Cuantificación de hipopigmentación de la actividad In Vitro

Resumen

Se describen tres métodos experimentales para la evaluación de la actividad de hipopigmentación de químicos in vitro: cuantificación del contenido 2) melanina y actividad tirosinasa 1) celular y 3) medición de la melanina por análisis de imagen y coloración celular melanina.

Resumen

Este estudio presenta los métodos de laboratorio para la cuantificación de hipopigmentación de la actividad in vitro. Melanina, el pigmento principal en los melanocitos, se sintetiza en respuesta a múltiples factores ambientales y celulares. Melanina, protege las células de la piel contra el daño ULTRAVIOLETA, pero también tiene funciones biofísicas y bioquímicas. Producción excesiva o acumulación de melanina en los melanocitos puede causar problemas dermatológicos, tales como pecas, manchas, melasma y moles. Por lo tanto, el control de la melanogénesis con hipopigmentación agentes es importante en personas con necesidades clínicas o cosméticas. Melanina se sintetiza principalmente en los melanosomas de melanocitos en un proceso bioquímico complejo llamado melanogénesis, influenciado por extrínsecos y factores intrínsecos, como las hormonas, inflamación, edad y exposición a la luz ultravioleta. Se describen tres métodos para determinar la actividad de hipopigmentación de productos químicos o sustancias naturales en los melanocitos: medición de la actividad de la tirosinasa 1) celular y contenido de melanina 2) y melanina celular 3) tinción y cuantificación con imagen Análisis.

En la melanogénesis, tirosinasa cataliza el paso de limitación de velocidad que convierte la L-tirosina en 3, 4-dopa (l-dopa) y luego en dopaquinona. Por lo tanto, la inhibición de la tirosinasa es un mecanismo primario de hipopigmentación. En los melanocitos cultivados, actividad de la tirosinasa puede cuantificarse por la adición de l-dopa como sustrato y dopaquinona producción de medición por espectrofotometría. Melanogénesis puede medirse también cuantificando el contenido de melanina. La fracción celular que contiene melanina es extraída con NaOH y melanina se cuantifica espectrofotométricamente. Finalmente, el contenido de melanina puede ser cuantificado por análisis de imagen después de la coloración de Fontana-Masson de melanina. Aunque los resultados de estos ensayos in vitro no siempre se pueden reproducir en la piel humana, estos métodos son ampliamente utilizados en la investigación de la melanogénesis, especialmente como el paso inicial para identificar la potencial actividad de hipopigmentación. Estos métodos pueden utilizarse también para evaluar la diferenciación, crecimiento y actividad de melanocitos. Resultados consistentes con los tres diferentes métodos de aseguran la validez de los efectos.

Introducción

Melanina juega un papel fundamental en la fisiología, patología y toxicología de los varios órganos incluyendo la piel, ojos y cerebro¹. Principales funciones de la melanina son efectos foto-proyección y bioquímicos. Melanina absorbe la luz infrarroja y visible, así como la radiación ultravioleta (UV), con tasas de aumento de la absorción en longitudes de onda más cortas de la luz; así, melanina protege los tejidos contra daños causados por la luz visible o UV radiación². Melanina es un antioxidante y tiene una afinidad por los metales y otras sustancias químicas tóxicas; por lo tanto, puede proteger los tejidos del estrés oxidativo y química³. Sin embargo, la producción excesiva de melanina provoca problemas dermatológicos.

La cantidad y calidad de melanina en la piel y el iris son los más importantes determinantes del color del iris y la piel. Los individuos pueden tener preferencias de color de piel diferente; algunos favorecen la piel bronceada, mientras que otros favorecen colores de piel más claros. Dependiendo de estos perfiles de consumidor, hipopigmentación cosmética se han desarrollado para satisfacer mercados individuales de piel favorece colores⁴. En consecuencia, estudios de actividad hipopigmentación y anti-melanogenic son importantes científicamente y prácticamente.

Melanogénesis es el complejo proceso de biosíntesis de la melanina mediante una serie de reacciones químicas enzimáticas y espontáneas en los melanocitos. Un melanocito es rodeado por aproximadamente 36 queratinocitos y melanocitos son las fábricas de la síntesis de melanina que distribuyen su producto a los queratinocitos vecinos. En la piel, la melanina producida y almacenada en el compartimiento melanosomal de melanocitos es transportada a vecinos queratinocitos en las epidermis a través de las dendritas.

L-tirosina sirve como sustrato inicial para la melanogénesis y la tirosinasa enzima cataliza dos reacciones consecutivas que transforman la L-tirosina en 3, 4-dopa (DOPA) y luego en dopaquinona. Estas reacciones son el paso tarifa-limitador en la melanogénesis^5,6. Por consiguiente, hipopigmentación actividad primero puede medirse determinando la actividad de la tirosinasa celular directamente. Para ello, extractos de melanocitos que contiene tirosinasa se incuban con la DOPA y la dopaquinona producida en las muestras se puede medir por espectrofotometría a 475 nm. Los valores se normalizan por las concentraciones de proteína de las muestras y sustancias con hipopigmentación actividad dan como resultado menos formación de dopaquinona en comparación con controles.

En segundo lugar, actividad de hipopigmentación puede cuantificarse midiendo directamente la melanina en los melanocitos cultivados. Después de tratar las células con el material de prueba, la melanina se extrae en condiciones alcalinas y el contenido de melanina se cuantifica por espectrofotometría a 400 nm. Un agente de la hipopigmentación se traducirá en un menor contenido de melanina que la de controles⁷.

Por último, la actividad de hipopigmentación puede cuantificarse por coloración de Fontana-Masson melanina y análisis de imagen posterior. En la tinción de Fontana-Masson, gránulos de la melanina reducen nitrato de amoníaco-plata en un visible estado metálico negro y las áreas negras de las células en los imágenes microscópicas representan la cantidad de melanina.

Un agente de hipopigmentación generalmente da resultados consistentes y comparables con estos tres métodos, que confirma que la actividad de la sustancia es válida. Alternativamente, puede ser útil medir la expresión de genes clave y proteínas en la melanogénesis en respuesta a una sustancia de prueba para examinar la actividad de hipopigmentación. Además de tirosinasa, proteínas relacionadas con la tirosinasa (TRP-1) y dopachrome tautomerase (TRP-2) son enzimas críticas en la melanogénesis⁸. El factor de transcripción factor transcripción asociada a microftalmia (MITF) es un regulador principal en la melanogénesis y cuantificación de sus niveles de expresión del gen de la proteína o un análisis de la actividad de promotor puede utilizarse también para evaluar actividad de hipopigmentación.

Protocolo

1. preparación del medio, compuestos y reactivos

1. Preparar el medio completo de crecimiento B16F10. Suplemento Dulbecco había modificado medio de águila (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (plagas).
   1. Para hacer 500 mL de medio completo, mezclar 445 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 50 mL de SBF y 5 mL de plagas en una botella esterilizada de vidrio de 1 L. Después de mezclar suavemente, filtrar el medio a través de un filtro de 0.2 μm superior de la botella a un nuevo frasco de vidrio esterilizado y luego almacenar a 4 ° C.
      PRECAUCIÓN: Todas las técnicas de cultivo celular deben realizarse en gabinete usando una técnica aséptica para garantizar la esterilidad de seguridad.
2. Preparar el tampón de lisis: 20 mM Tris (hidroximetil) aminometano que contiene 0,1% Tritón X-100 (v/v) tampón a pH 7.5 (pH ajustado con HCl). Este buffer se puede utilizar por 3 meses cuando se almacena a temperatura ambiente (RT). Añadir inhibidores de la proteasa en el búfer de lisis justo antes del uso.
3. Preparar el tampón de ensayo de inhibidor de la tirosinasa. Preparar 1 M NaH₂PO₄ (monobásico) y M 1 Na₂HPO₄ (dibásicos) soluciones. Mezclar 46,3 mL de Na₂HPO₄ y 53,7 mL de NaH₂PO₄ para preparar un volumen final de tampón de fosfato de sodio de 0,1 M (pH 6.8).
   1. Diluir la mezcla resultante a 1 L (volumen final) con H₂O. ajustar el pH de la solución final a 6.8. Este buffer se puede utilizar para 1 mes cuando se almacena a 4 ° C.
4. Preparar la solución de sustrato de tirosinasa: 0,1% 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (DOPA, w/v) disuelto en tampón de ensayo de inhibidor de la tirosinasa (consulte paso 1.3).
   PRECAUCIÓN: Mantener en hielo mientras está en uso.
5. Opcionalmente, preparar tirosinasa seta de 100 U/mL. Disolver el liofilizado tyrosinase seta en tampon de ensayo de inhibidor de la tirosinasa. Esta solución puede utilizarse durante 2 meses cuando se almacena a – 20 ° C. La actividad de la tirosinasa de champiñón como actividad de la tirosinasa celular se calcula en presencia de materiales de la célula.
   PRECAUCIÓN: La solución es alícuotas antes así de congelación repetida congelación y descongelación puede evitarse. Mantener la solución en el hielo mientras está en uso.
6. Preparar la solución de NaOH N 1. Pesar 4 g de NaOH en un matraz aforado y disolver en agua destilada hasta completar 100 mL.
7. Preparar la solución de fijación (formol al 10%). Diluir 27 mL de formaldehído al 37% con 73 mL de agua destilada. Preparar diariamente.
8. Preparar solución stock de plata amoniacal. Preparar 5 mL de solución de nitrato de plata de 10% en un matraz aforado. Añadir gota a gota, solución de hidróxido de amonio hasta que el precipitado se haya disuelto completamente. Añada 200 μL de solución de nitrato de plata (10%). La solución será ligeramente nublada.
   PRECAUCIÓN: Evite el contacto y la inhalación. Utilizar una campana de humos.
9. Preparar solución de trabajo de plata amoniacal. Diluir 2,5 mL de solución stock de plata amoniacal con 7,5 mL de agua destilada. Utilizar una vez y luego desechar.
   PRECAUCIÓN: Evite el contacto y la inhalación. Utilizar una campana de humos.
10. Preparar el cloruro de oro 0.1%. Preparar 1 mL de cloruro de oro 10% y agregar 99 mL de agua destilada en un matraz aforado. Preparar diariamente.
11. Preparar la solución salina buffer fosfato (PBS). Añadir 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ y 0,24 g de KH₂PO₄ en 800 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 con HCl. diluir la mezcla resultante a 1 L (volumen final) con agua destilada.
12. Preparar solución de tiosulfato de sodio 5% (p/v) disuelto en agua destilada.

2. la cultura y el tratamiento de la célula

1. Utilizar células B16F10 comercialmente disponibles. Mantener las células B16F10 en medio completo. Mantener el frasco de cultivo celular en humidificado, 5% CO₂ ambiente incubadora a 37 ° C.
2. Preparar compuestos de prueba, inhibidor control positivo y las muestras control negativo.
   1. Disolver los compuestos de prueba en los disolventes apropiados. Disolver los compuestos solubles en agua en agua destilada doble. Disolver agua compuestos insolubles en el solvente orgánico adecuado, por ejemplo., DMSO.
   2. Aquí, uso arbutin disuelto en agua destilada doble (125 μg/mL) como control positivo para determinar la actividad de hipopigmentación en comparación con los compuestos de prueba o un control negativo. Como control negativo (control tratados con vehículo), utilice las soluciones o buffers utilizados en la muestra, por ejemplo, doble y agua destilada, DMSO, etanol.
3. Siembra y tratamiento de la célula
   1. Semilla B16F10 células 5 x 10⁴ células/pozo en placas de cultivo de 24 pozos con medio completo e incuban en una incubadora de CO₂ durante 24 h. Después de la incubación, aspirar el medio completo.
   2. Incubar las células con medio DMEM (sin FBS y 1% de penicilina/estreptomicina) que contiene compuestos de prueba, un control inhibidor o control negativo en un incubador de CO₂ para las células 72 h. verificación cada 24 h bajo el microscopio. Después de este paso, vaya a los pasos 3-5 para experimentos adicionales.
      PRECAUCIÓN: La mezcla de la sustancia y medio DMEM debe filtrarse a través de un filtro de 0.2 μm.

3. medición de la actividad de la tirosinasa celular

1. Usando el método descrito en el paso 2, quite los medios de comunicación y enjuague las células dos veces con 300 μL de PBS frío.
2. Coloque la placa de cultivo celular en hielo. Añadir 300 μL de tampón de lisis e incubar durante 5 minutos. A continuación recoger la célula lisada con un raspador celular y transferir el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Homogeneizar el lysate de la célula con un homogenizador celular a 14.500 rpm durante 2 s, 3 veces en el hielo para obtener tirosinasa intracelular. Uso del específico de la condición óptima para el homogeneizador.
4. Centrifugar 10 min a 12.000 × g a 4 ° C y transferir el sobrenadante de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Mantenga en hielo mientras está en uso.
5. Transferencia de 70 μL del sobrenadante a una microplaca de 96 pocillos transparente poliestireno.
6. Añadir 140 μL de una solución que contiene sustrato de tirosinasa (DOPA) a una microplaca de 96 pocillos transparente poliestireno, agite suavemente e incubar por 2 h a 37 ° C.
7. Opcional, añadir 70 μL de solución de tirosinasa de champiñón de 100 U/mL a cada pozo e incubar por 2 h a 37 ° C.
8. Medir la actividad de la tirosinasa en una longitud de onda de 475 nm, utilizando el lector de microplacas.
9. Normalizar la actividad de la tirosinasa a la concentración de proteína de cada muestra. Medir la concentración de proteína de cada muestra de un ensayo de Bradford.

4. medir el contenido de melanina

1. Usando el método descrito en el paso 2, quite los medios de comunicación y enjuague las células dos veces con 300 μL de PBS frío.
2. Coloque la placa de cultivo celular en hielo. Añadir 300 μL de tampón de lisis e incubar durante 5 minutos. A continuación recoger la célula lisada con un raspador celular y transferir el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Centrifugar 10 min a 12.000 × g a 4 ° C.
4. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y medir la concentración de proteína para la normalización. Medir la concentración de proteína de cada muestra de un ensayo de Bradford.
5. Añadir 300 μL de 1 N NaOH a cada pellet e incubar a 60 ° C durante 1 h.
6. Centrifugue la solución disuelta durante 10 min a 12.000 x g a 4 ° C.
7. Transfiera 200 μL del sobrenadante a una microplaca de 96 pozos.
8. Medir el contenido de melanina en una longitud de onda de 400 nm.
9. Normalizar el contenido de melanina en la concentración de proteína.

5. coloración de Fontana-Masson de

1. Coloración de Fontana-Masson
   1. Lavar las células dos veces con 300 μL de PBS frío.
   2. Añadir 200 μL de formalina al 10% a cada pocillo e incubar 1 h a 4 ° C.
   3. Enjuague con agua destilada.
   4. Añadir 200 μL de plata amoniacal con solución e incubar 1 h a 37 ° C o hasta que las células se convierten en color amarillo/marrón.
      PRECAUCIÓN: Coloque plata amoniacal recién mezclado de la solución de trabajo en un baño de 58 a 60° C y permitir suficiente tiempo para que la temperatura se equilibre.
   5. Retire plata amoniacal solución y enjuague con agua destilada.
   6. Retire el agua destilada. Añadir 200 μL de cloruro de oro 0.1% e incúbelos durante 2 min a TA.
   7. Retire la solución de cloruro de oro 0.1% y enjuagar con agua destilada.
   8. Retire el agua destilada. Añadir 200 μL de solución de tiosulfato de sodio (5%, p/v) e incubar durante 2 minutos.
   9. Retire la solución de tiosulfato de sodio y enjuagar con agua destilada.
   10. Retire el agua destilada. Añadir 200 μL de Nuclear Fast Red e incubar durante 5 minutos.
   11. Quite Nuclear Fast Red y enjuague con agua del grifo.
   12. Retire el agua del grifo y observar las células bajo un microscopio.
2. Coloración de Fontana-Masson (umbral de análisis usando ImageJ)
   Nota: Se muestra un ejemplo del procedimiento de análisis de imagen utilizando el software ImageJ en los materiales complementarios.
   1. Abrir el programa ImageJ.
   2. Seleccione archivo | Abierto | Imagen de microscopio.
   3. Selecciona la imagen | Ajustar | Umbral de color.
   4. Para medir el área manchado con Fontana-Masson, la barra de parámetro de brillo a cero y ajuste la barra de brillo para encontrar el punto en que se incluyen todas las células manchadas (negro o marrón oscuro).
   5. Seleccione analiza | Analizar las partículas. Marque la casilla de resumir en la ventana de partículas analizar y pulse OK. Obtener el resultado Resumen y pegar en una hoja de cálculo.
      Nota: La descripción de los parámetros de la caja resultante es la siguiente:
      Slice: El nombre de cada imagen
      Cuenta: Número de células
      Superficie total: Superficie Total de células contadas
      Tamaño promedio: Área/número Total
      % Área: manchado área área Total × 100%; área total se calcula automáticamente.
   6. Calcular el correspondiente área manchada con melanina utilizando el valor de superficie Total.
      Melanina relativa teñido área (%) = valor de la superficie celular de la superficie total de la muestra/media prueba de control × 100, es decir,

Resultados

Resultados representativos para la actividad de hipopigmentación de la arbutina, un anti-melanogenic compuesto, en B16F10 melanocitos se muestran a continuación. Figura 1A muestra que arbutin suprimió significativamente la actividad de la tirosinasa celular en comparación con el control tratados con vehículo. Del mismo modo, el contenido de melanina de las células estimuladas con arbutin se redujo significativamente en comparación con los controles (

Discusión

Se han presentado protocolos para la evaluación de la actividad de hipopigmentación de prueba compuestos con melanocitos cultivados. Resultados representativos mostraron el efecto de hipopigmentación de la arbutina, un inhibidor de la tirosinasa que inhibió el contenido de melanina de celular y actividad de tirosinasa. Estos métodos son ampliamente utilizados en la investigación de actividad anti-melanogenic. Mediante estos ensayos, que con éxito hemos identificado varios compuestos bioactivos que tienen efectos i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU