小鼠肺气肿评价持续压力下的肺固定

摘要

这里介绍的是肺固定的有用方案，为肺气肿小鼠模型肺标本的组织学评估创造了一个稳定的条件。该模型的主要优点是，它可以修复许多肺具有相同的恒定压力，没有肺崩溃或通缩。

摘要

肺气肿是慢性阻塞性肺病（COPD）的一个重要特征。涉及肺气肿小鼠模型的研究需要最佳的肺固定，以产生可靠的肺组织学标本。由于肺的结构组成的性质，主要由空气和组织组成，在固定过程中有它崩溃或放气的风险。各种肺固定方法存在，每种方法各有其优缺点。这里介绍的肺固定方法利用恒定压力，利用肺气肿小鼠肺模型为研究提供最佳的组织评估。主要优点是，它可以修复许多肺与相同的条件在同一时间。肺标本是从慢性香烟烟雾暴露小鼠获得的。肺固定使用专用设备进行，能够产生恒定的压力。这种恒定的压力使肺保持在合理的膨胀状态。因此，该方法产生一个肺组织标本，适合评估香烟烟雾引起的轻度肺气肿。

引言

慢性阻塞性肺病是全球主要死亡原因之^一。香烟烟雾是COPD最重要的病因，但发病机制仍不完全确定。COPD表现出两个主要特征，包括气流的逐渐限制和肺的异常炎症反应。肺气肿紊乱经常发生在慢性阻塞性肺病^患者2的肺部。肺气肿的病理发现以肺泡壁破坏^{为特征3。}一些动物物种已经被用来生成在体内的COPD模型（即狗，豚鼠，猴子和啮^{齿动物）4。}然而，鼠标已成为在COPD模型构造中最常用的。这有许多优点，包括成本低，具有转基因能力，广泛的基因组信息可用性，抗体的可用性，以及使用各种小鼠菌株^{的能力5。}目前，没有小鼠模型可以模仿人类COPD的全部特征;因此，个别研究人员必须选择哪种模型最适合特定的慢性阻塞性肺病^研究6。肺气小鼠模型是目前可用的众多 COPD 小鼠模型之一。其他模型包括加重小鼠模型、系统性共病模型和COPD易感性^模型7。

肺气鼠模型可以由几种外源性物质产生，包括化学剂和香烟烟雾^暴露4。化学品接触（例如，对乳化酶）会产生一种严重的肺气肿，而香烟烟雾则导致轻度肺气^肿8，9。香烟烟雾被认为是COPD发病的主要原因;因此，选择香烟烟雾作为创建COPD小鼠模型的手段^{是合理的10。}许多研究都利用香烟烟雾在老鼠体内制造肺气肿。例如，Nikula等人成功地从B6C3F1雌性小鼠身上培育出一种肺气肿小鼠模型，将它们暴露在香烟烟雾中7个月^{或13个月。}我们还建立了肺气肿小鼠模型，通过衰老标记蛋白/SMP-30 KO^小鼠12。执行肺固定方法至关重要，该方法可以通过香烟烟雾暴露来正确可视化这种温和的肺气肿模型。

各种肺固定方法已经^建立13。然而，没有金标准肺组织固定方法用于评估肺气^肿14。该实验室的几项研究表明，这里介绍的固定系统是有用的，为评估肺气肿12，15，16，17，18创建一个稳定的条件。目前系统的主要优点是，它可以修复许多肺与相同的条件在同一时间没有肺崩溃或通缩。目前的肺固定系统使用一些特殊设备，允许肺标本在给定时期内以适当的恒定压力膨胀。这种特殊设备由三个部分组成，包括下部容器、上部容器和泵。肺试样被放置在与加压固定剂相连的下容器中，导致上容器和下容器之间的代理水平存在25 cmH₂O的压力^差异19。

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研究方案

以下方法已获得君登多大学医学院动物护理和使用委员会的批准。2006年6月1日，日本科学委员会遵循了《动物实验正确进行指南》。这种方法有三个主要步骤:1）小鼠解剖，2）肺外泄，和3）在专用设备辅助的肺组织的固定。通常，肺标本在48小时后被加工嵌入12，15，16，17，18。

1. 鼠标解剖

1. 测量小鼠的体量，然后确定要施用的五巴比妥的量。
2. 以70mg/kg的体重剂量注射五巴比妥内腹，并通过对脚趾捏没有反应来确认麻醉。
3. 以 45° 角注射针头，直到其穿透皮肤和肌肉。绘制柱塞并确认空气真空，然后注射五巴比妥。
4. 通过没有反射运动确认麻醉。
   注意:建议使用麻醉小鼠而不是安乐死小鼠进行完全肺外泄。
5. 在中线切割小鼠皮肤和腹部肌肉，瞄准头部区域。
6. 横向切割，以提供更宽的工作空间。

2. 肺外泄

1. 露出隔膜层，用钳子刺穿它。
2. 打开胸腔空间，切开胸腔，让肺部和心脏清晰可见。
3. 在左心房和右心室切心脏。
4. 将导管（24 G）插入右心室区域，并将其直接插入头室区域，直到到达肺动脉，如图1所示。
5. 打开泵，让 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 循环（约 200 mL/h），直到所有肺组织变为白色。

3. 肺组织固定

1. 取出气管、肺和心脏。
2. 通过切割周围的结缔组织释放所有三个器官。
3. 用缝合线绑住右主支气管，并切下右肺的所有叶。
4. （可选）:右肺的叶由四部分组成。从右侧主支气管中切割这些部分，并将零件分割为冷冻组织样本进行加工。
5. 将心脏和左肺叶插入固定剂中，位于 10 mL 注射器内。
   注意:固定剂是危险的。穿戴适当的防护设备（如长橡胶手套），并在通风良好的房间工作。
6. 使用10 mL注射器制造真空条件，使肺部膨胀，如图2所示。
7. 将套管 （20 G） 插入气管并打结。
8. 使用1 mL注射器用固定剂充气肺部以检查有无泄漏。
9. 转移到肺固定压力设备，如图3所示。
10. 固定期后，取出用结绑气管的肺样本。

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结果

如前所述，产生扩展恒定压力的专用设备可分为三部分（图3A）。下部是插入肺样本的点（图4A）。肺通过导管（20 G）连接到形式素流动的尖端使用三向停止公鸡（图4B）。压力由下部和上容器之间的固定剂的不同表面水平产生（图5）。压力差为25 cmH₂O;但是，使...

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讨论

这里介绍的啮齿动物肺的固定程序并不新颖;然而，该系统有几个优点。首先，它可以修复许多肺（最多20个）与相同的条件在同一时间。毒理学病理学学会指出，重力灌输的压力从22-25 cmH₂O²²不等。值得注意的是，一些研究在25 cmH₂O^{13，19，23，24，}

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin (formalin neutral buffer solution)	Wako	060-01667
Bent forceps	Hammacher	HSC187-11
Cannula, size 20G	Terumo	SR-FS2032
Cannula, size 22G	Terumo	SR-OT2225C	Cannula to exsanguinate lung
Forceps	Hammacher	HSC184-10
Kimtowel	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	61000
Kimwipe	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	62011
Lower container (acrylic glass material)	Tokyo Science	Custom-made	Pressure equipment component
Roller pump	Nissin Scientific Corp	NRP-75	Pump machine to exsanguinate lung
Roller pump RP-2000	Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)	160200	Pressure equipment pump
Silicone tube Ø 9 mm	Sansyo	94-0479	Pressure equipment component
Somnopentyl (64.8 mg/mL)	Kyoritsu Seiyaku	SOM02-YA1312	Pentobarbital Sodium
Surgical scissor	Hammacher	HSB014-11
Suture thread, size 0	Nescosuture	GA01SW
Syringe, 1 mL	Terumo	SS-01T
Syringe, 1 ml with needle	Terumo	SS-01T2613S
Syringe, 10 mL	Terumo	SS-10ESZ
Three-way stopcock	Terumo	TS-TR1K01
Upper container (acrylic glass material)	Tokyo Science	Custom-made	Pressure equipment component