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要約

ここに提示される肺固定のための有用なプロトコルは、肺気腫のマウスモデルからの肺標本の組織学的評価のための安定した状態を作成する。このモデルの主な利点は肺の崩壊またはデフレなしで同じ一定した圧力の多くの肺を固定できることである。

要約

気腫は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)の重要な特徴である。気腫マウスモデルを含む研究は、肺の信頼性の高い組織学的標本を生成するために最適な肺固定を必要とします。空気と組織の大部分からなる肺の構造組成物の性質上、固定プロセス中に崩壊または脱脂するリスクがあります。様々な肺固定法が存在し、それぞれが独自の長所と短所を有する。ここで提示される肺固定法は、一定の圧力を利用して、気腫マウス肺モデルを用いた研究に最適な組織評価を可能にする。主な利点は、一度に同じ条件で多くの肺を修正できることです。肺標本は、慢性タバコの煙にさらされたマウスから得られる。肺の固定は一定した圧力の生産を可能にする専門装置を使用して行われる。この一定の圧力は、合理的に膨張した状態で肺を維持します。したがって、この方法は、タバコの煙誘発性軽度の気腫を評価するのに適した肺の組織学的標本を生成する。

概要

COPDは、世界的に有数の死因の1つです。タバコの煙はCOPDの最も重要な原因であるが、病因のメカニズムは不完全に定義されたままである。COPDは、気流の進行性の制限および肺の異常な炎症反応を含む2つの主要な特徴を示す。気腫性障害はCOPD患者2の肺で頻繁に起こる。気腫の病理学的所見は、肺胞壁破壊3によって特徴付けされる。いくつかの動物種は、生体内でCOPDモデルを生成するために使用されている(すなわち、イヌ、モルモット、サル、およびげっ歯類)4.しかし、マウスはCOPDモデルの構築で最も一般的に使用されるようになった。これは、その低コスト、遺伝的に改変される能力、広範なゲノム情報の可用性、抗体の可用性、および様々なマウス株を使用する能力を含む多くの利点を有する5。現在、人間のCOPDの完全な機能を模倣できるマウスモデルはありません。したがって、個々の研究者は、特定のCOPD研究6に最も適したモデルを選択する必要があります。気腫マウスモデルは、現在利用可能な多くのCOPDマウスモデルの一つです。その他のモデルには、悪化マウス モデル、全身共罹性モデル、および COPD 感受性モデル7が含まれます。

気腫マウスモデルは、化学薬品およびタバコの煙暴露4を含むいくつかのタイプの外因性薬剤によって生成されうる。化学暴露(例えば、エラスターゼに)は重度の肺気腫を生み出し、タバコの煙は軽度の気腫8、9をもたらす。タバコの煙はCOPDの病因の主な原因であると考えられています。したがって、COPDマウスモデルを作成する手段としてのタバコの煙の選択は合理的です10.多くの研究は、マウスの気腫を作成するためにタバコの煙を使用しています。例えば、Nikulaらは、7または13ヶ月間11分間タバコの煙にさらすことによって、B6C3F1雌マウスから気腫マウスモデルを作成することに成功した。我々はまた、老化マーカータンパク質/SMP-30 KOマウス12を介して気腫マウスモデルを確立した。タバコの煙暴露によってこの軽度の気腫モデルを適切に視覚化できる肺固定法を実行することが重要です。

肺固定のための様々な方法が確立されている13.しかしながら、肺気腫14を評価するための肺組織固定のゴールドスタンダード方法はない。この研究室からのいくつかの研究は、ここで提示された固定システムは、気腫12、15、16、17、18を評価するための安定した状態を作成することによって有用であることを示しています。現在のシステムの主な利点は、肺の崩壊やデフレなしに一度に同じ状態で多くの肺を修正できることです。現在の肺固定システムは所定の期間のための適切な一定の圧力で肺の標本を膨らませることを可能にするいくつかの特別な装置を使用する。この特別な装置は、下部容器、上部容器、ポンプを含む3つの部分で構成されています。肺試料は、加圧固定剤に接続された下部容器に配置され、その結果、上下容器19との間の薬剤のレベルに25cmH2O圧力差をもたらす。

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プロトコル

順天堂大学医学部動物管理利用委員会により、以下の方法が承認されています。2006年6月1日、日本学術振興会「動物実験の適正行動指針」に従った。この方法には、1)マウス解剖、2)肺駆除、3)専門装置による肺組織の固定の3つの主要なステップがあります。典型的には、肺検体は、固定12、15、16、17、18の48時間後に埋め込みに処理される。

1. マウス解剖

  1. マウスの体重を測定し、投与するペントバルビタールの量を決定する。
  2. 体重70mg/kgの投与量でペントバルビタールを経体内に注入し、つま先ピンチに対する反応がない場合に麻酔を確認する。
  3. 皮膚と筋肉に浸透するまで、針を45°の角度で注入します。プランジャーを引き、空気真空を確認し、ペントバルビタールを注入します。
  4. 反射運動がない場合は麻酔を確認する。
    注:完全な肺排泄には、安楽死マウスとは対照的に麻酔マウスを使用することをお勧めします。
  5. マウスの皮膚と腹筋を中間線で切り、頭筋領域を目指します。
  6. より広い作業スペースを提供するために横に切る。

2. 肺の排泄

  1. ダイヤフラム層を露出させ、鉗子で穿刺します。
  2. 胸部のスペースを開き、胸骨の領域を切り取り、肺と心臓をはっきりと見ることができるようにする。
  3. 心臓を左心房と右心室で切る。
  4. 図 1に示すように、カニューレ (24 G) を右心室領域に挿入し、肺動脈に到達するまで頭蓋領域に向ける。
  5. ポンプをオンにし、すべての肺組織が白い色に変わるまで、1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)が循環(約200 mL/h)を可能にします。

3. 肺組織の固定

  1. 気管、肺、心臓を取り除きます。
  2. 周囲の結合組織を切断することにより、3つの臓器をすべて解放します。
  3. 右の主気管支を縫合糸で結び、右肺のすべての葉を切ります。
  4. (オプション):右肺の葉は4つの部分から成っている。右の主気管支からこれらの部品をカットし、凍結組織サンプルとして処理するための部品を分割します。
  5. 10 mL注射器の中に位置する固定剤に左肺の心臓と葉を挿入します。
    注意: 固定剤は危険です。適切な保護具(例えば、長いゴム手袋)を着用し、換気の良い部屋で作業してください。
  6. 図 2 に示すように、10 mL 注射器を使用して肺を膨らませる真空状態を作成します。
  7. 気管にカニューレ(20G)を挿入し、結び目を結ぶ。
  8. 1 mLの注射器を使用して漏出を確認するために固定剤で肺を膨らませる。
  9. 図3に示すように、肺固定圧装置への転送。
  10. 期間を固定した後、結び目で気管を結ぶ肺サンプルを取り除きます。

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結果

前述したように、拡張一定圧力を発生する特殊装置は、3つの部分に分けることができる(図3A)。下部は肺試料を挿入する点です(図4A)。肺はカニューレ(20G)を介して3ウェイストップコックを使用してホルマリン流の先端に接続される(図4B)。圧力は、下部および上部の容器間の固定剤の異な...

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ディスカッション

ここで提示されたげっ歯類の肺の固定手順は新しいものではありません。ただし、このシステムにはいくつかの利点があります。まず、同じ状態で一度に多くの肺(最大20)を修正することができます。毒性病理学会は、重力の吸入圧力が22〜25 cmH2O22から変化すると述べています。特に、いくつかの研究は、25 cmH2O13、19

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開示事項

著者は、宣言する競合する利益を持っていません。

謝辞

本研究は、JSPS KAKENHI助成金番号26461199(佐藤哲三)と順天堂大学大学院医学系研究科環境・ジェンダー特異医学研究所、助成番号E2920(佐藤哲三)の一部で支援されました。資金提供者は、現在の方法の設計と原稿の書き込みには何の役割も持っていなかった。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalin (formalin neutral buffer solution)Wako060-01667
Bent forcepsHammacherHSC187-11
Cannula, size 20GTerumoSR-FS2032
Cannula, size 22GTerumoSR-OT2225CCannula to exsanguinate lung
ForcepsHammacherHSC184-10
KimtowelNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)61000
KimwipeNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)62011
Lower container (acrylic glass material)Tokyo ScienceCustom-madePressure equipment component
Roller pumpNissin Scientific CorpNRP-75Pump machine to exsanguinate lung
Roller pump RP-2000Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)160200Pressure equipment pump
Silicone tube Ø 9 mmSansyo94-0479Pressure equipment component
Somnopentyl (64.8 mg/mL)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312Pentobarbital Sodium
Surgical scissorHammacherHSB014-11
Suture thread, size 0NescosutureGA01SW
Syringe, 1 mLTerumoSS-01T
Syringe, 1 ml with needleTerumoSS-01T2613S
Syringe, 10 mLTerumoSS-10ESZ
Three-way stopcockTerumoTS-TR1K01
Upper container (acrylic glass material)Tokyo ScienceCustom-madePressure equipment component

参考文献

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
  3. Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
  4. Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
  5. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
  6. Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
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