de 70 μm, para y centrifugarlo 2 x 270 x g a 4 ° C durante 4 minutos.
2. Resuspender el precipitado de células en Medio RPMI 1640 y analizar por dos colores inmunofluorescencia utilizando anticuerpos monoclonales.
3. Realizar fenotipaje celular usando marcadores de superficie celular específicos, incluyendo fluoresceína isotiocianato y ficoeritrina conjugado anti-NKp46 (linfocitos NK; 1:1, 000) y anti-CD4 (subtipo de células T; 1:1, 000), con un citómetro de flujo y análisis de datos con software de análisis de datos de citometría de flujo.
4. Seleccionar las poblaciones celulares según dispersión hacia delante o lateral, puerta según los controles de isotipo para explicar cualquier fluorescencia de fondo y someter los datos a un análisis secundario basado en las señales de fluorescencia de anticuerpos individuales.

Resultados

Basado en el modelo de ratón BA establecido, los ratones neonatales infectados se administraron una inyección i.p. de la mezcla preparada de AgNP colágeno 2 x después de que la ictericia. Supervivencia del ratón fue revisada para diario, y se realizaron pruebas de función hepática, patología del hígado y citometría de flujo. En comparación con los ratones de control sin tratar BA, los ratones tratados con AgNP demostraron ictericia reducida y mantienen su peso corporal normal (...

Discusión

AgNPs exhiben potentes propiedades antibacterianas de amplio espectro y una permeabilidad fuerte²²; Además, se utilizan para producir una gama de productos médicos antibacteriano²³. Sin embargo, AgNPs puede tomar mucho tiempo para borrar una vez que se acumulan en órganos, y esta persistencia puede conducir a efectos tóxicos^24,25. Un estudio examinó la toxicidad aguda y genotoxicidad de AgNPs después de una in...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only