쥐에서 담 즙이 폐쇄 증 증후군 장황 하는 실버 나노 방법

요약

이 문서는 장황 실험 담 즙이 폐쇄 증 마우스 모델에서 담 즙이 폐쇄 증 증후군에 대 한은 나노 입자에 따라 하는 방법을 자세하게에서 설명 합니다. 시 약 준비 과정 및 신생아 마우스 주입 기술을 이해 신생아 마우스 모델 연구에 사용 되는 방법에 익숙해지도록 연구 하는 데 도움이 됩니다.

초록

담 즙이 폐쇄 증 (바)의 병 인은 아직 완전히 이해 하는 아이 들에 있는 높은 사망률과 염의 심각한 유형입니다. 바이러스 성 감염 원인 중 하나 있을 수 있습니다. 학사 학위를 공부에 대 한 사용 되는 전형적인 동물 모델 붉은 털으로 타 바이러스와 신생아 마우스 접종으로 설정 됩니다. 나노 항균 및 항 바이러스 효과; 발휘 표시 되었습니다. 바 마우스 모델에서 그들의 기능은이 연구에서 평가 됩니다. 현재, 바 동물 실험, 바 쥐의 증상을 개선 하는 데 사용 하는 방법을 통해 음식이 나 다른 약물을 주어진 일반적으로 증상 치료입니다. 이 연구의 목적은 쥐에서 바 증후군은 나노 입자의 복 주입 장황 하는 새로운 방법을 설명 하 고은 나노 젤 배합을 준비 하기 위한 자세한 방법을 제공입니다. 이 메서드는 간단 하 고 광범위 하 게 적용 하며 바, 뿐만 아니라 임상 치료 메커니즘을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다. 쥐 전시 황 달 때 바 마우스 모델에 따라, 준비 된은 나노 젤 낮은 간 표면에 intraperitoneally 주입 됩니다. 생존 상태를 관찰 하 고 생화학 지표 및 간 histopathology 검사. 이 메서드는 두 바 모델 및 소설 바 트리 트 먼 트의 설립의 더 직관적인 이해를 수 있습니다.

서문

바는 cholestasis 영구적인 황 달 특징의 한 형태 이며, 간 이식의 부재에 높은 사망률을 있다. 바이러스 성 감염 바의 병 인에 밀접 하 게 연관 된다. 세포, reovirus, 그리고로 모두 바^1,2,3병원 균으로 제안 되었습니다. 추가-intrahepatic 및 담 관, 담 즙 상피 세포 apoptosis, 포털에서 선 동적인 세포 침투를 선도 대 한 면역 dysregulation 신생아 기간 동안 바이러스 감염에 대 한 미숙한 면역 시스템의 응답 결과 지역, intrahepatic 및 extrahepatic 담 관 방해, 그리고 마지막으로, 간 섬유 증^4,,56.

학사 연구에 대 한 일반적으로 사용 되 동물 모델에서는 붉은 털으로 타 바이러스 (RRV)와 신생아 마우스의 접종 합니다. 마우스는 일반적으로 낮은 몸 무게 및 acholic 변 5-6 일 후 황 달 개발. 질병 과정에서 면역 반응의 역할은 중요, 특히 자연적인 살인자 (NK) 세포; 안티 NKG2D 항 체로이 셀의 소모는 크게 바-손상⁷감소 시킨다. 게다가, 다른 세포, CD4 포함⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, 수지상 세포, 및 규정 하는 T 세포 모두 표시 되었습니다 질병^8,9,,1011에 역할을. 모든 데이터는 학사 과정에서 면역 시스템의 필수적인 자연 제안.

나노 (AgNPs)는 몇 가지 전염 성 질환, 세균 감염¹² 등 바이러스 감염^13,,1415에 대 한 유익한 효과를 입증 되었습니다. 그러나, 피부과 사용 이외의 몇 가지 연구는 사용 AgNPs 임상 치료에 그들의 잠재적인 독성 때문에 주로. 동물 실험에서 연구팀은 일반적으로 구두¹⁶ 통해 AgNPs 관리 또는 정 맥 주사 방법¹⁷의 효능을 공부 했다. 그러나, 다른 연구원 AgNPs 관리 통해 신생아 마우스에 복 (i.p.) 주사 실험을 간단 하 고 빠른 방법을 선도 하 고 간 및 담 즙 관 동안에 더 직접적인 영향의 효능 공부 면역 시스템과 같은 다른 시스템에 독성을 감소. AgNPs NK 세포 활동¹⁸; 영향을 보였다합니다 따라서, 우리는 바 마우스 모델에서 AgNPs 관리 통해 i.p. 주입의 치료 효과 시험 했다.

프로토콜

모든 동물 실험 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 Sun 야만 센 대학 실험실 동물 센터 (#IACUC-DB-16-0602)의 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 담 즙이 폐쇄 증 마우스 모델 구축

1. 압력가 마로 소독 차 우 광고 libitum에 대 한 액세스와 25 ° C에서 12 h 다크/라이트 사이클에서 특정 병원 체 자유로운 환경에서 임신 BALB/c 마우스를 유지.
2. 준비 하려면 RRV 스트레인 MMU 18006, MA104 세포에 바이러스를 증폭 하 고 상 패 분석 결과¹⁹바이러스 titers을 측정 한다.
   참고: MA104 셀 교양 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)에 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 인큐베이터에 함께 포함 된 5% CO₂습도 분위기. 증폭 단계는 간략하게 아래 설명 됩니다.
   1. MA104 세포를 감염 (1.5 x 10⁷) 30 ml 혈 청 자유로운 매체의 트립 신 활성화 RRV [1.5 x 10⁶ 플 라크 형성 단위 (PFU)]와 150 cm² 문화 플라스 크에. 5% CO₂와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에서 3 일 동안 감염 된 세포를 품 어.
   2. 각 단계를 동결 하 고, 셀 녹고 다시 실내 온도;-80 ° C 냉장고에서 20 분으로 3 그리고 freeze-thaw 주기에 의해 문화 플라스 크에 감염 된 세포를 lyse 셀 관련 바이러스 입자는 상쾌한에 발표할 예정 이다. 그런 다음, 수집 하 고 표면에 뜨는 문화와 세포 lysate 15 mL 원뿔 튜브로 전송.
   3. 저속 원심 분리 (300 x g 3 분 4 ° C에서)에 의해은 lysate에서 큰 세포질 파편을 제거 합니다. 그런 다음, 동물 실험에 대 한 새로운 15 mL 원뿔 튜브로 바이러스 (약 6 mL)를 포함 하는 상쾌한 전송.
      참고:는 RRV는 titered, aliquoted, 그리고 저장 또는 사용 확대의 추가 라운드에 대 한 준비 다음. 실내 온도에 장기간 노출; 바이러스 감염 용량을 감소 시킬 것 이다 바이러스와 얼음에 배치 한다-80 ° C에 또는 액체 질소에 저장.
3. 부하 작은 볼륨 (1 mL) 인슐린에 RRV 신생아 마우스 주입에 대 한 29 G 바늘 주사 통.
   참고: 체적 주사기의 두꺼운 바늘 쉽게 이어질 마약 누설.
4. 출생의 24 시간 이내 각 신생아 20 µ L 10⁵ PFU/mL RRV 루트를 통해 i.p.; x 1.2의 관리 같은 양의 식 염 수를 사용 하 여 제어.
   참고:이 실험에 사용 되는 주사기는 1 mL 인슐린 주사기. 다른 이유로 인해 첫 2 일 안에 죽 었 다 그들의 어머니에 의해 지 루 하지 했다 감염 된 생쥐는 분석에 포함 되지 않았다.
5. 모든 신생아 쥐를 밀접 하 게 관찰 하 고 매일 그들을 무게. 일반적으로, RRV 접종 후 6 일에 황 달에 귀, 피부, 대변 된다 찰 흙 색, 나타나고 모피 된다 기름, 바 모델;의 설립 제안 이러한 증상에 대 한 확인 하십시오.
   참고: 바 H & E와 immunohistochemical 진술서와 함께 간 조직 섹션 검사 하 여 확인할 수 있습니다. 바 마우스는 AgNP 치료에 대 한 준비 다음.
   주의: 현대 인간과 동물 RV 긴장, Biosafety 수준 2 (BSL-2) 조건 하에서 처리 해야 합니다 사용 하기 위해 제공 하는 프로토콜이입니다.

2.은 나노 입자 합성

1. 준비 하 고 앞에서 설명한^12,20AgNPs 특성.
   참고: 준비 및는 AgNPs의 세부 사항은 설명 출판물에 화학의 부, 홍콩의 대학^12,20에서 C. M. 체의 팀에 의해. 솔루션의 최종 농도가 1 m m 이었다. AgNPs의 평균 직경은 10 nm (5 ~ 15까지 nm) 및 전자 현미경 검사 법에 의해 확인.

3. 실버 나노 콜라겐 혼합물의 준비

참고: AgNP 콜라겐 혼합 준비 되 고 이전²¹ 을 설명 하 고 4 ° c.에 저장 된 특징 얼음에 모든 절차를 수행 해야 합니다.

1. 첫째, 콜라겐 준비 490 µ L의 추가 나 1.5 mL 튜브에 콜라겐 (4 mg/mL)를 입력 하 고 얼음에 그것을 배치.
2. 콜라겐을 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 10 배)의 100 µ L을 추가 하 고는 피 펫을 함께 섞는다.
   1. 10 x PBS 버퍼 1 리터를 준비 하려면 80 g의 NaCl, KCl의 2 세대 및 35.8 g Na₂HPO₄^. 의 결합 12 H₂O KH₂포₄ 와 게 실 온에서 버퍼의 2.4 g.
3. 다음, 위의 솔루션에 NaOH (0.2 M)의 10 µ L를 추가 합니다.
   1. 0.2 M NaOH를 준비 하려면 증류수 1 l의 NaOH 파우더 8 g을 추가 합니다.
4. 마지막으로, 콜라겐을 AgNPs (1mm)의 400 µ L을 추가 하 고는 피 펫과 그들을 믹스.
   참고: 추가 AgNPs 마지막도 혼합 합니다. AgNP 콜라겐 혼합 4 ° C에 저장 한다 그렇지 않으면, 그것은 쉽게 실 온에서 고형화 한다.

4. 마우스 주입 방법

1. AgNP 콜라겐 혼합의 50 µ L의 i.p. 주사로 치료 RRV 그룹에 감염 된 신생아 쥐 황 달;의 외관 후에 관리 두 번째 주사를 3 d 나중을 수행 합니다.
   참고: 컨트롤 RRV (감염된 제어) 그룹에서 마우스는 같은 양의 염 분, 고 치료 받지 일반 컨트롤 그룹에 있는 마우스.
2. 주사의 시작 부분에 마우스의 다리 반지 손가락으로 비스듬히 오른쪽 허벅지 위에 누르고 15 ° 각도 (그림 1)에서 천천히 바늘을 소개. 간 (그림 2), 약 0.5 cm에서의 낮은 가장자리의 표면에 도달, 주입 AgNP 콜라겐 혼합; 그런 다음, 천천히 바늘을 철회 한다.
   참고: 조심, 주사기로 공기를 소개 후, 신생아 마우스 살해 될 수 있습니다. 신생아 쥐에 왼쪽된 복 부에는 위장과 비장 그리고 위는 우유의 가득. 이 쪽에서 주사를 관리 하는 경우 바늘 쉽게 복 부 구멍, 또는 출혈을 일으키는 비장 흘러 우유를 일으키는 원인이 되는 중 위를 입력할 수 있습니다.
   주의: 모든 손가락 부상을 방지 하 여 바늘 뚜껑을 교체, 바늘, 제거 및 sharps 컨테이너에 반드시 바늘을 주의.
3. 모든 주사 후 쥐 AgNP 콜라겐 혼합 젤 하 고 사출 사이트 사슬에서 어머니를 방지 하기 위해 수 있도록 10 분에 대 한 그들의 감 금 소 밖으로 유지. 다음, 그들의 감 금 소에는 마우스를 반환 합니다.
4. 관찰 하 고 생존 율 뿐 아니라 황 달 및 몸 무게를 포함 하 여 매일, 모든 마우스의 실제 모습을 기록.

5. 혈액 샘플 컬렉션

참고: 약 120 µ L의 혈액 샘플은 심장에 바늘을 삽입 하 여 수집 됩니다. 원심, 후 혈 청 수집된 (약 70 µ L) 간 기능 테스트입니다. 혈액 컬렉션 메서드는 다음과 같습니다.

1. 9와 12 일 RRV 접종 (이 AgNP 치료 후 3 일) 후에 쥐를 anesthetize 사용 하 여 0.5-2.5 %sevoflurane.
2. 마우스의 사지를 고정 하 고 75% 알코올로 위와 더 낮은 복 부를 소독.
3. 절단 하 여 마우스 피부, 근육, 그리고 중간 선 따라 복 막에는 칼이 위; 횡 경 막 노출 멸 균 면봉을 사용 하 여 횡 경 막 근육을 완전히 폭로 위장을 제거.
4. (1 mL 언로드된 인슐린 주사기)와 심장의 좌 심 실에 바늘을 삽입 하 고 최대 혈액 볼륨을 주사기 플런저를 천천히 당겨 다시. 다음, 1.5 mL 튜브에 혈액을 전송.
5. 실 온에서 30 분 동안 서 서 400 x g에 5 분 동안 원심을 튜브를 허용 합니다. 그런 다음, 전송 피 펫을 사용 하 여 수집 하 고 저장 추가 사용에 대 한 혈 청.
   참고: 횡 경 막, 횡 경 막 결함은 쉽게 매, 죽음, 그리고 혈액 응고, 혈액 샘플 수집 하지 이어질으로 손상 하지 마십시오.

6. 생 화 확 적인 매개 변수 검색

1. 혈 청 생화학 매개 변수 검색 단계 5.5에서에서 수집 된를 사용 합니다.
2. 자동된 생화학 분석기를 사용 하 여 다음 생 화 확 적인 매개 변수 검색: 알라닌 aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산), 총 단백질 (TP), (장백의) 알 부 민, 글로불린 (GLO), 총 빌리 루빈 (TBIL), 직접 빌리 루빈 (DBIL), 간접 빌리 루빈 (IBIL), 그리고 총 담 즙 산 (미정).

7. extrahepatic Cholangiography Extrahepatic 담 즙 덕트 Patency 관찰 하

주: 해 부 현미경 아래에서 전체 프로세스를 수행 합니다.

1. 완벽 하 게 간, 쓸 개, 그리고 extrahepatic 담 관 면봉으로 노출 합니다.
2. 관찰 하 고 간 및 담 즙 관 해 부 현미경의 외관 사진.
3. 안과 집게를 사용 하 여 담 낭의 바닥을 부드럽게.
4. 메 틸 렌 블루 솔루션 (0.05 wt.% H₂O) 1 mL 주사기를 로드 합니다. 천천히; 쓸 개 구멍에 주사기 바늘을 삽입 그리고 안과 집게와 바늘을 잡고 천천히 methylene 청색의 10-20 µ L를 달 이다.
5. 파란색 공장 extrahepatic 담 관을 통해 전달 여부를 현미경으로 관찰 하 고 사진을.

8. Hematoxylin에 오신 얼룩이 신선한 간 샘플의 수집

1. 신선한 마우스 간 조직 하룻밤에 수정 10% 포 르 말린.
2. 다음, 파라핀에 고정된 간 조직을 포함 하 고 그들을 섹션.
3. 섹션 dewax, (증류수, 각각 5 분 동안에 100%, 95%, 80% 및 70% 에탄올) 같은 에탄올 시리즈와 함께 rehydrate, 얼룩 hematoxylin으로 조직을 섹션, 1% 염 산 알코올 차별화에 그들을 주제 및 마지막으로, 얼룩은 함께 오신 섹션입니다.
4. 마지막으로, 40 X 현미경 간 histopathology를 관찰 합니다.

9. 되며 오신 얼룩진 조직 단면도의 Immunohistochemical 얼룩

1. Dewaxing 섹션 재 후, 트리 스-EDTA 버퍼 (10 mM Tris 기지, 1 m m EDTA, pH 9.0)에 섹션을 잠수와 95 ° c.에서 10 분 동안 전자 레인지에 난방 항 원 복구 수행
2. 3% 과산화 수소 솔루션 10 분에 대 한 조직 단면도 노출 하 여 내 인 성 과산화 효소를 제거 합니다.
3. 일반적인 바인딩 차단 5% 염소 혈 청으로 섹션을 처리 합니다.
4. 1 차 항 체 토끼 마우스 NKG2D 추가 (1: 100) 섹션, 그리고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
5. 실 온에서 30 분에 대 한 적절 한 보조 항 (HRP 표시 된 고분자 반대로 토끼 시스템)와 섹션을 품 어.
6. 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) chromogen로를 사용 하 여 얼룩 immunohistochemical 시각화.
7. 40 X 현미경 아래 섹션을 확인 하 고 이미지를 원하는 대로 분석을 진행.

10. 흐름 Cytometric 분석

1. 부드럽게 말하다 간 조직, 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 그것을 전달 하 고, 그것을 원심에서 4 분 4 ° C에서 270 x g 2 x.
2. 셀 펠 릿 RPMI 1640 매체에서 resuspend 및 2 색 면역 형광 단일 클론 항 체를 사용 하 여 분석.
3. 세포 형질 fluorescein isothiocyanate와 phycoerythrin 활용 된 안티-NKp46 (NK 세포, 1:1, 000)를 포함 하 여 특정 세포 표면 마커를 사용 하 여 수행 및 안티-CD4 (T-셀 하위; 1:1, 000), 교류 cytometer 함께 데이터를 분석 하 고 교류 cytometry 데이터 분석 소프트웨어와 함께
4. 앞 으로/사이드 분산형, 어떤 배경 형광에 대 한 하 고 개별 항 체에서 형광 신호에 따라 보조 분석 데이터를 대상에 isotype 컨트롤에 따라 게이트 따라 세포 인구를 선택 합니다.

결과

설치 바 마우스 모델을 기반으로, 감염 된 신생아 쥐 관리 되었다 준비 AgNP 콜라겐 혼합물 2의 i.p. 주사 황 달 전시 후 x. 마우스 생존은 매일, 확인 하 고 간 기능 검사, 간 병 리, 그리고 cytometry 수행 했다. 치료 컨트롤 바 쥐에 비해, AgNP 처리 쥐 감소 황 달 그리고 유지 하는 그들의 정상적인 몸 무게 (그림 3). 빌리 루빈 물질 대사 및 간장 transaminase 레벨...

토론

AgNPs 전시 강력한 넓 스펙트럼 항균 특성 및 강한 침투성²²; 또한, 그들은 항균 의료 제품²³의 범위를 생산 하는 데 사용 됩니다. 그러나, AgNPs는 일단 그들은 장기에 축적 하 고이 속성은 독성 효과^24,25이어질 수 있습니다 취소 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 이전 연구는 쥐 실험에서 단일 i.v. 주입 후 급성 독성?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only