Un metodo delle nanoparticelle d'argento per il miglioramento di sindrome di Atresia biliare nei topi

Riepilogo

Questo articolo viene descritto in dettaglio un metodo basato su nanoparticelle d'argento per il miglioramento di sindrome di atresia biliare in un modello murino di atresia biliare sperimentale. Una solida comprensione del processo di preparazione del reagente e la tecnica di iniezione neonatale del mouse vi aiuterà a familiarizzare i ricercatori con il metodo utilizzato in studi di modello del mouse neonatale.

Abstract

Atresia biliare (BA) è un tipo severo di colangite con alto tasso di mortalità nei bambini di cui l'eziologia ancora completamente non è capita. Le infezioni virali possono essere una causa possibile. Il tipico modello animale utilizzato per lo studio di BA è stabilito inoculando un mouse neonatale con un rotavirus rhesus. Nanoparticelle d'argento sono state indicate per esercitare gli effetti antivirali e antibatterici; la loro funzione nel modello del topo di BA viene valutata in questo studio. Attualmente, negli esperimenti sugli animali BA, i metodi utilizzati per migliorare i sintomi dei topi BA sono generalmente sintomatici trattamenti somministrati tramite cibo o altri farmaci. Lo scopo di questo studio è di dimostrare un nuovo metodo per il miglioramento di sindrome di BA in topi tramite l'iniezione intraperitoneale di nanoparticelle d'argento e di fornire metodi dettagliati per preparare la formulazione in gel di nanoparticelle d'argento. Questo metodo è semplice e ampiamente applicabile e può essere utilizzato per ricercare il meccanismo di BA, così come nei trattamenti clinici. Basato su modello del topo di BA, quando i topi presentano ittero, il gel preparati delle nanoparticelle d'argento è iniettato intraperitonealmente alla superficie del fegato inferiore. Si osserva lo stato di sopravvivenza, e gli indicatori biochimici e l'istopatologia del fegato sono esaminati. Questo metodo consente una comprensione più intuitiva di entrambi l'istituzione del modello BA e trattamenti novelli BA.

Introduzione

BA è una forma di colestasi caratterizzata da ittero persistente e ha elevata mortalità in assenza di trapianto del fegato. Le infezioni virali sono strettamente associate con la patogenesi di BA. Il citomegalovirus, reovirus e rotavirus sono stati suggeriti come agenti patogeni in BA^1,2,3. Durante il periodo neonatale, la risposta del sistema immunitario immaturo ad un'infezione virale provoca dysregulation immune contro dotti biliari extra - e intraepatiche, che portano all'apoptosi delle cellule epiteliali biliari, infiltrazione infiammatoria delle cellule nel portale zona, ostruzione dei dotti biliari intraepatici ed extrahepatic e infine, fibrosi del fegato^4,5,6.

Il modello animale comunemente usato per gli studi di BA coinvolge l'inoculazione di un mouse neonatale con i rotavirus rhesus (RRV). Il mouse si sviluppa tipicamente ittero dopo 5-6 giorni, mostrando un basso peso corporeo e feci acoliche. Il ruolo della risposta immunitaria nel processo di malattia è fondamentale, soprattutto per le cellule natural killer (NK); l'esaurimento di queste cellule con l'anticorpo anti-NKG2D riduce notevolmente i danni indotti su BA⁷. Inoltre, altre cellule, compreso CD4⁺ T cellule, CD8⁺ T cellule, cellule dendritiche e cellule di T regolarici, sono state indicate per svolgere i ruoli nella malattia^8,9,10,11. Tutti i dati suggeriscono il carattere indispensabile del sistema immunitario nel corso della BA.

Nanoparticelle d'argento (AgNPs) sono state dimostrate per avere effetti benefici contro alcune malattie infettive, tra cui infezioni batteriche¹² e infezioni virali^13,14,15. Tuttavia, diverso da quello d'uso dermatologico, pochi studi hanno utilizzato AgNPs in un trattamento clinico, soprattutto a causa della loro potenziale tossicità. Negli esperimenti sugli animali, i ricercatori hanno studiato in generale l'efficacia di AgNPs somministrato via orale¹⁶ o endovenosa metodi¹⁷. Tuttavia, nessun altri ricercatori hanno studiato l'efficacia di AgNPs somministrato tramite un'iniezione intraperitoneale (i.p.) nel topo neonatale esperimenti, che è un metodo semplice e veloce che conduce ad un effetto più diretto sul fegato e vie biliari mentre riducendo la tossicità di altri sistemi, quali il sistema immunitario. AgNPs hanno dimostrato di influenzare l' attività delle cellule NK¹⁸; di conseguenza, abbiamo testato gli effetti terapeutici di AgNPs somministrato tramite iniezione i.p. nel modello del topo di BA.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali animali sono stati approvati dal comitato di uso del Sun Yat-Sen University laboratorio animale centro (#IACUC-DB-16-0602) e istituzionali Animal Care.

1. che stabilisce il modello del Mouse di Atresia biliare

1. Mantenere incinto topi BALB/c in un ambiente privo di agente patogeno specifico nell'ambito di un ciclo di buio/luce 12 h a 25 ° C, con accesso a chow in autoclave ad libitum.
2. Per preparare il ceppo RRV MMU 18006, amplificare il virus nelle cellule MA104 e misurare i titoli virali da una placca dosaggio¹⁹.
   Nota: MA104 cellule sono coltivate in mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) in un'incubatrice con atmosfera umidificata contenente 5% CO₂. I passaggi di amplificazione sono brevemente descritte di seguito.
   1. Infettare le cellule MA104 (1,5 x 10⁷) in un matraccio di cultura² cm 150 con tripsina attiva RRV [1.5 x 10 unità formanti placca⁶ (PFU)] in 30 mL di medium senza siero. Incubare le cellule infettate per 3 giorni in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂.
   2. Lisare le cellule infettate nella beuta di cultura da tre cicli di gelo e disgelo, con 20 min in un congelatore a-80 ° C per ciascuno congelare fase e, quindi, lo scongelamento le cellule nuovamente a temperatura ambiente; la particella virale associato rilascerà nel surnatante. Quindi, di raccogliere e trasferire il lysate delle cellule e il supernatante di coltura in una provetta conica da 15 mL.
   3. Rimuovere grandi detriti cellulari dal lisato mediante centrifugazione a bassa velocità (300 x g a 4 ° C per 3 min). Poi, trasferire il surnatante contenente il virus (circa 6 mL) in una nuova provetta conica 15 mL per gli esperimenti sugli animali.
      Nota: Il RRV quindi è pronto per essere titolato, aliquotati e memorizzati o utilizzati per ulteriori cicli di amplificazione. L'esposizione prolungata a temperatura ambiente può ridurre la capacità di infezione virale; il virus dovrebbe essere posti su ghiaccio e conservato a-80 ° C o in azoto liquido.
3. Carico il RRV in un'insulina di piccolo volume (1 mL) siringa con un ago 29 G per l'iniezione del mouse neonatale.
   Nota: Gli aghi spessi di siringhe volumetriche facilmente conducono a perdita di droga.
4. Entro 24 h dalla nascita, somministrare a ogni neonato 20 µ l di 1.2 x 10⁵ PFU/mL RRV tramite i.p. itinerario; utilizzare lo stesso volume di soluzione fisiologica come controllo.
   Nota: La siringa utilizzata in questo esperimento è una siringa da insulina 1 mL. Topi infetti che non sono stati alimentati dalle loro madri sono morte entro i primi 2 giorni a causa di altri motivi non sono stati inclusi nell'analisi.
5. Osservare da vicino tutti i topi neonatali e pesare tutti i giorni. In genere, il sesto giorno dopo l'inoculazione di RRV, ittero compare sulle orecchie e pelle nuda, lo sgabello diventa color argilla, e la pelliccia diventa oleosa, suggerendo l'istituzione del modello BA; Verifica per questi sintomi.
   Nota: BA può essere confermata da un esame della sezione di tessuto epatico con H & E e immunohistochemical affermando. I topi di BA sono quindi pronti per il trattamento di AgNP.
   Attenzione: Il protocollo presentato è per l'utilizzo con contemporanee ceppi RV animali ed umani, che devono essere manipolati in condizioni di livello 2 di biosicurezza (BSL-2).

2. sintesi delle nanoparticelle d'argento

1. Preparare e caratterizzare il AgNPs come descritto in precedenza^12,20.
   Nota: I dettagli della preparazione e che caratterizzano il AgNPs sono stati descritti nelle pubblicazioni dal team di C. M. Che presso il dipartimento di chimica, Università di Hong Kong^12,20. La concentrazione finale della soluzione era di 1 mM. Il diametro medio della AgNPs era 10 nm (che vanno da 5 a 15 nm) e confermato da microscopia elettronica.

3. preparazione della miscela del collagene delle nanoparticelle d'argento

Nota: La miscela di collagene AgNP è preparata e caratterizzata come precedentemente descritto²¹ e conservato a 4 ° C. Tutte le procedure devono essere eseguite sul ghiaccio.

1. In primo luogo, per la preparazione di collagene, aggiungere 490 µ l di tipo I del collagene (4 mg/mL) in una provetta da 1,5 mL e posizionarlo sul ghiaccio.
2. Aggiungere 100 µ l di tampone fosfato salino (PBS, 10x) al collagene e mescolare con una pipetta.
   1. Per preparare 1 L di PBS di 10 x, unire 80 g di NaCl, 2 g di KCl e 35,8 g di Na₂HPO₄^. 12H₂O a 2,4 g di KH₂PO₄ e conservare il tampone a temperatura ambiente.
3. Quindi, aggiungere 10 µ l di NaOH (0,2 M) per la soluzione di cui sopra.
   1. Per preparare 0.2 M NaOH, aggiungere 8 g di NaOH in polvere o 1 L di acqua distillata.
4. Infine, aggiungere 400 µ l di AgNPs (1 mM) al collagene e mescolarli con una pipetta.
   Nota: Aggiungere il AgNPs Ultima per una miscelazione anche. La miscela di collagene AgNP deve essere conservata a 4 ° C; in caso contrario, si solidifica facilmente a temperatura ambiente.

4. metodo di iniezione Mouse

1. Amministrare i topi infetti neonatali nel gruppo RRV curato con un'iniezione i.p. di 50 µ l della miscela di collagene AgNP dopo la comparsa di ittero; eseguire una seconda iniezione 3 d più tardi.
   Nota: I topi nel gruppo di controllo RRV (controllo infetti) abbiano lo stesso volume di soluzione fisiologica, e i topi nel gruppo di controllo normale non sono dato alcun trattamento.
2. All'inizio dell'iniezione, premere la gamba del mouse con il dito anulare obliquamente sopra la coscia destra e introdurre l'ago lentamente ad un angolo di 15° (Figura 1). Una volta raggiunta la superficie del bordo inferiore del fegato (Figura 2), circa 0,5 cm in, iniettare la miscela di collagene AgNP; quindi, ritirare l'ago lentamente.
   Nota: Fare attenzione a non introdurre aria nella siringa come, quindi, il mouse neonatale può essere ucciso. In topi neonatali, lo stomaco e la milza sono nell'addome di sinistra e lo stomaco è pieno di latte. Se l'iniezione è amministrata da questo lato, l'ago potrebbe facilmente entrare o la stomaco, provocando latte di fluire nella cavità addominale, o della milza, causando emorragie.
   Attenzione: Prestate attenzione all'ago per prevenire eventuali lesioni delle dita e assicurarsi di sostituire il cappuccio dell'ago, rimuovere l'ago e metterlo in un contenitore di sharps.
3. Dopo tutte le iniezioni, tenere i topi dalle loro gabbie per 10 minuti consentire la miscela di collagene AgNP al gel e per impedire che la madre leccare il sito di iniezione. Quindi, restituire i topi nelle loro gabbie.
4. Osservare e registrare le apparenze fisiche di tutti i topi di tutti i giorni, tra cui ittero e peso corporeo, come pure il tasso di sopravvivenza.

5. raccolta campioni ematici

Nota: I campioni di sangue di circa 120 µ l sono raccolti inserendo l'ago nel cuore. Dopo centrifugazione, il siero è raccolti (circa 70 µ l) per i test di funzionalità epatica. Il metodo di raccolta del sangue è come segue.

1. Anestetizzare i topi il nono e il 12 ° giorno dopo l'inoculazione di RRV (che è di 3 giorni dopo il trattamento di AgNP) utilizzando 0,5-2,5% sevoflurane.
2. Immobilizzare gli arti del mouse e sterilizzare l'addome superiore e inferiore con 75% di alcol.
3. Esporre il diaframma di taglio del mouse pelle, muscolo e peritoneo lungo la linea mediana per la xifoideo con le forbici; utilizzare un tampone di cotone sterile per rimuovere il tratto gastrointestinale per esporre completamente il muscolo diaframma.
4. Inserire l'ago (con una siringa da insulina scaricato 1ml) nel ventricolo sinistro del cuore e tirare lentamente indietro lo stantuffo della siringa per ottenere il volume massimo di sangue. Quindi, trasferire il sangue in una provetta da 1,5 mL.
5. Lasciare il tubo a riposare per 30 min a temperatura ambiente e si centrifuga per 5 min a 400 x g. Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento, raccogliere e salvare il siero per ulteriore uso.
   Nota: Evitare di danneggiare il diaframma, diaframma difetti facilmente conducono a pneumotorace, la morte e la coagulazione del sangue, impedendo così la raccolta del campione di sangue.

6. rilevamento dei parametri biochimica

1. Utilizzare il siero raccolti nel passaggio 5.5 per un rilevamento dei parametri biochimici.
2. Utilizzare un analizzatore biochimico automatico per rilevare i seguenti parametri biochimici: alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), fosfatasi alcalina (ALP), proteine totali (TP), albumina (ALB), globulina (GLO), bilirubina totale (TBIL), bilirubina diretta (DBIL), bilirubina indiretta (IBIL) e acidi biliari totali (TBA).

7. extrahepatic colangiografia per osservare la pervietà dei dotti biliari Extrahepatic

Nota: Eseguire l'intero processo sotto un microscopio di dissezione.

1. Esporre completamente il fegato, cistifellea e dotti biliari extrahepatic con un batuffolo di cotone.
2. Osservare e fotografare l'aspetto del fegato e vie biliari sotto un microscopio di dissezione.
3. Utilizzare pinze oftalmiche per premere delicatamente il fondo della cistifellea.
4. Caricare una siringa da 1 mL con una soluzione di blu di metilene (0,05 wt.% in H₂O). Inserire lentamente l'ago della siringa nella cavità della colecisti; quindi, afferrare l'ago con il forcipe oftalmico e infondere lentamente 10-20 µ l di blu di metilene.
5. Osservare al microscopio se il colore blu passa attraverso i dotti biliari extrahepatic al digiuno e prendere una fotografia.

8. raccolta di campioni di fegato freschi per ematossilina ed eosina

1. Difficoltà il mouse fresco tessuti del fegato durante la notte in formalina al 10%.
2. Quindi, incorporare i tessuti del fegato fissi in paraffina e sezione li.
3. Sparaffinatura le sezioni, reidratare loro con una serie di etanolo (come l'etanolo 100%, 95%, 80% e 70% in acqua distillata, ciascuna per 5 min), macchia le sezioni di tessuto con ematossilina, sottoporli a una differenziazione di alcool acido cloridrico 1% e infine, macchiare il sezioni con eosina.
4. Infine, osservare l'istopatologia del fegato sotto un microscopio X 40.

9. la macchiatura di Immunohistochemical ematossilina e eosina-macchiate del tessuto sezioni

1. Dopo deparaffinazione e reidratare le sezioni, è necessario eseguire un ricupero dell'antigene sommergendo le sezioni in tampone Tris-EDTA (10 mM Tris base, soluzione di EDTA 1 mM; pH 9.0) e li riscaldando in un forno a microonde per 10 min a 95 ° C.
2. Rimuovere perossidasi endogena esponendo le sezioni di tessuto per 10 min a una soluzione di perossido di idrogeno 3%.
3. Trattare le sezioni con 5% di siero di capra, di bloccare il legame non specifico.
4. Aggiungere gli anticorpi primari coniglio-mouse NKG2D (1: 100) per le sezioni e incubare per una notte a 4 ° C.
5. Incubare le sezioni con gli anticorpi secondari appropriati (sistema anti-coniglio di polimero HRP-etichetta) per 30 min a temperatura ambiente.
6. Visualizzare la macchiatura di immunohistochemical che usando 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) come cromogeno.
7. Osservare le sezioni sotto un microscopio X 40, acquisire immagini e procedere ad analizzarli come desiderato.

10. l'analisi Cytometric di flusso di

1. Tritare il tessuto epatico, passarlo attraverso un setaccio di cella di 70 µm e centrifugare e delicatamente 2 x 270 x g a 4 ° C per 4 min.
2. Risospendere il pellet cellulare nel medium RPMI 1640 e analizzarlo di immunofluorescenza di due colori usando gli anticorpi monoclonali.
3. Eseguire fenotipizzazione cellulare utilizzando specifici marcatori di superficie cellulare, tra cui della fluorescina isotiocianato - e ficoeritrina-coniugato anti-NKp46 (linfociti NK; 1:1, 000) e anti-CD4 (sottotipo di T-cellula; 1:1, 000), con un citometro a flusso e analizzare i dati con software di analisi dati di citometria a flusso.
4. Selezionare popolazioni di cellule secondo avanti/side scatter, cancello, secondo i controlli di isotipo di calcolare qualsiasi fluorescenza di fondo e sottoporre i dati a un'analisi secondaria basata sui segnali di fluorescenza da anticorpi individuali.

Risultati

Basato su modello del topo di BA stabilito, i topi infetti neonatali sono stati amministrati un'iniezione i.p. di al preparato di collagene AgNP 2 x dopo aver esposto l'ittero. Sopravvivenza del mouse è stato controllato per tutti i giorni, e sono stati eseguiti test di funzionalità epatica, patologia del fegato e citometria a flusso. Rispetto ai topi non trattati di controllo BA, i topi AgNP-trattati ha mostrato ridotta ittero e mantenuto la loro peso corporeo normale (

Discussione

AgNPs Mostre potenti proprietà antibatteriche ad ampio spettro e un forte permeabilitಲ; Inoltre, essi vengono utilizzati per produrre una gamma di prodotti medicali antibatterico²³. Tuttavia, AgNPs può richiedere molto tempo per cancellare una volta che si accumulano negli organi, e questa persistenza può portare a effetti tossici^24,25. Un precedente studio ha esaminato la tossicità acuta e la genotossicità ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only