שיטת ננו-חלקיק כסף Ameliorating בהכנת בכיס המרה תסמונת בעכברים

Summary

מאמר זה מתאר בפירוט שיטה המבוססת על סילבר חלקיקים עבור ameliorating בהכנת בכיס המרה תסמונת במודל עכבר ניסיוני בהכנת בכיס המרה. הבנה עמוקה של תהליך הכנה ריאגנט ואת טכניקת ההזרקה neonatal העכבר יסייע להכיר חוקרים השיטה שבה נעשה שימוש במחקרים דגם העכבר neonatal.

Abstract

בהכנת בכיס המרה (BA) הוא סוג חמור של דרכי המרה עם תמותה גבוהה אצל ילדים אשר האטיולוגיה עדיין לא לגמרי מובן. זיהומים נגיפיים יכול להיות אחת הסיבות האפשריות. המודל בעלי חיים אופייני בשימוש ללמוד תואר ראשון נקבע לפי מזריקים עם בנגיף רזוס העכבר neonatal. סילבר חלקיקים הוכחו להפעיל אפקטים אנטי-בקטריאליים וויראליים; תפקידם במודל עכבר BA מוערך במחקר זה. כיום, בניסויים על בעלי חיים BA, האמצעים שננקטו כדי לשפר את הסימפטומים של BA עכברים הם טיפולים בדרך כלל סימפטומטי ניתן דרך מזון או תרופות אחרות. מטרת מחקר זה היא להפגין שיטה חדשה עבור ameliorating BA תסמונת בעכברים על ידי הזרקה בקרום הבטן של סילבר חלקיקים מספקים נתונים היסטוריים שיטות להכנת ננו-חלקיק כסף ניסוח ג'ל. שיטה זו פשוט וקל החלים נרחב והוא יכול לשמש כדי לחקור את המנגנון של בואנוס איירס, כמו גם טיפולים קליניים. בהתבסס על המודל העכבר BA, כאשר העכברים התערוכה צהבת, הג'ל ננו-חלקיק כסף מוכן מוזרק intraperitoneally אל פני השטח של הכבד נמוכה יותר. הוא ציין את מצב הישרדות, אינדיקטורים הביוכימי, histopathology כבד נבדקים. שיטה זו מאפשרת הבנה אינטואיטיבית יותר של שניהם על הקמת דגם BA וטיפולים חדשניים BA.

Introduction

BA היא צורה של לחסימת מרה תוך כבדית מאופיין צהבת מתמשכת וכוללת תמותה גבוהה בהיעדרו של השתלת כבד. זיהומים נגיפיים קשורים קשר הדוק בפתוגנזה של בואנוס איירס. Cytomegalovirus, reovirus ו בנגיף כל שהוצעו פתוגנים BA^1,2,3. במהלך תקופת neonatal, התגובה של המערכת החיסונית לא בשלה זיהום ויראלי תוצאות dysregulation מחוסן נגד צינורות המרה נוספת - ו intrahepatic, המוביל אפופטוזיס בכיס המרה תא אפיתל, חדירה לתא דלקתי בפורטל אזור, חסימת צינור המרה intrahepatic ו extrahepatic, ולבסוף, פיברוזיס בכבד-^4,-^5,-⁶.

המודל בעלי חיים הנפוצים ללימודי תואר ראשון מערב את חיסון של עכבר neonatal עם בנגיף רזוס (RRV). העכבר בדרך כלל מתפתחת צהבת אחרי 5-6 ימים, מציג משקל גוף נמוך ושרפרפים acholic. תפקידו של התגובה החיסונית של תהליך המחלה הוא קריטי, במיוחד עבור הרוצח הטבעיים (NK) תאים; דלדול של תאים אלה עם נוגדן anti-NKG2D מקטינה באופן משמעותי את הנזק BA-induced⁷. יתר על כן, לשני תאים, כולל CD4⁺ T תאים, התאים CD8⁺ T תאים תאים דנדריטים, תאי T רגולטוריים, כל הוכחו ממלאים תפקידים^10,119,8,המחלה. כל הנתונים מראים הטבע הכרחית של המערכת החיסונית במהלך תואר ראשון.

סילבר חלקיקים (AgNPs) הוכחו להיות השפעות מועיל נגד מחלות זיהומיות מסוימות, כולל זיהומים חיידקיים¹² וזיהומים וירליים^13,14,15. עם זאת, מלבד השימוש דרמטולוגיים, מחקרים מעטים השתמשו AgNPs בטיפול קליני, בעיקר בגלל רעילות פוטנציאלית שלהם. בניסויים על בעלי חיים, החוקרים למדו בדרך כלל את היעילות של AgNPs ניתנת דרך הפה¹⁶ או שיטות תוך ורידי¹⁷. עם זאת, אין חוקרים אחרים למדו את היעילות של AgNPs מנוהל באמצעות זריקה בקרום הבטן (i.p.) neonatal עכבר ניסויים, מה שיטה פשוטה ומהירה שמוביל השפעה ישירה יותר על הכבד ועל צינורות המרה בזמן הפחתת רעילותם למערכות אחרות, כגון מערכת החיסון. AgNPs הוכחו להשפיע על פעילות תאי NK¹⁸; לכן, בדקנו את ההשפעות הטיפוליות של AgNPs מנוהל באמצעות הזרקת i.p. במודל עכבר BA.

Protocol

כל הפרוטוקולים ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של סון יאט-סן מעבדה חיה המרכז האוניברסיטאי (#IACUC-DB-16-0602).

1. יצירת המודל העכבר בהכנת בכיס המרה

1. לשמור על עכברים BALB/c בהריון סביבה נטולת פתוגן מסוים תחת מחזור כהה/אור 12 שעות ב- 25 ° C, עם גישה צ'או בלוק ad libitum.
2. כדי להכין את המתח RRV יחידת ניהול זיכרון 18006, להגביר את הוירוס בתאים MA104 ולמדוד את titers ויראלי מאת assay לוח¹⁹.
   הערה: MA104 תאים מתורבתים במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% עוברית שור סרום (FBS) בתוך אינקובטור עם אווירה humidified המכילה 5% CO₂. השלבים הגברה מתוארים בקצרה להלן.
   1. להדביק תאים MA104 (1.5 x 10⁷) בבקבוקון תרבות² 150 ס"מ עם מופעל טריפסין RRV [1.5 x 10⁶ ויוצרים רובד יחידות (PFU)] ב30 מ"ל של מדיום ללא סרום. דגירה התאים הנגועים במשך 3 ימים ב- חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO₂.
   2. Lyse התאים הנגועים הבקבוקון התרבות על ידי שלושה מחזורים ההקפאה-הפשרה, עם 20 דקות במקפיא-80 ° C עבור הקפאת כל שלב ובחזרה, ואז מפשיר את התאים בטמפרטורת החדר; החלקיק וירוס תא-הקשורים תשחרר לתוך תגובת שיקוע. לאחר מכן, לאסוף ולהעביר את התא lysate והתרבות supernatant לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
   3. הסרת לכלוך הסלולר גדול מ- lysate על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (300 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות). לאחר מכן, להעביר את תגובת שיקוע המכילים את הנגיף (כ- 6 מ"ל) לתוך צינור חרוטי 15 mL החדש לניסויים בבעלי חיים.
      הערה: RRV זה אז מוכנים להיות titered, aliquoted, ו מאוחסנת או משמש סיבובים נוספים של הגברה. חשיפה ארוכת טווח לטמפרטורת החדר תפחית את קיבולת זיהום ויראלי; הנגיף צריך ניתן להציב על קרח ו המאוחסן ב- 80 ° C או בחנקן נוזלי.
3. טען RRV לתוך אינסולין בנפח מצומצם (1 מ"ל) מזרק עם מחט ג'י 29 עבור הזריקה העכבר neonatal.
   הערה: המחטים בעובי של מזרקים הנפחי בקלות להוביל בריחת סמים.
4. בתוך 24 שעות של לידה, לנהל את כל µL neonate 20 של 1.2 x 10⁵ PFU/mL RRV דרך המסלול i.p.; השתמש באותו אמצעי אחסון של תמיסת מלח של הפקד.
   הערה: המזרק השתמשו בניסוי זה הוא מזרק אינסולין 1 מ"ל. עכברים נגועים לא מוזנים על ידי אימותיהם מתו בתוך הימים הראשונים 2 מסיבות אחרות לא נכללו בניתוח.
5. להתבונן מקרוב כל העכברים neonatal, לשקול אותם מדי יום. בדרך כלל, ביום השישי לאחר חיסון RRV, צהבת מופיע על אוזניים, עור חשוף, השרפרף הופך בצבע חימר, ואת הפרווה הופך שומני, רומז על הקמת דגם BA; בדוק אם יש סימפטומים אלו.
   הערה: BA יכול להיות מאושרות על ידי בדיקה של מקטע רקמת הכבד עם H & E והצגתן immunohistochemical. העכברים BA מוכנים ואז לטיפול AgNP.
   התראה: פרוטוקול שהוצג הוא לשימוש עם עכשווית חיה ואנושית RV זנים, אשר חייבים להיות מטופלים בתנאים אבטחה ברמה 2 (BSL-2).

2. כסף סינתזה ננו-חלקיק

1. להכין ולאפיין את AgNPs כפי שתואר לעיל^12,20.
   הערה: הפרטים של הכנת ואפיון של AgNPs תוארו בפרסומים על ידי הצוות של צ'ה סי מ- במחלקה לכימיה, אוניברסיטת הונג קונג^12,20. הריכוז הסופי של הפתרון היה 1 מ מ. הקוטר אכזרי של AgNPs בת 10 ננומטר (החל 5-15 ננומטר) אושרה על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים.

3. הכנת התערובת כסף קולגן ננו-חלקיק

הערה: התערובת קולגן AgNP מוכן, מאופיין כפי שתואר קודם לכן²¹ ומאוחסנים ב 4 º C. כל ההליכים חייב להתבצע על קרח.

1. ראשית, לשם הכנת קולגן, להוסיף µL 490 של מסוג קולגן (4 מ"ג/מ"ל) לרכבת התחתית 1.5 mL ומניחים אותו על קרח.
2. להוסיף 100 µL של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, 10 x) הקולגן ומערבבים אותו עם פיפטה.
   1. להכנת 1 ליטר של 10 x PBS מאגר, לשלב 80 גר' של NaCl, g 2 של אשלגן כלורי ו- g 35.8 נה₂HPO₄^. 12 שעות₂O ל- 2.4 g₂פו ח'₄ , חנות המאגר בטמפרטורת החדר.
3. לאחר מכן, להוסיף 10 µL של NaOH (0.2 מ') הפתרון שלעיל.
   1. כדי להכין 0.2 M NaOH, להוסיף 8 גרם של אבקת NaOH 1 ליטר של מים מזוקקים.
4. לבסוף להוסיף 400 µL של AgNPs (1 מ מ) הקולגן, לערבב אותם עם פיפטה.
   הערה: להוסיף את AgNPs אחרונה מיקס אפילו. התערובת קולגן AgNP צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C; אחרת, זה בקלות עפור בטמפרטורת החדר.

4. העכבר הזרקת שיטה

1. לנהל את העכברים neonatal נגוע בקבוצה RRV שטופלו עם זריקה i.p. של 50 µL של התערובת קולגן AgNP לאחר הופעת צהבת; לבצע השני זריקה בתלת-ממד מאוחר יותר.
   הערה: העכברים קבוצת הבקרה (בקרת נגוע) RRV ניתנות באותו אמצעי אחסון של תמיסת מלח, העכברים בקבוצת הביקורת נורמלי לא מקבלים כל טיפול.
2. בהתחלה של הזריקה, הקש על הרגל של העכבר עם הקמיצה בעקיפין על ירך רגל ימין, להציג את המחט לאט בזווית של 15° (איור 1). כשמגיעים השטח של הקצה התחתון של הכבד (איור 2), כ- 0.5 ס מ ב, להזריק את התערובת קולגן AgNP; . ואז, מסירים את המחט לאט.
   אם כך, הערה: היזהרו שלא להציג את כל האוויר לתוך המזרק כמו העכבר neonatal עלולים להיהרג. בעכברים neonatal, הבטן וה טחול הן בבטן השמאלית, הקיבה הוא מלא חלב. אם הזריקה ניתנת מהצד הזה, המחט יכלו להיכנס בקלות גם הקיבה, גורם החלב לזרום לתוך חלל הבטן, או הטחול, גרימת דימום.
   התראה: לב המחט כדי למנוע פציעות אצבע, הקפד להחליף את מכסה המחט, הסר את המחט, ולמקם אותו במיכל החדים.
3. אחרי כל הזריקות, לשמור על העכברים מהכלובים שלהם למשך 10 דקות לאפשר את התערובת קולגן AgNP ג'ל, ולמנוע את האמא מליקוק ההזרקה. לאחר מכן, להחזיר את העכברים לכלובים.
4. לצפות ולהקליט המראה הפיזי של כל העכברים מדי יום, כולל צהבת, משקל הגוף, כמו גם שיעור ההישרדות.

5. דם לטעום אוסף

הערה: דגימות הדם של µL כ-120 נאספים על ידי החדרת המחט לתוך הלב. לאחר צנטריפוגה, הסרום הוא שנאספו (כ 70 µL) לבדיקת תפקודי כבד. שיטת איסוף דם היא כדלקמן.

1. עזים ומתנגד העכברים ביום התשיעי וה-12 לאחר חיסון RRV (אשר 3 ימים לאחר הטיפול AgNP) באמצעות 0.5-2.5% sevoflurane.
2. לשתק את הגפיים של העכבר ולחטא את הבטן העליונים והתחתונים עם 75% אלכוהול.
3. לחשוף את הסרעפת על ידי חיתוך העכבר עור, שריר, צפק לאורך הקו האמצעי כדי מצאתי עם מספריים; השתמש ספוגית כותנה סטרילי כדי להסיר את מערכת העיכול לחשוף באופן מלא את שריר הסרעפת.
4. הכנס את המחט (עם מזרק אינסולין לפרוק 1 מ"ל) לתוך החדר השמאלי של הלב, לאט לאט למשוך בחזרה על הבוכנה מזרק כדי להשיג את נפח הדם המרבי. לאחר מכן, העבר את הדם צינור 1.5 מ.
5. לאפשר את הצינור לעמוד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, centrifuge זה עבור 5 דקות ב 400 x g. לאחר מכן, באמצעות פיפטה העברה, לאסוף ולשמור את הנסיוב לשימוש נוסף.
   הערה: למנוע נזק הסרעפת, כמו דיאפרגמה פגמים בקלות להוביל חזה אוויר, מוות, קרישת דם, ובכך מונע את האוסף דגימת דם.

6. איתור פרמטרים ביוכימיים

1. השתמש את הנסיוב שנאספו בשלב 5.5 עבור זיהוי פרמטרים ביוכימיים.
2. השתמש של מנתח הביוכימי אוטומטית כדי לזהות את הפרמטרים הביוכימי הבאים: אלנין aminotransferase (ALT), aminotransferase אספרטט (AST), אלקליין פוספטאז (ALP), הכוללת חלבון (TP), אלבומין (ALB), גלובולין (GLO), הכולל בילירובין (TBIL), בילירובין ישיר (DBIL), בילירובין עקיף (IBIL) ו חומצות מרה הכולל (יפורסם בהמשך).

7. extrahepatic Cholangiography להתבונן Patency צינור המרה Extrahepatic

הערה: בצע את התהליך כולו תחת מיקרוסקופ לנתיחה.

1. מלא לחשוף את הכבד, כיס המרה, extrahepatic צינורות המרה באמצעות מקלון צמר גפן.
2. להתבונן ולצלם את המראה של הכבד, צינורות המרה תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
3. להשתמש מלקחיים אופטלמולוגיות לאחוז בעדינות את החלק התחתון של כיס המרה.
4. לטעון מזרק 1 מ"ל עם פתרון מתילן כחול (0.05 wt.% H₂O). לאט לאט את המחט מזרק לתוך חלל כיס המרה; לאחר מכן, תופסים את המחט עם המלקחיים אופטלמולוגיות, לאט להשרות 10 – 20 µL של מתילן כחול.
5. להתבונן במיקרוסקופ אם הצבע הכחול עובר צינורות המרה extrahepatic מעי צם, לצלם.

8. אוסף של דוגמאות כבד טרי Hematoxylin ו אאוזין מכתים

1. את העכבר טרי רקמות כבד בן לילה בפורמלין 10%.
2. לאחר מכן, להטביע את רקמות הכבד קבוע פרפין, סעיף אותם.
3. Dewax הסעיפים נתרענן אותם עם סדרות אתנול (כגון אתנול 100%, 95%, 80% ו- 70% במים מזוקקים, כל אחד למשך 5 דקות), כתם הסעיפים רקמות עם hematoxylin, מעמיד אותם בפני חומצת מלח 1% אלכוהול הבחנה, בסופו של דבר, מכתים סעיפים עם אאוזין.
4. לבסוף, לבחון את histopathology של הכבד תחת מיקרוסקופ X 40.

9. נוגדן של Hematoxylin ואת מקטעי רקמה צבעונית-אאוזין

1. לאחר dewaxing rehydrating הסעיפים, לבצע אחזור של אנטיגן על-ידי השוקע הסעיפים במאגר טריס-EDTA (בסיס טריס 10 מ מ, פתרון EDTA 1 מ"מ; pH 9.0) וחימום אותם במיקרוגל למשך 10 דקות ב 95 ° C.
2. הסר peroxidase אנדוגני ע י חשיפת הסעיפים רקמות 10 דקות לפתרון חמצן 3%.
3. פנקו את הסעיפים עם סרום עיזים 5%, כדי לחסום את הכריכה לא ספציפית.
4. הוספת נוגדנים העיקרי ארנב-העכבר NKG2D (1: 100) על המקטעים, דגירה אותם בן לילה ב 4 º C.
5. דגירה הסעיפים עם נוגדנים משניים המתאים (פולימר התווית על-ידי HRP ארנב נגד המערכת) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. דמיינו את נוגדן באמצעות 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) כמו chromogen.
7. להתבונן הסעיפים תחת מיקרוסקופ X 40, לרכוש תמונות ולהמשיך לנתח אותם כרצונכם.

10. זרימה Cytometric ניתוח

1. בעדינות מינצ רקמת הכבד, להעביר את זה דרך מסננת תא מיקרומטר 70 ו centrifuge זה 2 x-x 270 גרם ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
2. Resuspend בגדר תא RPMI 1640 בינוני ולנתח אותם על-ידי immunofluorescence שני צבעים באמצעות נוגדנים חד-שבטיים.
3. לבצע phenotyping הסלולר באמצעות סמנים תא-פני ספציפיים, כולל fluorescein isothiocyanate - ו phycoerythrin-מצומדת אנטי-NKp46 (NK לימפוציטים; 1:1, 000) ו anti-CD4 (סוג של תא T; 1:1, 000), עם cytometer זרימה ולנתח את הנתונים עם תוכנת ניתוח של נתונים cytometry זרימה.
4. בחר תא אוכלוסיות על-פי העבר לצד פיזור, השער בהתאם isotype בקרת חשבון עבור כל זריחה רקע והנושא את הנתונים כדי ניתוח משני המבוסס על האותות זריחה של נוגדנים בודדים.

תוצאות

בהתבסס על המודל העכבר BA הוקמה, העכברים neonatal נגוע נוהלו זריקה i.p. של התערובת קולגן AgNP מוכן 2 x לאחר שהציגה צהבת. העכבר הישרדות היה ייבדק יומית, בוצעו בדיקות תפקודי כבד, כבד, מחלות cytometry זרימה. בהשוואה לעכברים BA שליטה ללא טיפול, העכברים שטופלו AgNP הראה צהבת מופחתת ומתוחזק משקל גו...

Discussion

AgNPs שהפגינו אנטיבקטריאליות חזקות נגד בקטריה, חדירות חזקות²²; בנוסף, הם משמשים כדי לייצר מגוון של מוצרים רפואיים אנטי בקטריאלי²³. עם זאת, AgNPs יכול לקחת זמן רב כדי לנקות פעם הם נצברים באיברים, התמדה זה עלול להוביל ההשפעות הרעילות^24,25. מחק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only