כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

Summary

אנו מתארים שלוש שיטות להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים במבחנה: כימות של פעילות tyrosinase 1) סלולר ותוכן 2) מלנין, או 3) מידה של מלנין מאת צביעת תאי המלנין וניתוח התמונה.

Abstract

מחקר זה מציג שיטות מעבדה כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה. מלנין, הפיגמנט העיקרי של מלנוציטים, הוא מסונתז בתגובה מספר גורמים הסלולר וסביבתיים. המלנין מגן על תאי העור מפני נזק אולטרה, אך יש גם פונקציות biophysical הביוכימי. ייצור יתר או הצטברות של מלנין בעור מלנוציטים עלול לגרום לבעיות עור, כגון, כתמים כהים, melasma, שומות ונמשים. לכן, השליטה של melanogenesis עם סוכנים היפופיגמנטציה חשוב אצל אנשים בעלי צרכים רפואיים או קוסמטיים. מלנין הוא מסונתז בעיקר melanosomes של מלנוציטים תהליך ביוכימי מורכב שנקרא melanogenesis, אשר מושפע חיצוני, פנימי גורמים, כגון הורמונים, דלקות, גיל חשיפה אור אולטרה סגול. אנו מתארים שלוש שיטות כדי לקבוע את הפעילות היפופיגמנטציה של כימיקלים או חומרים טבעיים בתוך המלנוציטים: מדידה של פעילות הסלולר 1) tyrosinase ו 2) מלנין תוכן, ו 3) צביעת וכימות מלנין הסלולר עם תמונה ניתוח.

ב- melanogenesis, tyrosinase מזרז את הצעד הגבלת קצב הממירה L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (בסדר גמור) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. לכן, עיכוב של tyrosinase הוא מנגנון היפופיגמנטציה תפקידים ראשיים. ב מלנוציטים תרבותי, ניתן לכמת פעילות tyrosinase על-ידי הוספת בסדר גמור כמו מצע ומדידת dopaquinone הייצור על ידי ספקטרופוטומטר. Melanogenesis גם נמדד על ידי לכימות התוכן מלנין. השבר תאי המלנין המכילים מופק עם NaOH, מלנין הוא לכמת spectrophotometrically. לבסוף, ניתן לכמת את התוכן מלנין מאת ניתוח תמונות בעקבות פונטנה-מאסון מכתים של מלנין. למרות התוצאות של מבחני במבחנה אלה לא תמיד לשכפל בעור האדם, שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר melanogenesis, במיוחד כשלב ראשוני לזיהוי פעילות היפופיגמנטציה פוטנציאליים. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך את פעילות מלנוציט צמיחה, בידול. תוצאות עקביות עם שלוש שיטות שונות לוודא את החוקיות של האפקטים.

Introduction

מלנין תפקיד קריטי, פיזיולוגיה, פתולוגיה, טוקסיקולוגיה של מספר איברים לרבות עור, עיניים, המוח¹. התפקידים העיקריים של מלנין תופעות צילום-הקרנה וביוכימי. המלנין סופג אור אינפרא אדום ונראה לעין, כמו גם קרינת אולטרה סגול (UV), עם קליטה מוגברת ממחירים באורכי גל קצרים יותר של אור; לפיכך, מלנין מגן על רקמות מן הנזק שנגרם על ידי האור הנראה או קרינת UV². מלנין הוא נוגד חמצון, יש זיקה מתכות וכימיקלים רעילים אחרים; לכן, זה באפשרותך להגן על רקמות סטרס חמצוני וכימיים³. עם זאת, ייצור יתר של המלנין גורם בעיות עור.

ובאיכות של מלנין בעור, איריס הן גורמים החשובים ביותר של הצבע של איריס, העור. אנשים אולי יש העדפות צבע עור שונים; כמה טובה לעור שזוף, בעוד אחרים לטובת עור בצבעים בהירים יותר. בהתאם פרופילים אלה הצרכן, מוצרי קוסמטיקה היפופיגמנטציה פותחו כדי לספק שווקים נפרדים עבור העור המועדף צבעים⁴. בהתאם לכך, מחקרים של היפופיגמנטציה ופעילות אנטי-melanogenic חשובים הן מבחינה מדעית והן מבחינה מעשית.

Melanogenesis הוא תהליך מורכב של מלנין ביוסינטזה דרך סדרה של תגובות כימיות אנזימטי ספונטנית של מלנוציטים. מלנוציט אחד מוקף כ 36 keratinocytes, melanocytes הם המפעלים סינתזת המלנין להפיץ את המוצר שלהם כדי keratinocytes שכנות. העור, המלנין מיוצר ומאוחסן בתא melanosomal של מלנוציטים מועבר keratinocytes שכנות בתוך האפידרמיס ויה דנדריטים.

L-טירוזין משמשת מצע ראשוני עבור melanogenesis ו- tyrosinase את האנזים מזרז שתי תגובות רצופות להמיר L-טירוזין לתוך 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) ולאחר מכן לתוך dopaquinone. תגובות אלו הן הצעד הגבלת קצב ב-^5,melanogenesis⁶. בהתאם לכך, פעילות היפופיגמנטציה קודם נמדד על ידי הערכת הפעילות התאית tyrosinase ישירות. כדי לעשות זאת, תמציות מלנוציט המכיל tyrosinase מודגרת עם DOPA ולא dopaquinone המיוצר הדגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר-475 ננומטר. הערכים הם מנורמל על ידי ריכוז חלבון של דגימות, וכן חומרים מהתוצאה פעילות היפופיגמנטציה תפקידים במערך dopaquinone פחות בהשוואה עם פקדים.

שנית, ניתן לכמת פעילות היפופיגמנטציה על ידי מדידת מלנין בעור מלנוציטים בתרבית ישירות. לאחר מטפלים תאים עם החומר במבחן, מלנין מופק בתנאים אלקליין, התוכן מלנין הוא לכמת באמצעות ספקטרופוטומטר 400 nm. סוכן היפופיגמנטציה תגרום תוכן מלנין נמוכה יותר מאשר הפקדים⁷.

לבסוף, ניתן לכמת את הפעילות היפופיגמנטציה על ידי פונטנה-מאסון מלנין מכתים וניתוח תמונות עוקבות. פונטנה-מאסון מכתים, גרגרי המלנין להפחית חנקת אמוניה-הכסף למצב מתכתי שחור גלויה, שחור באזורים של תאים בתמונות מיקרוסקופיים מייצגים את כמות המלנין.

סוכן היפופיגמנטציה בדרך כלל נותן תוצאות דומות בקנה אחד עם שלוש שיטות אלה, שמאשר כי הפעילות של החומר הוא חוקי. לחלופין, זה עשוי להיות שימושי למדוד את הביטוי של גנים מרכזיים, חלבונים ב- melanogenesis בתגובה חומר המבחן לבחון פעילות היפופיגמנטציה. בנוסף tyrosinase, חלבונים הקשורים tyrosinase (TRP-1) dopachrome tautomerase (TRP-2) הם קריטיים לאנזימים melanogenesis⁸. גורם שעתוק microphthalmia-הקשורים פקטור שעתוק (MITF) הוא הרגולטור הראשי melanogenesis, כימות של רמות ביטוי גנים/חלבון שלה או assay פעילות יזם יכול לשמש גם כדי להעריך את פעילות היפופיגמנטציה.

Protocol

1. הכנת בינוני, תרכובות, ריאגנטים

1. להכין B16F10 מדיום מלאה של הגידול. תוספת של Dulbecco ששינה בינוני הנשר (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (המזיק).
   1. כדי להפוך את 500 מ"ל של מדיום מלאה, מערבבים 445 מ הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) 50 מ של FBS, 5 מ של המזיק בבקבוק זכוכית מעוקר 1 ליטר. לאחר ערבוב בעדינות, לסנן את המדיום דרך מסנן בקבוק-העליון 0.2-מיקרומטר בקבוק זכוכית מעוקר חדש, אז החנות ב 4 º C.
      התראה: לכל שיטות חקלאות התא צריך להתבצע ב- cabinet באמצעות הטכניקה aseptic כדי להבטיח עקרות מיקרוביולוגית בטיחות.
2. הכנת מאגר פירוק: 20 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane המכיל מאגר טריטון X-100 (וי/v) 0.1% ב- pH 7.5 (pH מותאם עם HCl). מאגר זה יכול לשמש במשך 3 חודשים כאשר בטמפרטורת החדר (RT). מוסיפים מעכבי פרוטאז למאגר פירוק לפני השימוש.
3. להכין tyrosinase מעכב assay מאגר. להכין 1 מ ' נה₂HPO₄ (dibasic) פתרונות מניות של 1 מ ' NaH₂PO₄ (monobasic). מערבבים 46.3 מ ל נה₂HPO₄ ו- 53.7 מ ל₂PO NaH₄ להכין נפח סופי של 0.1 M סודיום פוספט מאגר (pH 6.8).
   1. לדלל התערובת המתקבלת 1 ליטר (נפח סופי) עם H₂O. התאם את רמת החומציות של הפתרון הסופי את 6.8. מאגר זה יכול לשמש במשך חודש כאשר הוא מאוחסן ב 4 º C.
4. להכין tyrosinase המצע פתרון: 0.1% 3,4-dihydroxy-L-פנילאלנין (DOPA, w/v) מומס tyrosinase מעכב assay מאגר (עיין שלב 1.3).
   התראה: לשמור על הקרח במהלך השימוש.
5. לחלופין, להכין 100 tyrosinase פטריות U/mL. להמיס את tyrosinase פטריות lyophilized במאגר assay מעכבי tyrosinase. פתרון זה יכול לשמש למשך 2 חודשים כאשר הוא מאוחסן ב –20 ° C פעילות tyrosinase פטריות, כמו גם פעילות הסלולר tyrosinase מחושבים בנוכחות חומרים בתא.
   התראה: הפתרון הוא aliquoted לפני הקפאת ובכך חזר על הקפאה, מפשיר ניתן להימנע. שמור את הפתרון על קרח במהלך השימוש.
6. להכין פתרון 1 N NaOH. שוקלת 4 g של NaOH בבקבוקון נפחי, להמיס במים מזוקקים לעשות 100 מ.
7. להכין פתרון קיבעון (10% פורמלין). לדלל 27 מ"ל של 37% פורמלדהיד עם 73 מ ל מים מזוקקים. להכין טרי מדי יום.
8. להכין את אמוני פתרון מלאי כסף. להכין 5 מ של 10% כסף חנקתי פתרון סטריליות. הוספת אמוניה מימית פתרון dropwise, עד התפרקה לחלוטין התמיסה. להוסיף 200 μL של כסף חנקתי פתרון (10%). הפתרון יהיה מעט עכורים.
   התראה: להימנע קשר אינהלציה. השתמש ברדס fume.
9. להכין את אמוני הפתרון עובד כסף. למהול 2.5 מ של פתרון מלאי כסף אמוני עם 7.5 מ ל מים מזוקקים. שימוש פעם אחת ולאחר מכן למחוק.
   התראה: להימנע קשר אינהלציה. השתמש ברדס fume.
10. הכנת 0.1% זהב כלורי. להכין 1 מ"ל של 10% זהב כלורי ולהוסיף 99 מ ל מים מזוקקים בבקבוקון הנפחי. להכין טרי מדי יום.
11. להכין תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS). הוסף 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 g של Na-₂-HPO-₄ ו- g 0.24₂פו ח'₄ ב- 800 מ ל מים מזוקקים. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl. Dilute התערובת המתקבלת 1 ליטר (נפח סופי) עם מים מזוקקים.
12. להכין פתרון נתרן תיוסולפט 5% (w/v) מומס במים מזוקקים.

2. התא תרבות וטיפול

1. להשתמש בתאים B16F10 זמינים מסחרית. לשמור על התאים B16F10 בינוני מלא. לשמור את הבקבוקון תרבות תא humidified, 5% CO₂ אווירה חממה ב 37 º C.
2. הכנת תרכובות בדיקה, בקרה חיובית מעכב ודוגמאות שליטה שלילי.
   1. להמיס מבחן תרכובות של ממיסים המתאים. להמיס חומרים מסיסים במים מים מזוקק פעמיים. להמיס חומרים לא מסיסים במים המתאים הממס האורגני, למשל., דימתיל סולפוקסיד.
   2. . הנה, תשתמש יערות מומס במים מזוקק פעמיים (125 μg/mL) כפקד חיובי כדי להעריך את הפעילות היפופיגמנטציה לעומת מבחן תרכובות או פקד שלילי. כפקד שלילי (בקרת רכב שטופל), השתמש פתרונות או מאגרים המשמשים את מבחן לדוגמה, למשל, מזוקק פעמיים מים, דימתיל סולפוקסיד, אתנול.
3. תא זריעה וטיפול
   1. זרעי B16F10 התאים × 10 5⁴ תאים/טוב ב- 24-ובכן תרבות צלחות באמצעות בינוני מלא, דגירה ב חממה₂ CO במשך 24 שעות ביממה. לאחר דגירה, תשאף המדיום מלאה.
   2. דגירה תאים DMEM בינונית (ללא FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין) המכילה תרכובות מבחן, פקד מעכב או על פקד שלילי חממה₂ CO עבור ה 72 סימון תאים בכל 24 שעות מתחת למיקרוסקופ. לאחר שלב זה, לעבור אל השלבים 3-5 לניסויים נוספים.
      התראה: התערובת של חומר המבחן, DMEM בינוני לסנן דרך מסנן 0.2 μm.

3. מדידת הפעילות התאית Tyrosinase

1. באמצעות השיטה המתוארת בשלב 2, להסיר מדיה ולשטוף תאים פעמיים עם 300 μL ל- PBS קר.
2. מניחים את הצלחת התרבות התא על קרח. הוסף μL 300 פירוק מאגר ' תקופת דגירה של 5 דקות. לאחר מכן לאסוף lysate להשתמש במגרדת התא התא, התא lysate להעביר צינור 1.5-mL microcentrifuge.
3. Homogenize תא lysate עם מהמגן תא ב rpm 14,500 2 s, 3 פעמים על הקרח כדי לקבל tyrosinase תאיים. שימוש במצב האופטימלי ספציפי מהמגן.
4. צנטריפוגה 10 דקות ב × 12,000 g ב 4 ° C, להעביר את התא supernatant צינור 1.5-mL microcentrifuge. לשמור על הקרח במהלך השימוש.
5. העברת μL 70 של תגובת שיקוע microplate 96-ובכן ברור פוליסטירן.
6. להוסיף μL 140 של פתרון המכיל tyrosinase המצע (DOPA) כדי microplate 96-ובכן ברור פוליסטירן לנער בעדינות, תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
7. אופציונלי, להוסיף 70 μL של פתרון פטריות tyrosinase U/mL 100 מכל קידוח, תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
8. למדוד את הפעילות tyrosinase באורך-גל של 475 nm באמצעות קורא microplate.
9. לנרמל את הפעילות tyrosinase חלבון לריכוז כל דגימה. למדוד את ריכוז חלבון כל מדגם על ידי וזמינותו ברדפורד.

4. מדידת מלנין תוכן

1. באמצעות השיטה המתוארת ב- ' שלב 2, להסיר מדיה ולשטוף תאים פעמיים עם 300 μL ל- PBS קר.
2. מניחים את הצלחת התרבות התא על קרח. הוסף μL 300 פירוק מאגר ' תקופת דגירה של 5 דקות. לאחר מכן לאסוף lysate להשתמש במגרדת התא התא, התא lysate להעביר צינור 1.5-mL microcentrifuge.
3. צנטריפוגה 10 דקות ב × 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
4. להעביר את תגובת שיקוע חדש צינור ולמדוד חלבון הכולל ריכוז של נורמליזציה. למדוד את ריכוז חלבון כל מדגם על ידי וזמינותו ברדפורד.
5. להוסיף 300 μL של 1 N NaOH כל גלולה, דגירה ב 60 מעלות צלזיוס לשעה.
6. Centrifuge הפתרון מומסים עבור 10 דקות ב × 12,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
7. העברת μL 200 של תגובת שיקוע microplate 96-ובכן.
8. למדוד את התוכן מלנין באורך-גל של 400 nm.
9. לנרמל את התוכן מלנין לריכוז החלבון.

5. פונטנה – מאסון מכתים

1. פונטנה – מאסון מכתים
   1. רחץ תאים פעמיים עם 300 μL ל- PBS קר.
   2. להוסיף 200 μL של פורמלין 10% מכל קידוח, תקופת דגירה של h 1-4 מעלות צלזיוס.
   3. לשטוף עם מים מזוקקים.
   4. להוסיף 200 μL ומחוממת מראש כסף אמוני עובד פתרון, תקופת דגירה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס, או עד התאים להיות בצבע צהוב/חום.
      התראה: למקם טריים הפתרון עובד אמוני כסף באמבט מים 58-60 מעלות צלזיוס, מאפשרים זמן לטמפרטורה equilibrate נאותה.
   5. להסיר את אמוני כסף עובד פתרון ולשטוף עם מים מזוקקים.
   6. הסר מים מזוקקים. להוסיף 200 μL של 0.1% זהב כלורי, דגירה למשך 2 דקות ב- RT.
   7. הסרת פתרון כלוריד זהב 0.1% ולשטוף עם מים מזוקקים.
   8. הסר מים מזוקקים. להוסיף 200 μL של נתרן תיוסולפט פתרון (5%, w/v), דגירה למשך 2 דקות.
   9. הסרת פתרון נתרן תיוסולפט ולשטוף עם מים מזוקקים.
   10. הסר מים מזוקקים. להוסיף 200 μL של הגרעין האדום מהר, תקופת דגירה של 5 דקות.
   11. להסיר את הגרעין האדום מהר ולשטוף עם מים מהברז.
   12. להסיר את מי הברז ולבחון את התאים מוכתם תחת מיקרוסקופ.
2. פונטנה – מאסון מכתים (סף ניתוח באמצעות ImageJ)
   הערה: דוגמה של ההליך ניתוח תמונה באמצעות תוכנה ImageJ מוצג החומרים משלימה.
   1. פתח את התוכנית ImageJ.
   2. בחר קובץ | פתוח | תמונת מיקרוסקופ.
   3. בחר את התמונה | התאם | צבע הסף.
   4. כדי למדוד את השטח מוכתם פונטנה – מאסון, מוגדר הבר פרמטר הבהירות אפס ולהתאים הבר בהירות כדי לאתר את הנקודה שבה כלולים כל התאים ויטראז'ים (שחור או חום).
   5. בחר לנתח | לנתח חלקיקים. סמן את התיבה סכם בחלון חלקיקים נתח ' ולחץ על ' אישור'. להשיג את התוצאה סיכום ולהדביק לתוך גיליון אלקטרוני.
      הערה: התיאור של הפרמטרים תיבת וכתוצאה מכך הן כדלקמן:
      פרוסת: השם של כל תמונה
      ספירה: מספר התאים מוכתם
      שטח: שטח כולל של התאים שנספרו
      גודל ממוצע: סה כ שטח/ספירה
      אזור %: מוכתם לאזור/סה כ שטח × 100%; השטח הכולל מחושב באופן אוטומטי.
   6. לחשב היחסית באזור מוכתם מלנין באמצעות הערך של שטח כולל.
      מלנין היחסי צבעונית אזור (%) = ערך של שטח הסלולר בדיקת הדגימה/ממוצע בשטח כולל של שליטה × 100, קרי,

תוצאות

נציג תוצאות הפעילות היפופיגמנטציה של יערות, anti-melanogenic במתחם, ב- B16F10 מלנוציטים מוצגים להלן. איור 1A מציג שאת יערות באופן משמעותי לדכא את הפעילות התאית tyrosinase לעומת הפקד שטופלו הרכב. באופן דומה, התוכן המלנין בתאי מגורה עם יערות פחתו משמעותית בהשוואה עם הפקדים (...

Discussion

הצגנו פרוטוקולים להערכת הפעילות היפופיגמנטציה של תרכובות בדיקת שימוש בתרבית מלנוציטים. התוצאות נציג הראו את השפעת היפופיגמנטציה יערות, מעכב tyrosinase זה עכבות פעילות tyrosinase ותוכן מלנין הסלולר. שיטות אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקר פעילות אנטי-melanogenic. באמצעות מבחני האלה, גם בהצלחה זיהינו מספר תר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU