低聚活性的体外定量

摘要

我们描述了三种实验方法来评估化学物质在体外的低细胞化活性: 1) 细胞酪氨酸酶活性和 2) 黑色素含量的定量, 以及 3) 细胞黑色素染色和图像分析测量黑色素。

摘要

本研究提出了体外低细胞化活性定量的实验室方法。黑色素是黑色素细胞中的主要色素, 是针对多种细胞和环境因素而合成的。黑色素保护皮肤细胞免受紫外线伤害, 但也具有生物物理和生化功能。黑色素细胞的过度产生或积累会导致皮肤病问题, 如雀斑、黑斑、黄瘤和痣。因此, 控制黑色素生成与低渗剂是重要的个人有临床或美容需求。黑色素主要是在黑色素细胞的黑色素体中合成的, 这个过程被称为黑色素生成, 它受到外部和内在因素的影响, 如激素、炎症、年龄和紫外线照射。我们描述了三种方法来确定化学物质或天然物质在黑素细胞中的低细胞化活性: 测量 1) 细胞酪氨酸酶活性和 2) 黑色素含量, 3) 染色和量化细胞黑色素与图像分析。

在黑色素生成过程中, 酪氨酸酶催化将 l-酪氨酸转化为 3, 4-二羟基苯基丙氨酸 (l-dopa), 然后转化为多巴基宁的限速步骤。因此, 抑制酪氨酸酶是一种主要的低细胞化机制。在培养的黑素细胞中, 通过添加 l-dopa 作为底物, 用分光光度法测定多巴西酮的产生, 可以量化酪氨酸酶活性。黑色素生成也可以通过定量测量黑色素含量。用 naoh 提取含黑色素的细胞分数, 用定量分光光度法提取黑色素。最后, 黑色素的图像分析可以量化黑色素的含量。虽然这些体外检测的结果可能并不总是在人体皮肤中复制, 但这些方法在黑色素生成研究中被广泛使用, 特别是作为识别潜在低细胞化活性的第一步。这些方法也可用于评估黑素细胞的活性、生长和分化。与三种不同方法一致的结果确保了效果的有效性。

引言

黑色素在包括皮肤、眼睛和大脑¹在内的几个器官的生理、病理和毒理学中发挥着至关重要的作用。黑色素的主要功能是光筛选和生化效应。黑色素吸收近红外光和可见光以及紫外线 (uv) 辐射, 在较短波长的光的情况下吸收率提高;因此, 黑色素保护组织免受可见光或紫外线辐射2造成的损害^.黑色素是一种抗氧化剂, 对金属和其他有毒化学品有亲和力;因此, 它可以保护组织免受氧化和化学应激3。然而, 黑色素的过度生产会导致皮肤病问题。

皮肤和虹膜中黑色素的数量和质量是虹膜和皮肤颜色的最重要决定因素。个人可能有不同的肤色偏好;有的喜欢晒黑的皮肤, 有的则喜欢较浅的皮肤颜色。根据这些消费者的情况, 低菌化妆品已经开发, 以满足个别市场的青睐的肤色⁴。因此, 研究低细胞和抗黑色素活性在科学和实践上都很重要。

黑色素生成是黑色素通过一系列酶性和自发化学反应在黑色素细胞中进行生物合成的复杂过程。一个黑素细胞被大约36个角质形成细胞包围, 黑素细胞是黑色素合成工厂, 将它们的产品分配给邻近的角质形成细胞。在皮肤中, 产生和储存在黑色素细胞黑色素瘤室中的黑色素通过树突输送到表皮中的角质形成细胞.

l-tyrosine 作为黑色素生成的初始底物, 酪氨酸酶催化两种连续反应, 将 l-酪氨酸转化为 3, 4-二羟基苯基丙氨酸 (dopa), 然后转化为多巴米酮。这些反应是黑色素生成的限速^{步骤 5,6}。因此, 低细胞分裂活性可以通过直接评估细胞酪氨酸酶活性来测量。为此, 含有酪氨酸酶的黑素细胞提取物由 dopa 孵育, 样品中产生的多巴西酮可在475纳米的分光光度法中进行测定。这些值通过样品的蛋白质浓度进行归一化, 与对照相比, 具有低渗活性的物质会导致多巴奎因的形成较少。

其次, 低细胞分裂活性可以通过直接测量培养的黑色素细胞中的黑色素来量化。用试验材料处理细胞后, 在碱性条件下提取黑色素, 用分光光度法在400纳米处测定黑色素含量。低细胞化剂会导致比对照组⁷更低的黑色素含量。

最后, 利用 Fontana-Masson 黑色素染色和随后的图像分析可以量化低细胞分裂活性。在 Fontana-Masson 染色中, 黑色素颗粒将硝酸铵还原为可见的黑色金属状态, 而微观图像中的黑细胞区域代表黑色素的数量。

低渗剂通常会给出与这三种方法一致和可比的结果, 这证实了该物质的活性是有效的。或者, 它可能是有用的, 以衡量关键基因和蛋白质在黑色素生成的表达, 以响应测试物质, 以检查低细胞化活性。除了酪氨酸酶外, 酪氨酸酶相关蛋白 (trp-1) 和多巴斯姆自体擦除 (trp-2) 是黑色素生成的关键酶 8.转录因子、微邻苯二甲相关转录因子 (mitf) 是黑色素生成和基因蛋白表达水平定量的主要调节剂, 也可用于评估低细胞化活性。

研究方案

1. 培养基、化合物和试剂的制备

1. 准备 b16f10 生长完整的介质。补充 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem) 与10% 的胎牛血清 (fbs) 和1% 的青霉素/链霉素 (pest)。
   1. 要使500毫升的完整介质, 将 dulbecco 改性的 eagle 介质 (dmem) 的445毫升与50毫升的 fbs 和5毫升的 pest 混合在一个1升的灭菌玻璃瓶中。轻轻混合后, 通过0.2μm 的瓶盖过滤器将介质过滤到新的灭菌玻璃瓶中, 然后存放在4°c。
      注意: 所有细胞培养技术都应在微生物安全柜中使用无菌技术进行, 以确保无菌。
2. 制备裂解缓冲液:20 mm 三 (羟基甲基) 氨基甲烷, 在 ph 值 7.5 (ph 值经 hcl 调整后) 时含有0.1% 的 triton x-100 (v/v) 缓冲液。此缓冲液在室温 (rt) 下储存时可使用3个月。使用前立即将蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液中。
3. 制备酪氨酸酶抑制剂测定缓冲液。制备 1 m nah2 po 4 (单效) 和 1 m na₂hpo₄ (二基) 库存溶液.混合 na₂hpo 4 和 nah 2 po 4 的 46.3 ml 和 53.7 ml , 以制备 0.1 m 磷酸钠缓冲液 (ph 6.8) 的最终体积.
   1. 用 h2o 将产生的混合物稀释到1升 (最终体积), 将最终溶液的 ph 值调整到6.8。在4°c 下存储时, 此缓冲液可使用1个月。
4. 制备酪氨酸酶底物溶液: 0.1% 3, 4-二羟基-l-苯基丙氨酸 (dopa, w/v) 溶解在酪氨酸酶抑制剂分析缓冲液中 (参见步骤 1.3)。
   注意: 使用时保持冰。
5. (可选) 制备 100 u/ml 蘑菇酪氨酸酶。溶解冻干蘑菇酪氨酸酶在酪氨酸酶抑制剂测定缓冲液中的作用。在–20°c 下储存时, 该解决方案可使用2个月。在细胞物质存在的情况下, 计算了蘑菇酪氨酸酶活性和细胞酪氨酸酶活性。
   注意: 在冷冻之前, 溶液是经过选择的, 因此可以避免反复的冻融。使用时将溶液放在冰上。
6. 准备 1 n naoh 溶液。在体积瓶中称量4克 naoh, 并将其溶解在蒸馏水中, 制成100毫升。
7. 准备固定溶液 (10% 福尔拉林)。用73毫升的蒸馏水稀释27% 的甲醛27毫升。每天准备新鲜的。
8. 准备氨基银库存解决方案。在体积瓶中制备5% 的10% 硝酸银溶液。滴注添加氢氧化铵溶液, 直至沉淀物完全溶解。加入200μl 硝酸银溶液 (10%)。溶液会变得略显多云。
   小心: 避免接触和吸入。使用通风罩。
9. 准备氨基银工作解决方案。用7.5 毫升蒸馏水稀释2.5 毫升氨基银库存溶液。使用一次, 然后丢弃。
   小心: 避免接触和吸入。使用通风罩。
10. 准备0.1% 的氯化金。制备1毫升的10% 氯化金, 并在体积瓶中加入99毫升的蒸馏水。每天准备新鲜的。
11. 准备磷酸盐缓冲碱 (pbs)。在800毫升的蒸馏水中加入8克氯化钠、0.2 克的 kcl、1.44克的 na 2 hpo 4 和 0.24 g_的kh₂po 4。用 hcl 将 ph 值调整到 7.4. 用蒸馏水将产生的混合物稀释到1升 (最终体积)。
12. 制备溶解在蒸馏水中的5% 硫代硫酸钠溶液。

2. 细胞培养和治疗

1. 使用市售 b16f10 电池。将 b16f10 单元保持在完整的介质中。将细胞培养瓶保存在加湿的 5% co 2 大气孵化器中, 温度为37°c。
2. 准备测试化合物、抑制剂阳性控制和阴性对照样品。
   1. 将测试化合物溶解在适当的溶剂中。在双蒸馏水中溶解水溶性化合物。将不溶于水的化合物溶解在适当的有机溶剂中,例如dmso。
   2. 在这里, 使用溶解在双蒸馏水 (125μg/ml) 中的 arbutin 作为阳性对照, 以评估与试验化合物或阴性对照相比的低渗活性。作为一种负控制 (车辆处理控制), 请使用测试样品中使用的溶液或缓冲器,例如双蒸馏水、dmso、乙醇。
3. 细胞播种和治疗
   1. 种子 b16f10 细胞在 5x10 4 细胞井24井培养板使用完整的培养基和孵育在一个 co 2 孵化器 24 h。孵育后, 吸入完整的培养基。
   2. 用 dmem 培养基 (不含 fbs 和 1% penicillin/streptomycin) 培养细胞, 在 co2 孵化器中含有测试化合物、抑制剂控制或阴性对照 72小时,在显微镜下每24小时检查一次细胞。完成此步骤后, 转到步骤3-5 进行进一步实验。
      注意: 测试物质和 dmem 介质的混合物应通过0.2μm 的过滤器进行过滤。

3. 测量细胞酪氨酸酶活性

1. 使用步骤2中描述的方法, 取出介质, 用300μl 的冷 pbs 冲洗细胞两次。
2. 将细胞培养板放在冰上。加入300μl 的裂解缓冲液, 孵育5分钟。然后使用细胞刮刀收集细胞裂解液, 并将细胞裂解液转移到 1.5 ml 微离心管中。
3. 在 14, 500 rpm 的细胞均质机中对细胞裂解液进行均质, 为 2秒, 3次在冰上获得细胞内酪氨酸酶。使用均质机特有的最佳条件。
4. 在4°c 条件下在 12, 000xg 的温度下离心 10分钟, 并将细胞上清液转移到 1.5 ml 微离心管中. 在使用时保持冰。
5. 将上清液的70μl 转移到96井透明聚苯乙烯微板上。
6. 在96井透明聚苯乙烯微盘中加入140μl 的含有酪氨酸酶底物 (dopa) 的溶液, 轻轻摇晃, 在37°c 下孵育2小时。
7. 可选, 在每口井中加入70μl 的 100 uml 蘑菇酪氨酸酶溶液, 并在37°c 孵育2小时。
8. 使用微板读取器测量波长为 475 nm 的酪氨酸酶活性。
9. 将酪氨酸酶活性归一化到每个样品的蛋白质浓度。用布拉德福德法测量每个样品的蛋白质浓度。

4. 黑色素含量的测定

1. 使用步骤2中描述的方法, 取出介质, 用300μl 的冷 pbs 冲洗细胞两次。
2. 将细胞培养板放在冰上。加入300μl 的裂解缓冲液, 孵育5分钟。然后使用细胞刮刀收集细胞裂解液, 并将细胞裂解液转移到 1.5 ml 微离心管中。
3. 在4°c 下, 以 12, 000 x g 离心10分钟。
4. 将上清液转移到新的试管中, 测量总蛋白浓度以实现归一化。用布拉德福德法测量每个样品的蛋白质浓度。
5. 在每个颗粒中加入300μl 的 1 n naoh, 在60°c 孵育1小时。
6. 在4°c 条件下, 在 12, 000xg 的温度下将溶解的溶液离心10分钟。
7. 将上清液的200μl 转移到96孔微板上。
8. 测量在400纳米波长的黑色素含量。
9. 将黑色素含量归一化到蛋白质浓度。

5. 丰塔纳-马松染色

1. 丰塔纳-马松染色
   1. 用300μl 的冷 pbs 清洗细胞两次。
   2. 在每口井中加入 200μl 10% 福尔拉林, 在4°c 下孵育1小时。
   3. 用蒸馏水冲洗。
   4. 加入200μl 预热的氨基银工作溶液, 在37°c 孵育 1小时, 或直到细胞呈黄褐色。
      注意: 将新鲜混合的氨基银工作溶液放入58–60°C 水浴中, 并为温度平衡留出充足的时间。
   5. 去除氨基银的工作溶液, 用蒸馏水冲洗。
   6. 去除蒸馏水。加入 200μl 0.1% 的氯化金, 在 rt 孵育2分钟。
   7. 去除0.1% 的氯化金溶液, 用蒸馏水冲洗。
   8. 去除蒸馏水。加入200μl 硫代硫酸钠溶液 (5%, w v), 孵育2分钟。
   9. 除去硫代硫酸钠溶液, 用蒸馏水冲洗。
   10. 去除蒸馏水。加入200μl 的核快速红, 孵育5分钟。
   11. 取出核快红, 用自来水冲洗。
   12. 取出自来水, 并在显微镜下观察染色细胞。
2. fontan–马松染色 (使用 imagej 的阈值分析)
   注意: 使用 imagej 软件进行图像分析的示例显示在补充材料中。
   1. 打开程序 imagej。
   2. 选择文件开盘显微镜图像。
   3. 选择图像调整颜色阈值.
   4. 若要测量使用 fontana–ma子染色的区域, 请将亮度参数栏设置为零, 并调整亮度栏, 以查找包含所有染色单元格 (黑色或深棕色) 的点。
   5. 选择"分析"分析粒子。选中 "分析粒子" 窗口中的汇总框, 然后按"确定"。获取摘要结果并粘贴到电子表格中。
      注意: 生成的框参数的说明如下所示:
      切片: 每个图像的名称
      计数: 染色细胞的数量
      总面积: 计数单元格的总面积
      平均尺寸: 总面积计数
      面积: 染色面积/总面积 x100%;总面积自动计算。
   6. 使用 "总面积" 的值计算黑色素染色的相对面积。
      相对黑色素染色面积 (%) = 测试样本的总细胞面积的值-控制 x100 的平均总面积,即,

结果

具有代表性的结果, 在 b16f10 黑色素细胞的抗黑色素素化合物的低细胞分裂活性如下所示。图 1a显示, 与车辆处理的对照相比, arbutin 显著抑制了细胞酪氨酸酶活性。同样, 与对照组相比, 阿布丁刺激的细胞黑色素含量显著降低 (图 1b)。用 Fontana-Masson 染色染色的细胞的显微图像如图 1c所示。与对照相比, arbutin ...

讨论

我们提出了评估使用培养的黑素细胞的测试化合物的低细胞化活性的方案。有代表性的结果显示了抗酪氨酸酶抑制剂 arbutin 的低细胞化作用, 它抑制酪氨酸酶活性和细胞黑色素含量。这些方法在抗黑色素活性研究中得到了广泛的应用。利用这些检测方法, 我们还成功地发现了几种生物活性化合物, 这些化合物在过去^十年中对b16f10 细胞产生黑色素作用, 9^、10

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU