Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

Özet

Biz kimyasallar tüp bebek hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için üç deneysel yöntemleri tarif: miktar 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve 3) melanin hücresel melanin boyama ve görüntü analizi tarafından ölçümü.

Özet

Bu çalışmada miktar hipopigmentasyon faaliyet tüp bebek için laboratuvar yöntemleri sunar. Melanin, melanosit, büyük pigment birden çok hücresel ve çevresel faktörler cevaben sentezlenir. Melanin cilt hücrelerini ultraviyole zararlardan korur, ama aynı zamanda biyofiziksel ve biyokimyasal işlevleri vardır. Aşırı üretimi veya melanosit melanin birikimi çiller, siyah noktaları, melazma ve benler gibi dermatolojik sorunlara neden olabilir. Bu nedenle, hipopigmentasyon ajanlar ile melanogenesis kontrolünü klinik veya kozmetik ihtiyaçları olan bireylerde önemlidir. Melanin öncelikle melanosit etkilenir melanogenesis dışsal olarak adlandırılan karmaşık biyokimyasal bir süreç ve hormonlar, iltihap, yaş ve ultraviyole ışık pozlama gibi Intrinsic faktörler melanosomes sentezlenir. Biz, kimyasal madde veya melanosit doğal maddelerin hipopigmentasyon etkinliğini belirlemek için üç yöntem tarif: 1) hücresel Tirozinaz etkinlik ve 2) melanin içerik ve görüntü ile 3) Boyama ve sayısal hücresel melanin ölçüm analiz.

Melanogenesis, L-tirozin 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ve sonra dopaquinone içine dönüştürür hızı sınırlaması adım Tirozinaz tromboksan. Bu nedenle, Tirozinaz inhibisyonu bir birincil hipopigmentasyon mekanizmadır. Kültürlü melanosit içinde Tirozinaz etkinlik L-DOPA bir substrat ekleyerek ve dopaquinone üretim spectrophotometry tarafından ölçme sayısal. Melanogenesis da melanin içerik miktarının ölçmek. Melanin içeren hücresel kesir NaOH ile elde edilir ve melanin spectrophotometrically sayılabilir. Son olarak, melanin içerik Fontana-Masson melanin boyama aşağıdaki görüntü analizi tarafından sayılabilir. Her ne kadar bu tüp bebek deneyleri sonuçlarını insan cilt her zaman yeniden değil, bu yöntemler melanogenesis araştırma, potansiyel hipopigmentasyon etkinliği tanımlamak için özellikle ilk adımı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemler, melanosit etkinlik, büyüme ve farklılaşma değerlendirmek için de kullanılabilir. Üç farklı yöntem tutarlı sonuçlar etkileri geçerliliğini sağlamak.

Giriş

Melanin fizyolojisi, patoloji ve toksikoloji cilt, göz ve beyin¹de dahil olmak üzere çeşitli organlarının kritik bir rol oynamaktadır. Büyük melanin fotoğraf-tarama ve biyokimyasal etkileri işlevlerdir. Melanin ultraviyole radyasyon, ışığın daha kısa dalga boyları artan emme oranları ile yanı sıra yakın kızılötesi ve görünür ışık emer; Böylece, melanin görünür ışık veya UV radyasyon²neden hasar dokuları korur. Melanin bir antioksidan ve metaller ve diğer toksik kimyasal maddeler için bir ilgi vardır; Bu nedenle, o-ebilmek korumak dokulara kimyasal ve oksidatif stres³. Ancak, aşırı melanin üretimini dermatolojik sorunlarına neden olur.

Miktar ve kalite melanin deride ve iris Iris ve cilt rengini en önemli belirleyicileri vardır. Bireyler farklı cilt renk tercihleri olabilir; diğerleri daha açık cilt renkleri lehine iken bazı tabaklanmış deri, iyilik. Bu tüketici profilleri bağlı olarak hipopigmentasyon kozmetik bireysel pazarlar için tercih cilt renkleri⁴karşılamak için geliştirilmiştir. Buna göre bilimsel ve pratik çalışmalar hipopigmentasyon ve anti-melanogenic aktivitesinin önemlidir.

Melanogenesis melanin biyosentezi melanosit vücudunda kimyasal reaksiyonlar enzimatik ve spontan bir dizi karmaşık işlemidir. Bir melanosit yaklaşık 36 lenfositi tarafından çevrilidir ve melanosit komşu lenfositi onların ürün dağıtmak melanin sentezini fabrikaları vardır. Deride, üretilen ve melanosit melanosomal bölümünde depolanan melanin dendrites epidermis ile komşu lenfositi için taşınır.

L-tirozin 3,4-dihydroxyphenylalanine (BASINCIN) ve sonra dopaquinone içine dönüştürmek iki ardışık tepkileri melanogenesis ve enzim Tirozinaz için ilk substrat tromboksan L-Tyrosine hizmet vermektedir. Bu tepkiler melanogenesis^5,6hızı sınırlaması adım vardır. Buna göre hipopigmentasyon etkinlik ilk doğrudan hücresel Tirozinaz etkinliğini değerlendirmek tarafından ölçülebilir. Bunu yapmak için melanosit özleri içeren Tirozinaz BASINCIN ile inkübe ve örnekleri üretilen dopaquinone spectrophotometry, 475 tarafından ölçülebilir nm. Değerleri örnekleri ve hipopigmentasyon faaliyet sonucu denetimleri ile karşılaştırıldığında daha az dopaquinone oluşumunda maddelerle protein konsantrasyonları tarafından normalleştirilmiş.

İkinci olarak, hipopigmentasyon etkinlik melanin kültürlü melanosit içinde doğrudan ölçerek sayısal. Test materyalini hücrelerle tedavi sonra melanin alkali koşullarda elde edilir ve melanin içerik spectrophotometry 400 tarafından sayısal nm. Hipopigmentasyon Ajan daha düşük bir melanin içerik denetimleri⁷daha neden olur.

Son olarak, hipopigmentasyon etkinlik Fontana-Masson melanin boyama ve sonraki görüntü analizi tarafından sayısal. Fontana-Masson boyama, melanin granülleri amonyak-gümüş nitrat görünür bir siyah metalik durumuna azaltmak ve hücrelerin mikroskobik görüntüler siyah alanlar melanin miktarı gösterir.

Hipopigmentasyon Aracısı genellikle hangi madde etkinliği geçerli olduğunu doğrular Bu üç yöntem ile tutarlı ve benzer sonuçlar verir. Alternatif olarak, bu ifade anahtar genler ve proteinler arasında melanogenesis yanıt hipopigmentasyon etkinliğini incelemek için bir test madde olarak ölçmek yararlı olabilir. Tirozinaz yanı sıra, Tirozinaz kaynaklı proteinler (TRP-1) ve dopachrome tautomerase (TRP-2) kritik melanogenesis⁸enzimlerdir. Transkripsiyon faktörü mikroftalmia ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF) melanogenesis ve miktar onun gen/protein ifade düzeylerinin ana bir düzenleyicisidir veya bir organizatörü etkinliği tahlil hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir.

Protokol

1. orta, bileşikler ve Kimyasalları hazırlanması

1. B16F10 büyüme tam orta hazırlayın. Ek Dulbecco'nın kartal orta (DMEM) ile % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin (zararlı) değiştiren.
   1. 500 mL tam orta yapmak için Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 445 mL 50 mL FBS ve haşere 1 L steril cam şişede 5 mL ile karıştırın. Hafifçe karıştırdıktan sonra orta yeni steril cam şişe ve 4 ° C'de sonra mağaza 0.2 µm şişe-üst filtre ile filtre uygulama
      Dikkat: Tüm hücre kültürü teknikleri Mikrobiyolojik Güvenlik kısırlık sağlamak için aseptik teknik kullanılarak kabine yapılmalıdır.
2. Lizis arabellek hazırlamak: % 0,1 Triton X-100 (v/v) arabellek (pH HCl ile düzeltilmiş) pH 7.5 içeren 20 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane. Bu arabellek-ebilmek var olmak kullanılmış için 3 ay (RT) oda sıcaklığında saklandığında. Proteaz inhibitörleri lizis arabellek kullanmadan önce ekleyin.
3. Tirozinaz inhibitörü tahlil arabellek hazırlayın. 1 M NaH₂PO₄ (yem mono) ve 1 M Na₂HPO₄ (dibasic) stok çözümleri hazırlayın. 46.3 mL Na₂HPO₄ ve 53.7 mL 0.1 M sodyum fosfat tampon (pH 6.8) son hacmi hazırlamak için NaH₂PO₄ karıştırın.
   1. 1 L (son hacim) elde edilen karışıma H₂O. ayarlama 6,8 için nihai çözüm pH sulandırmak. Bu arabellek-ebilmek var olmak kullanılmış için 1 ay 4 ° C'de saklandığında
4. Tirozinaz substrat çözeltisi hazırlamak: %0,1 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (BASINCIN, w/v) çözünmüş Tirozinaz inhibitörü tahlil arabellekte (Adım 1.3 için bakınız).
   Dikkat: buz kullanımda iken tutun.
5. İsteğe bağlı olarak, 100 U/mL mantar Tirozinaz hazırlayın. Lyophilized mantar Tirozinaz Tirozinaz inhibitörü tahlil arabelleği geçiyoruz. Bu eriyik-ebilmek var olmak kullanılmış için 2 ay –20 ° C'de saklandığında Mantar Tirozinaz etkinlik hem de hücresel Tirozinaz etkinliği hücre malzemeleri huzurunda hesaplanır.
   Dikkat: böylece donma donma ve çözdürme önlenebilir tekrar önce bölünmemeli çözümdür. Çözüm buz kullanımda iken üzerinde tutun.
6. 1 N NaOH çözüm hazırlamak. Volumetric flask NaOH 4 g tartmak ve distile su 100 mL yapmak geçiyoruz.
7. Fiksasyon çözüm (% 10 formalin) hazırlayın. 73 mL distile su ile % 37 formaldehit 27 mL seyreltik. Taze günlük hazırlayın.
8. Ammoniacal gümüş hisse senedi çözüm hazırlamak. 5 mL % 10 gümüş nitrat çözeltisi içinde volumetric flask hazırlayın. Amonyum hidroksit çözüm dropwise, çökelti tamamen eriyene kadar ekleyin. Gümüş nitrat çözümü (% 10) 200 μL ekleyin. Belgili tanımlık eriyik-ecek var olmak biraz bulutlu.
   Dikkat: iletişim ve inhalasyon önlemek. Bir duman başlığı kullan.
9. Ammoniacal gümüş çalışma çözüm hazırlamak. Ammoniacal gümüş hisse senedi çözüm 2.5 mL 7,5 mL distile su ile sulandırmak. Bir kez kullanabilir ve sonra atın.
   Dikkat: iletişim ve inhalasyon önlemek. Bir duman başlığı kullan.
10. %0,1 altın klorür hazırlayın. 1 mL % 10 altın klorür hazırlamak ve 99 mL distile su içinde volumetric flask ekleyin. Taze günlük hazırlayın.
11. Fosfat tampon serum (PBS) hazırlayın. NaCl, 8 g 0.2 gram KCl, 1.44 g Na₂HPO₄ ve KH₂PO₄ 800 mL distile su içinde 0,24 g ekleyin. HCl. Dilute 1 M'ye (son hacim) elde edilen karışımı ile distile su ile pH 7.4 için ayarlayın.
12. %5 (w/v) sodyum thiosulfate çözeltisi distile suda hazırlayın.

2. hücre kültür ve tedavi

1. Piyasada bulunan B16F10 hücreler kullanın. B16F10 hücreleri tam ortamda korumak. Oksijen, hücre kültürü şişeyi tutmak % 5 CO₂ atmosfer kuluçka 37 ° C'de
2. Test bileşikleri, inhibitörü pozitif kontrol ve negatif kontrol örnekleri hazır olun.
   1. Uygun çözücüler olarak test bileşikler geçiyoruz. Suda çözünen bileşikler çift distile suda çözülür. Uygun organik çözücü, örneğinsu çözünmez bileşikler geçiyoruz., DMSO.
   2. Burada, çift distile suda (125 μg/mL) çözünmüş arbutin test bileşikleri veya bir negatif kontrol ile karşılaştırıldığında hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için olumlu bir denetim olarak kullanın. Negatif bir denetim (Denetim araç tedavi) çözümler veya kullanılan test örneği, örneğin, çift distile su, DMSO, içinde arabellekleri kullanmak etanol.
3. Hücre tohum ve tedavi
   1. Tohum B16F10 hücreleri 5 × 10⁴ hücreleri/24-şey kültür levha tam orta kullanarak iyi ve CO₂ kuluçka 24 h için kuluçkaya. Kuluçka sonra tam orta Aspire edin.
   2. (Olmadan FBS ve % 1 penisilin/streptomisin) DMEM orta test bileşikleri, inhibitörü kumanda veya CO₂ kuluçka 72 h. onay hücreler mikroskop altında her 24 saat için bir negatif kontrol içeren hücreleri kuluçkaya. Bu adımdan sonra adım 3-5 daha fazla deneyler için gidin.
      Dikkat: Bu test madde ve DMEM orta karışımı 0,2 mikron filtre ile filtre.

3. ölçme hücresel Tirozinaz etkinliği

1. 2. adımda açıklanan yöntemi kullanarak, medyayı çıkarın ve soğuk PBS 300 μL iki kez hücrelerle durulayın.
2. Hücre kültür plaka Buza koyun. 300 μL lizis arabelleği ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. Sonra hücreyi bir hücre kazıyıcı kullanarak lysate toplamak ve lysate hücre 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
3. 14.500 devirde 2 için bir hücre homogenizer ile cep lysate homojenize s, hücre içi Tirozinaz elde etmek için 3 kez buz üzerinde. Homogenizer için en uygun koşul özel kullanın.
4. 12.000 × g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve hücre süpernatant 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Buz kullanımda iken üzerinde tutun.
5. 70 μL süpernatant ile bir 96-şey açık polistren Mikroplaka aktarın.
6. 140 μL Tirozinaz substrat (BASINCIN) bir 96-şey açık polistren Mikroplaka için içeren bir çözüm eklemek, yavaşça sallayın ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
7. İsteğe bağlı, her şey için 70 μL 100 U/mL mantar Tirozinaz çözüm ekleyin ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
8. Bir dalga boyu 475 adresindeki Tirozinaz etkinliği ölçmek Mikroplaka okuyucu kullanarak nm.
9. Her örnek protein konsantrasyonu Tirozinaz faaliyete normalleştirmek. Her örnek protein konsantrasyonu tarafından Bradford tahlil ölçmek.

4. ölçüm Melanin içeriği

1. 2. adımda açıklanan yöntemi kullanarak, medyayı çıkarın ve soğuk PBS 300 μL iki kez hücrelerle durulayın.
2. Hücre kültür plaka Buza koyun. 300 μL lizis arabelleği ekleyin ve 5 min için kuluçkaya. Sonra hücreyi bir hücre kazıyıcı kullanarak lysate toplamak ve lysate hücre 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
3. Santrifüj için 12.000 × g 4 ° C'de 10 dakika
4. Süpernatant normalleştirme için yeni bir tüp ve ölçü toplam protein konsantrasyonu aktarın. Her örnek protein konsantrasyonu tarafından Bradford tahlil ölçmek.
5. 1 N NaOH 300 μL her Pelet ekleyin ve 1 h için 60 ° C'de kuluçkaya.
6. Çözünmüş çözüm için 12.000 × g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
7. 200 μL süpernatant, 96-şey Mikroplaka aktarın.
8. 400 bir dalga boyu melanin içeriği ölçmek nm.
9. Protein konsantrasyonu melanin içindekilere normalleştirmek.

5. Fontana-Masson boyama

1. Fontana-Masson boyama
   1. Hücreleri iki kez soğuk PBS 300 μL ile yıkayın.
   2. Her şey için % 10 formalin 200 μL ekleyin ve 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya
   3. Distile su ile durulayın.
   4. Önceden ısıtılmış ammoniacal gümüş çözüm çalışma 200 μL ekleyin ve 1 h 37 ° C'de veya hücreleri sarı/kahverengi renkte olana için kuluçkaya.
      Dikkat: Taze karıştırılmış ammoniacal gümüş çalışma çözüm bir 58 – 60 ° C su banyosunda yerleştirin ve equilibrate sıcaklık için yeterli zaman sağlar.
   5. Ammoniacal gümüş çözüm çalışma kaldırmak ve distile su ile durulayın.
   6. Distile su kaldırın. %0,1 altın klorür 200 μL ekleyin ve RT. 2 min için kuluçkaya
   7. % 0.1 altın klorür çözümü kaldırmak ve distile su ile durulayın.
   8. Distile su kaldırın. Sodyum thiosulfate çözüm (%5, w/v) 200 μL ekleyin ve 2 min için kuluçkaya.
   9. Sodyum thiosulfate çözümü kaldırmak ve distile su ile durulayın.
   10. Distile su kaldırın. Nükleer hızlı kırmızı 200 μL ekleyin ve 5 min için kuluçkaya.
   11. Nükleer hızlı kırmızı kaldırmak ve musluk suyuyla durulayın.
   12. Musluk suyu çıkarın ve lekeli hücreler mikroskopla gözlemlemek.
2. Fontana-Masson (eşik analizi kullanarak ImageJ) Boyama
   Not: Ek malzemeler ImageJ yazılımını kullanarak görüntü analiz yordamı örneği görüntülenir.
   1. ImageJ programını açın.
   2. Dosyayı seçin | Açık | Mikroskop görüntü.
   3. Görüntü seçin | Ayarlamak | Renk eşiği.
   4. Fontana-Masson ile lekeli alan ölçmek için parlaklık parametre çubuğu sıfır olarak ayarlayın ve hangi tüm lekeli hücreleri (siyah veya koyu kahverengi) dahil edilir noktası bulmak için parlaklık çubuğu ayarlayın.
   5. Seçin analiz | Parçacıklar analiz. Analiz parçacıkları penceresini özetleme kutusunda onay kutusunu seçin ve Tamam'ıtıklatın. Özet sonuçları elde etmek ve bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.
      Not: Elde edilen kutusu parametrelerin açıklaması aşağıdaki gibidir:
      Dilim: Her resmin adını
      Sayısı: Lekeli hücre sayısı
      Toplam alan: Toplam alan sınırlı sayıda hücre
      Ortalama boyutu: Toplam alan sayısı /
      % Alanı: alan/Toplam alan lekeli × %100; Toplam alan otomatik olarak hesaplanır.
   6. Göreli hesaplamak alan Toplam alan değerini kullanarak melanin ile lekeli.
      Göreli melanin lekeli alan (%) = test örnek/ortalama Toplam alan denetimi × 100, Yani, toplam hücresel alan değeri

Sonuçlar

Arbutin, bir anti-melanogenic temsilcisi sonuçları hipopigmentasyon etkinliği için melanosit aşağıda gösterilmektedir B16F10 bileşik. Şekil 1A o arbutin, önemli ölçüde araç tedavi denetimi ile karşılaştırıldığında hücresel Tirozinaz etkinlik bastırılmış gösterir. Benzer şekilde, hücre arbutin ile uyarılan melanin içerik önemli ölçüde denetimleri (şekil 1B) ile karşılaştırıldığında dü...

Tartışmalar

Biz kültürlü melanosit kullanarak test bileşiklerin hipopigmentasyon etkinliğini değerlendirmek için protokol sundu. Temsil edici sonuçlar arbutin, Tirozinaz etkinlik ve hücresel melanin içerik inhibe bir Tirozinaz inhibitörü hipopigmentasyon etkisini gösterdi. Bu yöntemler anti-melanogenic aktivite araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu deneyleri kullanarak, biz de başarıyla geçmişte melanogenesis B16F10 hücreleri üzerinde inhibitör etkisi olduğu birçok biyoaktif bileşikler belirl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU