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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier wird ein nützliches Protokoll zur Lungenfixierung vorgestellt, das einen stabilen Zustand für die histologische Auswertung von Lungenproben aus einem Mausmodell von Emphysem schafft. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass es viele Lungen mit dem gleichen konstanten Druck ohne Lungenkollaps oder Deflation reparieren kann.

Zusammenfassung

Emphysem ist ein signifikantes Merkmal der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD). Studien mit einem emphysematous Mausmodell erfordern eine optimale Lungenfixierung, um zuverlässige histologische Proben der Lunge zu produzieren. Aufgrund der Art der strukturellen Zusammensetzung der Lunge, die größtenteils aus Luft und Gewebe besteht, besteht die Gefahr, dass sie während des Fixierungsprozesses zusammenbricht oder entleert wird. Es gibt verschiedene Lungenfixierungsmethoden, von denen jede ihre eigenen Vor- und Nachteile hat. Die hier vorgestellte Lungenfixierungsmethode nutzt konstanten Druck, um eine optimale Gewebeauswertung für Studien mit einem emphysematous Maus-Lungenmodell zu ermöglichen. Der Hauptvorteil ist, dass es viele Lungen mit dem gleichen Zustand auf einmal beheben kann. Lungenproben werden von chronischen Zigarettenrauch exponierten Mäusen gewonnen. Die Lungenfixierung erfolgt mit speziellen Geräten, die die Produktion von konstantem Druck ermöglichen. Dieser konstante Druck hält die Lunge in einem einigermaßen überhöhten Zustand. So erzeugt diese Methode eine histologische Probe der Lunge, die geeignet ist, Zigarettenrauch-induziertes mildes Emphysem zu bewerten.

Einleitung

COPD ist eine der weltweit führenden Todesursachen1. Zigarettenrauch ist die wichtigste Ursache für COPD, aber die Mechanismen der Pathogenese bleiben unvollständig definiert. COPD zeigt zwei Hauptmerkmale, darunter eine fortschreitende Begrenzung des Luftstroms und eine abnormale Entzündungsreaktion der Lunge. Emphysematous Störung tritt häufig in der Lunge von COPD-Patienten2. Die pathologischen Befunde des Emphysems zeichnen sich durch alveolare Wandzerstörung3aus. Mehrere Tierarten wurden verwendet, um COPD-Modelle in vivo zu erzeugen (d.h. Hunde, Meerschweinchen, Affen und Nagetiere)4. Allerdings ist die Maus die am häufigsten verwendete bei der Konstruktion von COPD-Modellen geworden. Dies hat viele Vorteile, einschließlich seiner niedrigen Kosten, die Fähigkeit, genetisch verändert zu werden, umfangreiche genomische Informationsverfügbarkeit, Verfügbarkeit von Antikörpern und die Fähigkeit, eine Vielzahl von Mausstämmen zu verwenden5. Derzeit gibt es kein Mausmodell, das die vollen Funktionen der menschlichen COPD imitieren kann; Daher müssen die einzelnen Forscher wählen, welches Modell für die spezifische COPD-Forschung am besten geeignet ist6. Das emphysematous Mausmodell ist eines von vielen COPD-Mausmodellen, die derzeit verfügbar sind. Weitere Modelle sind das Exazerbationsmausmodell, das Modell der systemischen Komorbidität und das COPD-Anfälligkeitsmodell7.

Das emphysematous Mausmodell kann durch verschiedene Arten von exogenen Wirkstoffen erzeugt werden, einschließlich chemischer Mittel und Zigarettenrauchexposition4. Chemische Exposition (z.B. Gegen Elastase) erzeugt eine schwere Art von Emphysem, während Zigarettenrauch zu einem leichten Emphysem8,9führt. Zigarettenrauch wird angenommen, dass die Hauptursache für die Pathogenese von COPD sein; daher ist die Wahl des Zigarettenrauchs als Mittel zur Erstellung eines COPD-Mausmodells sinnvoll10. Viele Studien haben Zigarettenrauch verwendet, um Emphysem in der Maus zu schaffen. Zum Beispiel, Nikula et al. erfolgreich erstellt ein emphysematous Maus-Modell von B6C3F1 weibliche Mäuse durch die Exposition sie Zigarettenrauch für 7 oder 13 Monate11. Wir haben auch ein emphysematous Mausmodell über Seneszenzmarker Protein/SMP-30 KO Mäuse12etabliert. Es ist wichtig, eine Lungenfixierungsmethode durchzuführen, die dieses milde Emphysem-Modell durch Zigarettenrauchexposition richtig visualisieren kann.

Verschiedene Methoden zur Lungenfixierung wurden etabliert13. Es gibt jedoch keine Goldstandardmethode der Lungengewebefixierung zur Beurteilung des Emphysems14. Mehrere Studien aus diesem Labor haben gezeigt, dass das hier vorgestellte Fixierungssystem nützlich ist, indem es einen stabilen Zustand für die Bewertung von Emphysem12,15,16,17,18erstellt. Der Hauptvorteil des aktuellen Systems ist, dass es viele Lungen mit dem gleichen Zustand auf einmal ohne Lungenkollaps oder Deflation reparieren kann. Das aktuelle Lungenfixierungssystem verwendet spezielle Geräte, mit denen Lungenproben für einen bestimmten Zeitraum bei einem angemessenen konstanten Druck aufgeblasen werden können. Diese Spezialausrüstung besteht aus drei Teilen, darunter ein unterer Behälter, ein oberer Behälter und eine Pumpe. Lungenproben werden in den unteren Behälter gelegt, der mit Druckbefestigungsmitteln verbunden ist, was zu einem Druckunterschied von 25cmH2O im Füllstand zwischen den oberen und unteren Behältern19führt.

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Protokoll

Die folgenden Methoden wurden von den Animal Care and Use Committees der Juntendo University School of Medicine genehmigt. Die Leitlinien für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen, Science Council of Japan, 1. Juni 2006 wurden befolgt. Es gibt drei Hauptschritte bei dieser Methode: 1) Maussektion, 2) Lungenexsanguination und 3) Fixierung von Lungengewebe, unterstützt durch spezielle Geräte. Typischerweise werden Lungenproben nach 48 h Fixierung12,15,16,17,18zur Einbettung verarbeitet.

1. Maus-Sektion

  1. Messen Sie das Körpergewicht der Maus, und bestimmen Sie dann die Menge an Pentobarbital, die verabreicht werden soll.
  2. Injizieren Pentobarbital intraperitoneally in einer Dosierung von 70 mg/kg Körpergewicht und bestätigen Anästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf Zehenkneifung.
  3. Injizieren Sie die Nadel in einem 45°-Winkel, bis sie die Haut und den Muskel durchdringt. Zeichnen Sie den Kolben und bestätigen Sie ein Luftvakuum, dann injizieren Sie das Pentobarbital.
  4. Bestätigen Sie die Anästhesie durch das Fehlen von Reflexbewegung.
    HINWEIS: Die Verwendung von anästhesierter Maus im Gegensatz zu einer eingeschläferten Maus wird für die vollständige Lungenexsanguination empfohlen.
  5. Schneiden Sie die Maushaut und den Bauchmuskel an der medialen Linie, mit dem Ziel für den Cephalic Bereich.
  6. Schneiden Sie seitlich, um einen größeren Arbeitsbereich zu schaffen.

2. Lungenexsanguination

  1. Setzen Sie die Membranschicht aus und punktieren Sie sie mit Zangen.
  2. Öffnen Sie den Brustraum und schneiden Sie den Brustbereich, so dass Lunge und Herz deutlich zu sehen sind.
  3. Schneiden Sie das Herz in linken Vorhof und rechten Ventrikel.
  4. Setzen Sie eine Kanüle (24 G) in den rechten Ventrikelbereich ein und leiten Sie sie in den Cephala-Bereich, bis sie die Lungenarterie erreicht, wie in Abbildung 1dargestellt.
  5. Schalten Sie die Pumpe ein und lassen Sie die 1x phosphatgepufferte Saline (PBS) zirkulieren (ca. 200 ml/h), bis sich das gesamte Lungengewebe in eine weiße Farbe ändert.

3. Fixierung des Lungengewebes

  1. Entfernen Sie die Luftröhre, Lunge und Herz.
  2. Befreien Sie alle drei Organe, indem Sie die umgebenden Bindegewebe schneiden.
  3. Binden Sie den rechten Hauptbronchus mit einem Nahtfaden und schneiden Sie alle Lappen der rechten Lunge.
  4. (Optional): Die Lappen der rechten Lunge bestehen aus vier Teilen. Schneiden Sie diese Teile aus dem rechten Hauptbronchus und teilen Sie die Teile für die Verarbeitung als gefrorene Gewebeproben.
  5. Setzen Sie das Herz und die Lappen der linken Lunge in Fixiermittel ein, die sich in einer 10 ml Spritze befinden.
    VORSICHT: Befestigungsmittel sind gefährlich. Tragen Sie die richtige Schutzausrüstung (z. B. lange Gummihandschuhe) und arbeiten Sie in einem gut belüfteten Raum.
  6. Erstellen Sie einen Vakuumzustand mit einer 10 ml Spritze, um die Lunge aufzublasen, wie in Abbildung 2dargestellt.
  7. Legen Sie eine Kanüle (20 G) in die Luftröhre und binden Sie einen Knoten.
  8. Aufblasen Sie die Lunge mit Fixiermitteln, um mit einer 1 ml Spritze nach Leckagen zu suchen.
  9. Übertragung auf Lungenfixierungsdruckgeräte, wie in Abbildung 3dargestellt.
  10. Nach der Fixierung der Perioden entfernen Sie die Lungenprobe, die die Luftröhre mit einem Knoten bindet.

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Ergebnisse

Wie bereits beschrieben, kann die Spezialausrüstung, die einen erweiterten konstanten Druck erzeugt, in drei Teile unterteilt werden (Abbildung 3A). Der untere Teil ist der Punkt, an dem die Lungenprobe eingesetzt werden soll (Abbildung 4A). Die Lunge wird über eine Kanüle (20 G) mit der Spitze des Formalinflusses über einen Drei-Wege-Stopphahn verbunden (Abbildung 4B). Der Druc...

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Diskussion

Das hier vorgestellte Fixierungsverfahren für Nagetiere ist nicht neu; Dieses System hat jedoch mehrere Vorteile. Erstens kann es viele Lungen (maximal 20) mit dem gleichen Zustand gleichzeitig fixieren. Die Gesellschaft für Toxikologische Pathologie stellt fest, dass der Druck für die Schwerkraftinstillation von 22–25 cmH2O22variiert. Insbesondere haben mehrere Studien Lungenfixierung bei einem Druck von 25 cmH2O13,19...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) und dem Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato) unterstützt. Der Geldgeber hatte keine Rolle bei der Gestaltung der aktuellen Methoden und beim Schreiben des Manuskripts.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalin (formalin neutral buffer solution)Wako060-01667
Bent forcepsHammacherHSC187-11
Cannula, size 20GTerumoSR-FS2032
Cannula, size 22GTerumoSR-OT2225CCannula to exsanguinate lung
ForcepsHammacherHSC184-10
KimtowelNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)61000
KimwipeNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)62011
Lower container (acrylic glass material)Tokyo ScienceCustom-madePressure equipment component
Roller pumpNissin Scientific CorpNRP-75Pump machine to exsanguinate lung
Roller pump RP-2000Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)160200Pressure equipment pump
Silicone tube Ø 9 mmSansyo94-0479Pressure equipment component
Somnopentyl (64.8 mg/mL)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312Pentobarbital Sodium
Surgical scissorHammacherHSB014-11
Suture thread, size 0NescosutureGA01SW
Syringe, 1 mLTerumoSS-01T
Syringe, 1 ml with needleTerumoSS-01T2613S
Syringe, 10 mLTerumoSS-10ESZ
Three-way stopcockTerumoTS-TR1K01
Upper container (acrylic glass material)Tokyo ScienceCustom-madePressure equipment component

Referenzen

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  2. Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
  3. Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
  4. Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
  5. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
  6. Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
  7. Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
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