Safra atrezi sendromu farelerde Ameliorating için gümüş bir nanopartikül yöntemi

Özet

Bu makalede ayrıntılı olarak safra atrezi sendromu bir deneysel safra atrezi fare modeli ameliorating Nano Gümüş tanecikleri dayalı bir yöntem açıklanır. Reaktif hazırlık süreci ve neonatal fare enjeksiyon tekniği katı bir anlayış yenidoğan fare modeli çalışmalarda kullanılan yöntemi ile araştırmacılar tanıtmak yardımcı olacaktır.

Özet

Safra atrezi (BA) kolanjit hangi etiyolojisi hala tam anlaşılmaktadır çocuklarda yüksek mortalite ile şiddetli bir türüdür. Viral enfeksiyonlar bir olası neden olabilir. BA eğitim için kullanılan tipik hayvan modeli yenidoğan bir fare ile bir al yanaklı Rotavirüs aşı tarafından kuruldu. Gümüş nano tanecikleri antibakteriyel ve antiviral efektleri uygulamak gösterilmiştir; BA fare modeli kendi işlevleriyle Bu çalışmada değerlendirilir. Şu anda, BA hayvan deneylerinde, genellikle semptomatik tedaviler yiyecek yolu ile veya diğer ilaçlar verilen BA fareler belirtileri geliştirmek için kullanılan yöntemleri vardır. Bu çalışmada gümüş nano tanecikleri mayi enjeksiyonu ile BA sendromu farelerde ameliorating için yeni bir yöntem göstermek için ve gümüş nanopartikül jel formülasyonu hazırlama detaylı yöntemleri sağlamak amaçtır. Bu yöntem basit ve yaygın olarak uygulanabilir ve mekanizma ba, hem de klinik tedaviler araştırma için kullanılabilir. Fareler sarılık sergilemek ne zaman BA fare modeline bağlı olarak, hazırlanan gümüş nanopartikül jel intraperitoneally alt karaciğer yüzeye enjekte edilir. Hayatta kalma durumu görülmektedir ve biyokimyasal göstergelerin ve karaciğer histopatoloji incelenir. Bu yöntem her iki kurulması BA modeli ve Roman BA tedaviler daha sezgisel bir anlayış sağlar.

Giriş

BA tarafından kalıcı sarılık ile karakterize Histiositoz şeklidir ve karaciğer nakli yokluğunda yüksek ölüm oranı vardır. Viral enfeksiyonlar BA patogenezi ile yakından ilişkilidir. Sitomegalovirüs, reovirus ve Rotavirüs tüm patojenler BA^1,2,3olarak önerilmiştir. Yenidoğan döneminde ilave ve intrahepatic safra kanalları, safra epitel hücre apoptosis, inflamatuar hücre infiltrasyon Portal önde gelen karşı bağışıklık bozukluk olgunlaşmamış bağışıklık sistemi yanıt viral bir enfeksiyon olarak sonuçlanır alan, intrahepatic ve extrahepatic safra kanalı tıkanıklığı ve son olarak, karaciğer fibrozis^4,5,6.

BA eğitimi için yaygın olarak kullanılan hayvan modeli bir yenidoğan fare al yanaklı Rotavirüs (RRV) ile aşı içerir. Fare genellikle 5-6 gün sonra düşük vücut ağırlığı ve acholic dışkı gösterilen sarılık gelişir. Hastalık süreci Bağışıklık yanıtında rolü özellikle doğal öldürücü (NK) hücreleri için önemlidir; Bu hücreler ile anti-NKG2D antikor tükenmesi BA indüklenen zarar⁷büyük ölçüde azaltır. Ayrıca, diğer dahil olmak üzere CD4 hücreleri⁺ T hücreleri CD8⁺ T hücreleri, dendritik hücreler ve düzenleyici T hücreleri, tüm gösterilmiştir içinde hastalık^8,9,10,11rolleri oynamak için. Tüm verileri BA sırasında bağışıklık sisteminin vazgeçilmez doğa göstermektedir.

Gümüş nano tanecikleri (AgNPs) bakteriyel enfeksiyonlar¹² ve viral enfeksiyonlar^13,14,15de dahil olmak üzere bazı bulaşıcı hastalıklara karşı faydalı etkileri olduğu gösterilmiştir. Ancak, dermatolojik kullanım dışında kaç çalışmalar AgNPs bir klinik tedavi çoğunlukla nedeniyle onların potansiyel toksisitesi kullandık. Hayvan deneylerinde, araştırmacılar genellikle yönetilen AgNPs yolu ile sözlü¹⁶ veya intravenöz yöntemleri¹⁷etkinliğini inceledik. Ancak, diğer araştırmacılar AgNPs yönetilen yolu ile mayi (IP) iğne yenidoğan Mouse deneyler, hangi basit ve hızlı bir yöntem karaciğer ve safra kanalları ise daha doğrudan bir etkiye yol açmaktadır etkinliğini inceledik bağışıklık sistemi gibi diğer sistemlere toksisite azaltılması. AgNPs NK hücre etkinlik¹⁸etkiler gösterilmiştir; Bu nedenle, BA fare modelinde ı.p. enjeksiyon yolu ile yönetilen AgNPs tedavi edici etkileri test.

Protokol

Tüm hayvan deneysel protokoller kurumsal hayvan bakım ve Sun Yat-Sen üniversite laboratuvar hayvan Merkezi (#IACUC-DB-16-0602) kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.

1. safra atrezi fare modeli oluşturma

1. Hamile BALB/c fareler bir ortamda özel patojen-Alerjik bir 12 h karanlık/ışık siklet autoclaved chow ad libitumulaşabilen 25 ° c altında korumak.
2. RRV zorlanma MMU 18006 hazırlamak için bir plak tahlil¹⁹tarafından viral titreleri ölçmek ve virüs MA104 hücrelerdeki yükseltmek.
   Not: MA104 hücre Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) bir kuluçka %5 CO₂içeren bir oksijen atmosfere sahip kültürlü. Amplifikasyon adımları aşağıda kısaca açıklanmaktadır.
   1. MA104 hücreleri enfekte (1.5 x 10⁷) tripsin harekete geçirmek RRV [1.5 x 10⁶ plak oluşturan birim (PFU)] 30 ml serum-Alerjik orta ile 150 cm² kültür şişesi içinde. Enfekte hücreleri oksijen kuluçka %5 CO₂37 ° C'de 3 gün kuluçkaya.
   2. Her aşama donma ve o hücreleri çözdürme zamanlar, oda sıcaklığında için 20 dk-80 ° C dondurucu ile üç donma-çözülme devir tarafından kültür şişeye enfekte hücrelerde koşullar; hücre ilişkili virüs parçacık süpernatant yayınlayacak. Daha sonra toplamak ve hücre lysate ve kültür süpernatant 15 mL konik tüp içine aktarmak.
   3. Büyük hücresel enkaz lysate düşük hızda Santrifüjü (300 x g 3 dk 4 ° C'de) çıkarın. Ardından, virüs (yaklaşık 6 mL) içeren süpernatant hayvan deneyleri için yeni 15 mL konik tüp içine aktarın.
      Not: RRV sonra titered, bölünmemeli ve saklı veya kullanılan ek mermi ile amplifikasyon için hazırdır. Oda sıcaklığında uzun vadeli maruz viral enfeksiyon kapasitesini azaltır; virüs buz üzerinde yerleştirilir ve-80 ° C'de veya sıvı azot içinde saklanan.
3. RRV küçük hacimli (1 mL) insülin içine şırınga yenidoğan fare enjeksiyon için 29 G iğne ile yük.
   Not: Hacimsel şırıngaların kalın iğne kolayca uyuşturucu sızıntısı için yol.
4. Doğum 24 h içinde her kardiyolojik 20 µL 1.2 x 10⁵ PFU/mL RRV üzerinden IP rota için yönetmek; aynı birim salin denetimi olarak kullanın.
   Not: Bu deneyde kullanılan şırınga 1 mL insülin şırınga var. Diğer nedenlerden dolayı ilk 2 gün içinde öldü anneleri tarafından beslendi değil enfekte fareler Analize dahil değildi.
5. Tüm yenidoğan fareler yakından gözlemlemek ve onları her gün tartmak. Genellikle, RRV aşı sonra altıncı gününde, sarılık kulakları ve çıplak deri üzerinde görünür dışkı kil renginde olur, ve kürk BA modelinin kurulması düşündüren yağlı olur; Bu belirtiler için kontrol edin.
   Not: BA bir karaciğer dokusu bölümü muayene ile H & E ve immunohistokimyasal belirten tarafından onaylanabilir. BA fareler sonra AgNP tedavisi için hazırsınız demektir.
   Dikkat: Seviye 2 (BSL-2) koşullar altında ele alınması gerekir çağdaş hayvan ve insan RV suşları sunulan Protokolü içindir.

2. gümüş nanoparçacık sentezi

1. Hazırlamak ve yukarıda açıklanan^12,20AgNPs karakterize.
   Not: hazırlama ve AgNPs karakterize ayrıntılarını yayınlarda Kimya Bölümü, Hong Kong Üniversitesi^12,20C. M. Che'nin ekibi tarafından tarif edilmistir. Çözüm son konsantrasyonu 1 mM olduğunu. AgNPs ortalama çapı 10 yapıldı nm (5-15 arasında değişen nm) ve elektron mikroskobu tarafından onaylandı.

3. gümüş nanopartikül kollajen karışımı hazırlanması

Not: AgNP kollajen karışım hazırlanır ve daha önce açıklanan²¹ ve 4 ° C'de depolanan gibi karakterize Tüm yordamları buza gerçekleştirilmelidir.

1. İlk olarak, kollajen hazırlanırken, 490 µL ekleyin tip ı kollajen (4 mg/mL) 1,5 mL tüp ve buz üzerinde yerleştirin.
2. Fosfat tamponlu tuz (PBS, 10 x) 100 µL için kollajen ve bir pipet ile karıştırın.
   1. 1 L 10 x PBS arabelleği hazırlamak için NaCl, 80 g, 2 g KCl ve 35.8 g Na₂HPO₄^. birleştirmek 12H₂O 2.4 g KH₂PO₄ , mağaza oda sıcaklığında arabellek için.
3. O zaman, 10 µL NaOH (0.2 M) Yukarıdaki ekleyin.
   1. 0.2 M NaOH hazırlamak için 1 litre saf su 8 g NaOH tozu ekleyin.
4. Son olarak, 400 µL AgNPs (1 mM), kollajen için ve onları bir pipet ile karıştırın.
   Not: AgNPs son bir bile karıştırma için ekleyin. AgNP kollajen karışımı 4 ° C'de muhafaza edilmelidir; Aksi takdirde, oda sıcaklığında kolayca katılaşır.

4. fare enjeksiyon yöntemi

1. AgNP kollajen karışımı 50 µL ı.p. enjeksiyonu ile tedavi RRV grup virüs bulaşmış yenidoğan farelerde sarılık görünümünü sonra yönetmek; ikinci bir enjeksiyon 3 d daha sonra gerçekleştirin.
   Not: Kontrol RRV (enfekte denetimi) grubu farelerde aynı birim salin verilir ve normal kontrol grubu farelerde herhangi bir tedavi verilmez.
2. Enjeksiyon başında fare bacak yüzük parmağı ile eğik sağ uyluk üzerinde tuşuna basıp iğneyi yavaşça 15 ° açıyla (Şekil 1) tanıtmak. Karaciğerde (resim 2), yaklaşık 0.5 cm alt kenarına yüzeyine ulaşan üzerine AgNP kollajen karışımı enjekte; o zaman, iğneyi yavaşça geri alıyorum.
   Not: herhangi bir hava içine şırınga tanıtmak değil dikkatli olun, sonra yenidoğan fareyi öldürdüm. Yenidoğan farelerde mide ve dalak sol karın ve mide sütle dolu. Enjeksiyon bu taraftan yönetilir, iğne ya da mide, karın boşluğu veya kanama neden dalak akışı için süt neden kolayca girebilirsiniz.
   Dikkat: iğne iğne kapağı değiştirin, iğneyi çıkarmak ve bir "Sharps" kapsayıcısına getirin emin olun ve herhangi bir parmak yaralanmaları önlemek için dikkat.
3. Sonra tüm enjeksiyon, fareler AgNP kollajen karışımı jel ve enjeksiyon yeri yalamaktan annesi önlemek için izin vermek 10 min için kafeslerinden tutun. O zaman, fareler için onların kafes dönmek.
4. İşlevlerini izlemek ve kaydetmek tüm fareler günlük, sarılık ve vücut ağırlığı gibi hayatta kalma oranı da dahil olmak üzere fiziksel görünüşü.

5. kan toplama örnek

Not: Kalbine iğne ekleyerek yaklaşık 120 µL kan örnekleri toplanır. Santrifüjü sonra serum (karaciğer fonksiyon testleri için toplanan yaklaşık 70 µL) olduğunu. Kan toplama yöntemi aşağıdaki gibidir.

1. Dokuzuncu ve 12 gün (3 gün sonra AgNP tedavi olan) RRV aşı sonra farelerin anestezi 0,5-2,5 kullanarak % sevoflurane.
2. Fare ekstremitelerin hareketsiz ve üst ve alt karın % 75 alkolle sterilize.
3. Diyafram fare deri, kas ve orta çizgi boyunca karın zarını xiphoid makasla keserek ortaya çıkarmak; Steril Pamuklu çubukla tam diyafram kas ortaya çıkarmak için gastrointestinal sistem kaldırmak için kullanın.
4. İğne (1 mL boş insülin şırıngayla) kalbin sol ventrikül yerleştirin ve yavaş yavaş en fazla kan hacmi elde etmek için şırınga pistonu geri çekin. Ardından kan 1,5 mL tüp aktarın.
5. Tüp, oda sıcaklığında 30 dakika durup 400 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi sağlar. Ardından, bir transfer pipet kullanarak, toplamak ve serum daha fazla kullanmak için kaydedin.
   Not: diyafram diyafram kusurlar kolayca pnömotoraks, ölüm ve kan pıhtılaşması, böylece kan örnek koleksiyon önleme yol olarak zarar vermemek.

6. biyokimyasal parametrelerin algılanması

1. Adım 5.5 biyokimyasal parametrelerin algılanması için toplanan serum kullanın.
2. Otomatik bir biyokimyasal analyzer aşağıdaki biyokimyasal parametreleri algılamak için kullanır: alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST), alkalen fosfataz (ALP), toplam protein (TP), albümin (ALB), globulin (GLO), toplam bilirubin (TBIL), direkt bilirubin (DBIL), dolaylı bilirubin (IBIL) ve toplam safra asitlerinin (TBA).

7. extrahepatic Cholangiography Extrahepatic safra kanalını A_ılabilinirse gözlemlemek için

Not: bir diseksiyon mikroskop altında tüm süreci gerçekleştirmek.

1. Tam olarak karaciğer, safra kesesi ve extrahepatic safra kanalları ile bir pamuklu çubukla ortaya çıkarmak.
2. Gözlemlemek ve karaciğer ve safra kanalları diseksiyon mikroskop altında görünümünü fotoğraf.
3. Oftalmik forseps yavaşça safra kesesi dibinde tutmak için kullanın.
4. 1 mL şırınga ile metilen mavisi çözüm (0,05 wt.% H₂O) yükleyin. Yavaş yavaş şırınga iğne safra kesesi boşluğa yerleştirmek; sonra iğne ile oftalmik forseps kavramak ve yavaş yavaş 10-20 µL metilen mavisi süzülür.
5. Mikroskop altında mavi renk değişir için extrahepatic safra kanalları geçer olup olmadığını gözlemlemek ve fotoğraf çekmek.

8. Hematoksilen ve eozin boyama için taze karaciğer örnekleri topluluğu

1. Taze fare karaciğer doku gecede % 10 formalin içinde düzeltmek.
2. Ardından, sabit belgili tanımlık karaciğer doku parafin içinde katıştırabilir ve onları bölüm.
3. Bölümleri dewax, onları bir etanol serisi (örneğin % 100, % 95, % 80 ve % 70 etanol distile su, her 5 min için) ile rehydrate, doku bölümleri hematoksilen ile leke, onları % 1 hidroklorik asit alkol farklılaşma tabi ve son olarak, leke eozin bölümlerle.
4. Son olarak, 40 X mikroskopla karaciğer histopatoloji gözlemlemek.

9. immunohistokimyasal Hematoksilen ve eozin lekeli doku bölümleri boyama

1. Mum eritme ve bölümleri nemlendirilmesi sonra Tris-EDTA arabellek (10 mM Tris Bankası, 1 mM EDTA çözüm; pH 9.0) bölümlerinde batış ve onları 95 ° C'de 10 dakika için bir mikrodalga ısıtma tarafından bir antijen alma gerçekleştirmek
2. Endojen peroksidaz %3 hidrojen peroksit çözüm için 10 min için doku bölümler açarak kaldırın.
3. Bölümleri nonspesifik bağlama engellemek için % 5 keçi serum ile tedavi.
4. Birincil antikorlar tavşan-fare NKG2D Ekle (1: 100) bölümlerine ve onları gecede 4 ° C'de kuluçkaya
5. Oda sıcaklığında 30 dk için uygun ikincil antikorlar (HRP etiketli polimer Anti-tavşan sistemi) bölümlerle kuluçkaya.
6. İmmunohistokimyasal boyama 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) Kromojen olarak kullanarak görselleştirmek.
7. 40 X mikroskopla bölümleri gözlemlemek, görüntüleri ve istediğiniz şekilde çözümlemek için devam edin.

10. akış sitometrik çözümlemesi

1. Yavaşça karaciğer dokusu kıyma, bir 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve bu santrifüj kapasitesi 2 x 270 x g 4 dk 4 ° C'de de.
2. Hücre Pelet RPMI 1640 ortamda resuspend ve monoklonal antikorları kullanarak iki renkli ayirt tarafından analiz.
3. Hücresel fenotipleme floresein isothiocyanate ve phycoerythrin Birleşik anti-NKp46 (NK lenfositler; 1:1, 000) dahil olmak üzere belirli hücre yüzeyine işaretçileri kullanarak gerçekleştirmek ve anti-CD4 (T-hücre alt türü; 1:1, 000), bir akış sitometresi ile ve verileri analiz Akış Sitometresi veri analiz yazılımı ile.
4. Hücre popülasyonlarının ileri/yan dağılım, kapı izotip denetimlerin herhangi bir arka plan floresan için hesap ve verileri ikincil bir analiz bireysel antikorlar gelen floresan sinyallerini dayalı tabi göre göre seçin.

Sonuçlar

Kurulan BA fare modelini temel alan, virüslü yenidoğan fareler idare ı.p. enjeksiyonu hazırlanan AgNP kollajen karışım 2 x sonra sarılık sergilenmesi. Fare hayatta kalmak için günlük kontrol edildi ve karaciğer fonksiyon testleri, karaciğer patolojisi ve akış sitometresi yapıldı. Tedavi edilmeyen denetim BA fareler için karşılaştırıldığında, AgNP tedavi fareler azaltılmış sarılık gösterdi ve kendi normal vücut ağırlığı (Şekil 3...

Tartışmalar

AgNPs güçlü geniş spektrumlu antibakteriyel özellikleri ve güçlü geçirgenliği²²sergi; Ayrıca, bunlar antibakteriyel Medikal Ürünler²³bir dizi üretmek için kullanılır. Ancak, AgNPs bir kez onlar organlarda birikir ve bu sebat toksik etkileri^24,25için neden olabilir temizlemek için uzun bir zaman alabilir. Bir önceki çalışmada akut toksisite ve AgNPs genotoxicity tek damardan enjeksiyon bir fare...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse	Guangdong Medical Experimental Animal Center	SYXK2017-0174	Animal experiment
Rhesus rotavirus (RRV)	ATCC	ATCC VR-1739	Establish biliary atresia mouse model
MA104 cells	ATCC	ATCC CRL-2378.1	For laboratory use only
DMEM	Thermo Fisher	10569010	Mammalian Cell Culture
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10099141	Mammalian Cell Culture
collagen Type I	CORNING	354236	For research use only
PBS buffer	OXOID	BR0014G	For washing
NaOH	Sigma	1310-73-2	Adjust the PH value
AgNP			Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong.
Insulin syringe with integrated needle	BD	9161635S	For medical use
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430791	For laboratory use only
1.5 mL Microcentrifuge Tube	GEB	CT0200-B-N	For laboratory use only
Microscope	Nikon	ECLIPSE-Ci	For laboratory use
Dissecting/Intravital microscope	Nikon	SMZ 1000	For laboratory use
anti-Mouse NKp46 FITC	eBioscience	11-3351	For research use only
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5	eBioscience	15-0041	For research use only
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4	DAKO	20001673	For research use only
anti-NKG2D	RD	MAB1547	For research use only
BD FACSCanto Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Canto Plus	For laboratory use only