Quantification de l’activité In Vitro de l’Hypopigmentation

Résumé

Nous décrivons trois méthodes expérimentales pour l’évaluation de l’activité de l’hypopigmentation des produits chimiques in vitro : quantification du contenu de l’activité et la mélanine 2) tyrosinase 1) cellulaire et 3) mesure de mélanine de mélanine cellulaire coloration et analyse d’images.

Résumé

Cette étude présente les méthodes de laboratoire pour la quantification de l’hypopigmentation activité in vitro. La mélanine, le pigment majeur dans les mélanocytes, est synthétisée en réponse à de multiples facteurs cellulaires et de l’environnementales. La mélanine protège les cellules de la peau contre les dommages UV, mais a aussi des fonctions biochimiques et biophysiques. Production excessive ou l’accumulation de mélanine dans les mélanocytes peut causer des problèmes dermatologiques, comme les taches de rousseur, taches brunes, mélasma et taupes. Donc, le contrôle de la mélanogenèse avec des agents de l’hypopigmentation est important chez les personnes nécessitant des soins cliniques ou cosmétiques. La mélanine est principalement synthétisée dans les mélanosomes de mélanocytes dans un processus biochimique complexe appelé mélanogénèse, qui est influencé par extrinsèque et facteurs intrinsèques, tels que les hormones, l’inflammation, l’âge et exposition à la lumière ultraviolette. Nous décrivons trois méthodes permettant de déterminer l’activité de l’hypopigmentation de produits chimiques ou des substances naturelles dans les mélanocytes : mesure de l’activité de la tyrosinase 1) cellulaires et teneur en mélanine 2) 3) coloration et quantification mélanine cellulaire avec image analyse.

Dans la mélanogénèse, tyrosinase catalyse l’étape cinétiquement limitante qui convertit la L-tyrosine en 3, 4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA), puis en dopaquinone. Par conséquent, l’inhibition de la tyrosinase est un mécanisme primaire d’hypopigmentation. Les mélanocytes, activité de la tyrosinase peut être quantifiée en ajoutant la L-DOPA comme substrat et en mesurant la dopaquinone production par spectrophotométrie. Mélanogénèse peut également être mesurée en quantifiant la teneur en mélanine. La fraction cellulaire contenant de la mélanine est extraite avec NaOH et la mélanine est quantifiée par spectrophotométrie. Enfin, la teneur en mélanine peut être quantifiée par analyse d’image après coloration de Fontana-Masson de la mélanine. Bien que les résultats de ces essais in vitro ne peuvent pas toujours être reproduits dans la peau humaine, ces méthodes sont largement utilisés dans la recherche de la mélanogénèse, surtout comme l’étape initiale pour identifier l’activité potentielle de l’hypopigmentation. Ces méthodes permettent également d’évaluer la différenciation, la croissance et l’activité des mélanocytes. Des résultats cohérents avec les trois différentes méthodes assurer la validité des effets.

Introduction

Mélanine joue un rôle essentiel dans la physiologie, la pathologie et toxicologie de plusieurs organes, y compris la peau, des yeux et cerveau¹. Principales fonctions de mélanine sont effets photo-dépistage et biochimiques. La mélanine absorbe la lumière visible et proche infrarouge ainsi que des rayonnements ultraviolets (UV), avec des taux d’absorption accrue de courtes longueurs d’onde de la lumière ; ainsi, la mélanine protège les tissus contre les dommages causés par la lumière visible ou UV radiation². La mélanine est un antioxydant et a une affinité pour les métaux et autres produits chimiques toxiques ; par conséquent, il peut protéger des tissus du stress oxydatif et chimiques³. Cependant, la production excessive de mélanine entraîne des problèmes dermatologiques.

La quantité et la qualité de la mélanine dans la peau et les iris sont les déterminants les plus importants de la couleur de l’iris et la peau. Personnes peuvent avoir des préférences de couleur de peau différente ; certains favorisent la peau bronzée, tandis que d’autres favorisent les couleurs de peau plus légères. Selon ces profils de consommateurs, une hypopigmentation cosmétiques ont été développés pour satisfaire les marchés individuels pour peau favorisée couleurs⁴. En conséquence, études d’activité hypopigmentation et anti-mélanogenèse sont importantes tant scientifiquement que pratiquement.

Mélanogénèse est le complex processus de biosynthèse de la mélanine par une série de réactions chimiques enzymatiques et spontanées dans les mélanocytes. Un mélanocyte est entouré d’environ 36 kératinocytes et mélanocytes sont les usines de synthèse de la mélanine qui distribuent leurs produits aux kératinocytes voisins. Dans la peau, la mélanine produite et stockée dans le compartiment de melanosomal de mélanocytes est transportée vers les kératinocytes voisins dans l’épiderme via dendrites.

L-Tyrosine sert de substrat initial pour la mélanogénèse et l’enzyme tyrosinase catalyse deux réactions consécutives qui convertissent la L-tyrosine en 3, 4-dihydroxyphénylalanine (DOPA), puis en dopaquinone. Ces réactions sont l’étape cinétiquement limitante dans la mélanogénèse^5,6. En conséquence, une hypopigmentation activité peut tout d’abord être mesurée en évaluant l’activité de la tyrosinase cellulaire directement. Pour ce faire, des extraits de mélanocytes contenant la tyrosinase sont incubés avec DOPA et la dopaquinone produite dans les échantillons peut être mesurée par spectrophotométrie à 475 nm. Les valeurs sont normalisées par les concentrations de protéines des échantillons et les substances ayant une hypopigmentation activité donnent lieu à moins dopaquinone formation comparée aux témoins.

Deuxièmement, une hypopigmentation activité peut être quantifiée en mesurant la mélanine dans les mélanocytes cultivés directement. Après le traitement des cellules avec la substance d’essai, la mélanine est extraite dans des conditions alcalines et de la teneur en mélanine est quantifiée par spectrophotométrie à 400 nm. Un agent de l’hypopigmentation se traduira par une plus faible teneur de mélanine que les contrôles⁷.

Enfin, l’activité de l’hypopigmentation peut être quantifiée par la coloration de la mélanine de Fontana-Masson et analyse d’images ultérieures. Coloration de Fontana-Masson, granules de mélanine réduisent le nitrate d’ammoniaque et d’argent à un état métallique noir visible et les zones noires de cellules dans des images microscopiques représentent la quantité de mélanine.

Un agent de l’hypopigmentation donne généralement des résultats cohérents et comparables avec ces trois méthodes, qui confirme que l’activité de la substance est valide. Alternativement, il peut être utile de mesurer l’expression des gènes clés et des protéines dans la mélanogénèse en réponse à une substance d’essai pour examiner l’activité hypopigmentation. En plus de la tyrosinase, protéines tyrosinase (TRP-1) et tautomerase tautomèrase (TRP-2) sont des enzymes critiques dans la mélanogénèse⁸. Le facteur de transcription associée à une microphtalmie de facteur de transcription (MITF) est un maître régulateur dans la mélanogénèse et la quantification des niveaux d’expression de ses gènes/protéines ou un dosage de l’activité du promoteur permet également d’évaluer l’activité hypopigmentation.

Protocole

1. préparation du milieu, composés et réactifs

1. Préparer le milieu complet de croissance B16F10. Supplément Dulbecco aigle modifié (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine (PEST).
   1. Pour faire 500 mL de milieu complet, mélangez 445 mL du milieu de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 50 mL de FBS et 5 mL de PEST dans une bouteille en verre stérilisé 1 L. Après avoir mélangé doucement, le support de filtration par un filtre de flacon de 0,2 µm pour une nouvelle bouteille en verre stérilisé et puis conserver à 4 ° C.
      Attention : Toutes les techniques de culture cellulaire devraient être entreprises en sécurité microbiologique utilise une technique aseptique pour assurer la stérilité.
2. Préparer le tampon de lyse : 20 mM Tris (hydroxyméthyl) aminométhane contenant 0,1 % X-100 Triton (v/v) tampon à pH 7.5 (pH ajusté avec HCl). Ce tampon peut être utilisé pendant 3 mois lorsqu’il est conservé à température ambiante (RT). Inhibiteurs de la protéase s’ajoute le tampon de lyse juste avant utilisation.
3. Préparation du tampon d’inhibiteur de la tyrosinase. Préparer 1 M NaH₂PO₄ (monobasique) et 1 M Na₂HPO₄ (dibasiques) solutions mères. Mélanger 46,3 mL de Na₂HPO₄ et 53,7 mL de NaH₂PO₄ pour préparer un volume final de tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 6,8).
   1. Diluer le mélange dans 1 L (volume final) avec H₂O. ajuster le pH de la solution finale à 6,8. Ce tampon peut être utilisé pendant 1 mois lorsqu’il est conservé à 4 ° C.
4. Préparer la solution de substrat de tyrosinase : 0,1 % 3, 4-dihydroxy-L-phénylalanine (DOPA, p/v) dissous dans du tampon d’inhibiteur de la tyrosinase (voir étape 1.3).
   Attention : Gardez sur la glace en cours d’utilisation.
5. Vous pouvez également préparer la tyrosinase champignon de 100 U/mL. Dissoudre la tyrosinase champignon lyophilisée dans du tampon d’inhibiteur de la tyrosinase. Cette solution peut être utilisée pendant 2 mois lorsqu’il est conservé à-20 ° C. L’activité de la tyrosinase aux champignons, mais aussi les activité de la tyrosinase cellulaires est calculée en présence des matériaux cellulaires.
   Attention : La solution est aliquotée avant congélation ainsi répétée de gel et de dégel peut être évité. Conserver la solution sur la glace en cours d’utilisation.
6. Préparer une solution de NaOH N 1. 4 g de NaOH dans une fiole jaugée de peser et dissoudre dans l’eau distillée pour faire 100 mL.
7. Préparer la solution de fixation (formol à 10 %). Diluer 27 mL de 37 % de formaldéhyde par 73 mL d’eau distillée. Préparer les frais du jour.
8. Préparer la solution ammoniacale d’argent stock. Préparer 5 mL de solution de nitrate d’argent 10 % dans une fiole jaugée. Ajouter la solution d’hydroxyde d’ammonium goutte à goutte, jusqu'à ce que le précipité soit complètement dissout. Ajouter 200 μl de solution de nitrate d’argent (10 %). La solution va devenir légèrement trouble.
   Attention : Éviter le contact et l’inhalation. Utiliser une hotte aspirante.
9. Préparer la solution ammoniacale d’argent travail. Diluer 2,5 mL de solution ammoniacale d’argent stock 7,5 ml d’eau distillée. Utiliser une seule fois et le jeter.
   Attention : Éviter le contact et l’inhalation. Utiliser une hotte aspirante.
10. Préparer le chlorure d’or de 0,1 %. Préparer 1 mL de chlorure d’or de 10 % et ajouter 99 mL d’eau distillée dans une fiole jaugée. Préparer les frais du jour.
11. Préparer une solution saline du tampon phosphate (PBS). Ajouter 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ et 0,24 g de KH₂PO₄ dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 7,4 avec HCl. diluer le mélange dans 1 L (volume final) avec de l’eau distillée.
12. Préparer la solution de thiosulfate de sodium 5 % (p/v) dissoute dans l’eau distillée.

2. Culture et traitement des cellules

1. Utiliser des cellules de B16F10 disponibles dans le commerce. Maintenir les cellules B16F10 en milieu complet. Maintenir le flacon de culture cellulaire dans une humidifié, 5 % CO₂ atmosphère incubateur à 37 ° C.
2. Préparer des composés d’essai, contrôle positif inhibiteur et des échantillons de contrôle négatif.
   1. Dissoudre les composés d’essai dans le solvant approprié. Dissoudre les composés solubles dans l’eau dans l’eau bidistillée. Dissoudre l’eau des composés insolubles dans un solvant organique approprié, par exemple., DMSO.
   2. Ici, utilisez arbutine dissous dans l’eau bidistillée (125 μg/mL) comme témoin positif pour évaluer l’activité de l’hypopigmentation comparée aux composés d’essai ou un témoin négatif. Comme témoin négatif (témoin véhicule), utiliser les solutions ou les tampons utilisés dans l’échantillon d’essai, par exemple, eau bidistillée, DMSO, éthanol.
3. Ensemencement de la cellule et le traitement
   1. Cellules B16F10 graines à 5 × 10,⁴ cellules/puitsent dans les plaques de culture de 24 puits à l’aide de milieu complet et incuber dans un incubateur à CO₂ pendant 24 h. Après incubation, aspirer le milieu complet.
   2. Incuber les cellules avec milieu DMEM (sans SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine) contenant des composés d’essai, un contrôle inhibiteur ou un contrôle négatif dans un incubateur à CO₂ pour les cellules de 72 h. Vérifiez toutes les 24 h sous le microscope. Après cette étape, aller aux étapes 3 à 5 pour les autres expériences.
      Attention : Le mélange de la substance d’essai et de milieu DMEM doit être filtré par un filtre de 0,2 μm.

3. mesure de l’activité cellulaire de la Tyrosinase

1. À l’aide de la méthode décrite à l’étape 2, retirez les supports et rincer les cellules deux fois avec 300 μl de PBS froid.
2. Placer la plaque de culture cellulaire sur la glace. Ajouter 300 μl de tampon de lyse et incuber pendant 5 min. Puis recueillir la cellule à l’aide d’un grattoir de cellules lysate et transférer le lysat cellulaire dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
3. Homogénéiser le lysat cellulaire avec un homogénéisateur de cellule à 14 500 tr/min pendant 2 s, 3 fois sur la glace afin d’obtenir la tyrosinase intracellulaire. L’état optimal spécifique d’utilisation pour l’homogénéisateur.
4. Centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g à 4 ° C et transférer la cellule surnageante dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Rester sur la glace en cours d’utilisation.
5. Transférer 70 μL du liquide surnageant d’une microplaque 96 puits transparent en polystyrène.
6. Ajouter 140 μL d’une solution contenant le substrat de la tyrosinase (DOPA) pour une microplaque 96 puits clair en polystyrène, remuez délicatement et incuber pendant 2 h à 37 ° C.
7. En option, ajouter 70 μL de solution de tyrosinase champignons 100 U/mL dans chaque puits et incuber pendant 2 h à 37 ° C.
8. Mesurer l’activité de la tyrosinase à une longueur d’onde de 475 nm en utilisant le lecteur de microplaques.
9. Normaliser l’activité de la tyrosinase à la concentration de protéines de l’échantillon. Mesurer la concentration de protéines de l’échantillon par une analyse de Bradford.

4. mesurer la teneur en mélanine

1. À l’aide de la méthode décrite à l’étape 2, retirez les supports et rincer les cellules deux fois avec 300 μl de PBS froid.
2. Placer la plaque de culture cellulaire sur la glace. Ajouter 300 μl de tampon de lyse et incuber pendant 5 min. Puis recueillir la cellule à l’aide d’un grattoir de cellules lysate et transférer le lysat cellulaire dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
3. Centrifugation pendant 10 min à 12 000 × g à 4 ° C.
4. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et mesure concentration de protéines pour la normalisation. Mesurer la concentration de protéines de l’échantillon par une analyse de Bradford.
5. Ajouter 300 μL de NaOH N 1 dans chaque boulette et incuber à 60 ° C pendant 1 h.
6. Centrifuger la solution dissoute pendant 10 min à 12 000 × g à 4 ° C.
7. Transférer 200 μL du liquide surnageant d’une microplaque 96 puits.
8. Mesurer le contenu de mélanine à une longueur d’onde de 400 nm.
9. Normaliser le contenu de mélanine à la concentration de protéine.

5. Fontana – Masson coloration

1. Coloration de Fontana – Masson
   1. Laver les cellules deux fois avec 300 μl de PBS froid.
   2. Ajouter 200 μl de 10 % de formol dans chaque puits et incuber pendant 1 h à 4 ° C.
   3. Rincer à l’eau distillée.
   4. Ajouter 200 μL d’argent ammoniacal préchauffé, solution de travail et incuber pendant 1 heure à 37 ° C ou jusqu'à ce que les cellules deviennent couleur jaune/brun.
      Attention : Placer mélangeage solution ammoniacale d’argent travail dans un bain d’eau de 58 à 60° C et laisser suffisamment de temps pour la température de s’équilibrer.
   5. Retirer argent ammoniacal, solution de travail et rincer à l’eau distillée.
   6. Enlevez l’eau distillée. Ajouter 200 μl de chlorure d’or de 0,1 % et incuber pendant 2 min à température ambiante.
   7. Enlever la solution de chlorure d’or de 0,1 % et rincer à l’eau distillée.
   8. Enlevez l’eau distillée. Ajouter 200 μl de solution de thiosulfate de sodium (5 %, p/v) et incuber pendant 2 min.
   9. Enlever la solution de thiosulfate de sodium et rincer à l’eau distillée.
   10. Enlevez l’eau distillée. Ajouter 200 μl de nucléaire Fast Red et incuber pendant 5 min.
   11. Supprimer le nucléaire Fast Red et rincer à l’eau du robinet.
   12. Enlever l’eau du robinet et d’observer les cellules colorées sous un microscope.
2. Coloration de Fontana – Masson (seuil analyse utilisant ImageJ)
   Note : Un exemple de la procédure d’analyse image à l’aide de logiciels ImageJ est présenté dans les documents complémentaires.
   1. Ouvrez le programme ImageJ.
   2. Sélectionnez le fichier | Ouvert | Image microscopique.
   3. Sélectionnez Image | Ajuster | Seuil de couleur.
   4. Pour mesurer la zone tachée avec Fontana – Masson, sur la barre du paramètre luminosité zéro et ajustez la barre de luminosité pour trouver le point où toutes les cellules colorées (noir ou brun foncé) sont inclus.
   5. Sélectionnez analyse | Analyser les particules. Cochez la case de résumer dans la fenêtre de particules analyze et appuyez sur OK. Obtenir le résultat analytique et collez dans une feuille de calcul.
      Remarque : La description des paramètres boîte qui en résulte sont les suivantes :
      Tranche : Nom de chaque image
      Count : Nombre de cellules colorées
      Superficie : La superficie totale des cellules comptées
      Taille moyenne : Zone/Nombre Total
      Superficie : teinté région/Total zone × 100 % ; superficie totale est calculée automatiquement.
   6. Calculer le proche zone tachée de mélanine à l’aide de la valeur de superficie totale.
      Mélanine relative teintée de zone (%) = valeur de superficie cellulaire de la superficie totale de test échantillon/moyen de contrôle sur 100, c'est-à-dire,

Résultats

Des résultats représentatifs de l’activité de l’hypopigmentation de l’arbutine, un anti-mélanogenèse composés en B16F10 mélanocytes sont indiqués ci-dessous. Figure 1 a montre qu’arbutine supprimée significativement l’activité de la tyrosinase cellulaires comparée au témoin imprégnées sur le véhicule. De même, la teneur en mélanine des cellules stimulées avec arbutine a été réduite significativement par rapport aux témoins (

Discussion

Nous avons présenté des protocoles d’évaluation de l’activité de l’hypopigmentation des composés d’essai à l’aide de mélanocytes cultivés. Les résultats représentatifs ont montré l’effet de l’hypopigmentation de l’arbutine, un inhibiteur de la tyrosinase qui inhibe la tyrosinase activité et cellulaires mélanine contenu. Ces méthodes sont largement utilisées dans la recherche de l’activité anti-mélanogénique. À l’aide de ces tests, nous avons identifié avec succès plusieurs compos?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU