JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada sunulan amfizem bir fare modeli akciğer örneklerinin histolojik değerlendirilmesi için istikrarlı bir durum oluşturur akciğer fiksasyonu için yararlı bir protokoldür. Bu modelin ana avantajı akciğer çökmesi veya deflasyon olmadan aynı sabit basınç ile birçok akciğer düzeltebilirsiniz.

Özet

Amfizem kronik obstrüktif akciğer hastalığının (KOAH) önemli bir özelliğidir. Amfizematöz fare modelini içeren çalışmalar, akciğerin güvenilir histolojik örneklerini üretmek için optimum akciğer fiksasyonu gerektirir. Akciğerin büyük ölçüde hava ve dokudan oluşan yapısal bileşiminin doğası nedeniyle, fiksasyon işlemi sırasında çökme veya sönme riski vardır. Her biri kendi avantajları ve dezavantajları olan çeşitli akciğer fiksasyon yöntemleri vardır. Burada sunulan akciğer fiksasyon yöntemi, amfizematöz fare akciğer modeli kullanılarak yapılan çalışmalarda optimal doku değerlendirmesini sağlamak için sabit basınç kullanır. Ana avantajı aynı anda aynı durumda birçok akciğer leri düzeltebilirsiniz. Akciğer örnekleri kronik sigara dumana maruz fareler elde edilir. Akciğer fiksasyonu, sabit basınç üretimine olanak sağlayan özel ekipmanlar kullanılarak gerçekleştirilir. Bu sabit basınç makul şişirilmiş durumda akciğer korur. Böylece, bu yöntem sigara dumanı kaynaklı hafif amfizem değerlendirmek için uygun akciğer histolojik bir örnek oluşturur.

Giriş

KOAH ölüm dünya çapında önde gelen nedenlerinden biridir1. Sigara dumanı KOAH'ın en önemli nedenidir, ancak patogenez mekanizmaları tam olarak tanımlanmış değildir. KOAH, hava akımının ilerleyici sınırlandırılması ve akciğerin anormal inflamatuar yanıtı da dahil olmak üzere iki ana özelliği göstermektedir. Amfizematöz bozukluk KOAH hastalarının akciğerlerinde sıklıkla görülür2. Amfizemin patolojik bulguları alveoler duvar yıkımı ile karakterizedir3. Çeşitli hayvan türleri vivo (yani, köpekler, kobay, maymun ve kemirgenler)4KOAH modelleri oluşturmak için kullanılmıştır. Ancak, fare koah modellerinin yapımında en sık kullanılan hale gelmiştir. Bu düşük maliyet de dahil olmak üzere birçok avantajı vardır, genetik olarak değiştirilmiş olma yeteneği, geniş genomik bilgi kullanılabilirliği, antikorların kullanılabilirliği, ve fare suşları çeşitli kullanma yeteneği5. Şu anda, insan KOAH tam özelliklerini taklit edebilir hiçbir fare modeli yoktur; böylece, bireysel araştırmacılar hangi modelin spesifik KOAH araştırma6için en uygun olduğunu seçmelisiniz. Amfizematöz fare modeli şu anda mevcut olan birçok KOAH fare modellerinden biridir. Ek modeller alevlenme fare modeli, sistemik ko-morbidite modeli ve KOAH duyarlılık modeli7içerir.

Amfizematöz fare modeli kimyasal ajanlar ve sigara dumanına maruz kalma dahil olmak üzere eksojen ajanlar çeşitli tarafından oluşturulabilir4. Kimyasal maruziyet (örneğin, elastaz) amfizem ciddi bir tür üretir, sigara dumanı hafif amfizem8sonuçları ise,9. Sigara dumanının KOAH patogenezinin ana nedeni olduğuna inanılmaktadır; bu nedenle, bir KOAH fare modeli oluşturmak için bir araç olarak sigara dumanı seçimi makul10. Birçok çalışma fare amfizem oluşturmak için sigara dumanı kullandık. Örneğin, Nikula ve ark. başarıyla 7 veya 13 ay11için sigara dumanı onları maruz bırakarak B6C3F1 dişi fareler bir amfizemtous fare modeli oluşturdu. Biz de senescence marker protein / SMP-30 KO fareler12ile bir amfizematöz fare modeli kurduk. Bu düzgün sigara dumanı maruz kalma ile bu hafif amfizem modeli görselleştirebilirsiniz bir akciğer fiksasyon yöntemi gerçekleştirmek için çok önemlidir.

Akciğer fiksasyonu için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur13. Ancak, amfizem14değerlendirmek için akciğer dokusu fiksasyonu hiçbir altın standart yöntemi yoktur. Bu laboratuvardan çeşitli çalışmalar burada sunulan fiksasyon sistemi amfizem 12 ,15,16,17,18değerlendirmek için istikrarlı bir durum oluşturarak yararlı olduğunu göstermiştir. Mevcut sistemin en büyük avantajı akciğer çökmesi veya deflasyon olmadan aynı anda aynı durumda birçok akciğer düzeltebilirsiniz. Mevcut akciğer fiksasyon sistemi, akciğer örneklerinin belirli bir süre için uygun bir sabit basınçta şişirilmesine olanak tanıyan bazı özel ekipmanlar kullanır. Bu özel ekipman, bir alt konteyner, üst konteyner ve pompa da dahil olmak üzere üç bölümden oluşur. Akciğer numuneleri basınçlı sabitleme ajanlarına bağlı alt konteyneriçine yerleştirilir ve üst ve alt kaplar arasındaki ajan düzeyinde 25 cmH2O basınç farkı19'dur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Aşağıdaki yöntemler Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Hayvan Deneyleri Uygun Davranış Kuralları, Japonya Bilim Konseyi, Haziran 1, 2006 takip edildi. Bu yöntemde üç ana adım vardır: 1) fare diseksiyonu, 2) akciğer eksanguiasyonu ve 3) özel ekipman tarafından desteklenen akciğer dokularının fiksasyonu. Tipik olarak, akciğer örnekleri fiksasyon 12,15,16,17,1848 h sonra gömme için işlenir.

1. Fare diseksiyonu

  1. Farenin vücut ağırlığını ölçün, sonra uygulanacak pentobarbital miktarını belirleyin.
  2. Pentobarbital intraperitoneally 70 mg/kg vücut ağırlığı dozajında enjekte edin ve ayak ucutu reaksiyonu yokluğunda anesteziyi onaylayın.
  3. İğneyi deriye ve kasa nüfuz edene kadar 45° açıyla enjekte edin. Piston çizin ve bir hava vakum onaylamak, sonra pentobarbital enjekte.
  4. Refleks hareket yokluğunda anestezi onaylayın.
    NOT: Tam akciğer eksanması için ötenazili fareyerine anestezili fare kullanılması önerilir.
  5. Sefalik alanı hedefleyen, medial çizgide fare deri ve karın kası kesin.
  6. Daha geniş bir çalışma alanı sağlamak için yanal olarak kesin.

2. Akciğer eksanguination

  1. Diyafram tabakasını ortaya çıkarve forceps ile delin.
  2. Göğüs kafesini açın ve göğüs kafesini kesip akciğerlerin ve kalbin net bir şekilde görülmesini sağlar.
  3. Kalbi sol atriyumda ve sağ ventrikülde kesin.
  4. Sağ ventrikül bölgesine bir kanül (24 G) yerleştirin ve Şekil 1'degösterildiği gibi pulmoner artere ulaşana kadar sefalik bölgeye yönlendirin.
  5. Pompayı açın ve 1x fosfat tamponlu salinin (PBS) tüm akciğer dokusu beyaz renge dönüşene kadar (yaklaşık 200 mL/s) dolaşmasına izin verin.

3. Akciğer dokusunun fiksasyonu

  1. Nefes borusunu, akciğerleri ve kalbi çıkarın.
  2. Çevredeki bağ dokularını keserek üç organı da boşaltın.
  3. Bir dikiş iplik ile sağ ana bronş kravat ve sağ akciğer tüm lobları kesti.
  4. (İsteğe bağlı): sağ akciğerin lobları dört bölümden oluşur. Sağ ana bronş bu parçaları kesin ve dondurulmuş doku örnekleri olarak işlenmesi için parçaları bölün.
  5. Sol akciğerin kalbini ve loblarını 10 mL şırınganın içinde bulunan sabitleme ajanlarına yerleştirin.
    DİkKAT: Sabitleme ajanları tehlikelidir. Uygun koruyucu ekipman (örneğin, uzun lastik eldivenler) giyin ve iyi havalandırılan bir odada çalışın.
  6. Şekil 2'degösterildiği gibi, akciğeri şişirmek için 10 mL şırınga kullanarak bir vakum durumu oluşturun.
  7. Nefes borusuna bir kanül (20 G) takın ve düğüm at.
  8. 1 mL şırınga kullanarak sızıntıları kontrol etmek için sabitleme ajanları ile akciğer şişirin.
  9. Şekil 3'tegösterildiği gibi akciğer fiksasyon basınç ekipmanlarına transfer .
  10. Sabitleme periyotları sonra, bir düğüm ile trakea bağlayan akciğer örneği çıkarın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Daha önce açıklandığı gibi, uzatılmış sabit basınç üreten özel ekipman üç bölüme ayrılabilir(Şekil 3A). Alt kısım, akciğer örneğinin yerleştirilme noktasıdır (Şekil 4A). Akciğer bir kanül ile bağlanır (20 G) formalin akışının ucuna üç yönlü stop horoz kullanarak (Şekil 4B). Basınç alt ve üst kaplar arasında sabitleme ajanlarının farklı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada sunulan kemirgen akciğerler için fiksasyon prosedürü yeni değildir; ancak, bu sistemin çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, birçok akciğer (maksimum 20) aynı anda aynı durum ile düzeltebilirsiniz. Toksikolojik Patoloji Derneği yerçekimi aşılama baskısının 22-25 cmH2O22arasında değiştiğini belirtir. Özellikle, çeşitli çalışmalar 25 cmH2O13,19,23,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların beyan etmek için hiçbir rakip çıkarları var.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) ve Çevre ve Cinsiyete Özel Tıp Enstitüsü, Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hibe Numarası E2920 (T. Sato) tarafından desteklenmiştir. Funder'ın mevcut yöntemlerin tasarımında ve el yazmasının yazımında hiçbir rolü yoktu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10% formalin (formalin neutral buffer solution)Wako060-01667
Bent forcepsHammacherHSC187-11
Cannula, size 20GTerumoSR-FS2032
Cannula, size 22GTerumoSR-OT2225CCannula to exsanguinate lung
ForcepsHammacherHSC184-10
KimtowelNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)61000
KimwipeNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)62011
Lower container (acrylic glass material)Tokyo ScienceCustom-madePressure equipment component
Roller pumpNissin Scientific CorpNRP-75Pump machine to exsanguinate lung
Roller pump RP-2000Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)160200Pressure equipment pump
Silicone tube Ø 9 mmSansyo94-0479Pressure equipment component
Somnopentyl (64.8 mg/mL)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312Pentobarbital Sodium
Surgical scissorHammacherHSB014-11
Suture thread, size 0NescosutureGA01SW
Syringe, 1 mLTerumoSS-01T
Syringe, 1 ml with needleTerumoSS-01T2613S
Syringe, 10 mLTerumoSS-10ESZ
Three-way stopcockTerumoTS-TR1K01
Upper container (acrylic glass material)Tokyo ScienceCustom-madePressure equipment component

Referanslar

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
  3. Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
  4. Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
  5. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
  6. Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
  7. Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
  8. Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
  9. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
  10. Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
  11. Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
  12. Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
  13. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
  14. Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  15. Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
  16. Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
  17. Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
  18. Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
  19. Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
  20. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
  21. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
  22. Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
  23. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
  24. Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
  25. Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
  26. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
  27. Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
  28. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
  29. Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236(2015).
  31. Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
  32. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
  33. Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 151kronik obstr ktif akci er hastalamfizemakci er fiksasyonus rekli bas namfizemator fare modelisigara duman

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır