Fixation pulmonaire sous pression constante pour l'évaluation de l'emphysème chez les souris

Résumé

Présenté ici est un protocole utile pour la fixation pulmonaire qui crée une condition stable pour l'évaluation histologique des spécimens de poumon à partir d'un modèle de souris de l'emphysème. Le principal avantage de ce modèle est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation.

Résumé

L'emphysème est une caractéristique importante de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Les études impliquant un modèle de souris emphyséame exigent une fixation optimale des poumons pour produire des spécimens histologiques fiables du poumon. En raison de la nature de la composition structurelle du poumon, qui se compose en grande partie d'air et de tissu, il y a un risque qu'il s'effondre ou se dégonfle pendant le processus de fixation. Diverses méthodes de fixation pulmonaire existent, chacune ayant ses propres avantages et inconvénients. La méthode de fixation pulmonaire présentée ici utilise une pression constante pour permettre une évaluation optimale des tissus pour les études utilisant un modèle de poumon de souris emphysématous. Le principal avantage est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même condition à la fois. Les échantillons pulmonaires sont obtenus à partir de souris chroniques exposées à la fumée de cigarette. La fixation pulmonaire est effectuée à l'aide d'équipements spécialisés qui permettent la production d'une pression constante. Cette pression constante maintient le poumon dans un état raisonnablement gonflé. Ainsi, cette méthode génère un spécimen histologique du poumon qui convient pour évaluer l'emphysème doux induit par la fumée de cigarette.

Introduction

La MPOC est l'une des principales causes mondiales de décès¹. La fumée de cigarette est la cause la plus importante de la MPOC, mais les mécanismes de pathogénie restent incomplètement définis. La MPOC présente deux caractéristiques principales, y compris la limitation progressive du débit d'air et une réponse inflammatoire anormale du poumon. Le désordre emphysème se produit fréquemment dans les poumons des patients de COPD^2. Les résultats pathologiques de l'emphysème sont caractérisés par la destruction de mur alvéolif^3. Plusieurs espèces animales ont été utilisées pour produire des modèles de MPOC in vivo (c.-à-d. chiens, cobayes, singes et rongeurs)⁴. Cependant, la souris est devenue la plus couramment utilisée dans la construction de modèles de MPOC. Cela a de nombreux avantages, y compris son faible coût, la capacité d'être génétiquement modifié, la disponibilité étendue de l'information génomique, la disponibilité des anticorps, et la capacité d'utiliser une variété de souches de souris⁵. Actuellement, il n'y a aucun modèle de souris qui peut imiter toutes les caractéristiques de la MPOC humaine; ainsi, les chercheurs individuels doivent choisir quel modèle convient le mieux à la recherche spécifique sur la MPOC⁶. Le modèle de souris emphyséame est l'un des nombreux modèles de souris COPD qui sont actuellement disponibles. D'autres modèles incluent le modèle de souris d'exacerbation, le modèle systémique de comorbidités, et le modèle de susceptibilité de COPD^7.

Le modèle de souris emphyséame peut être généré par plusieurs types d'agents exogènes, y compris les agents chimiques et l'exposition à la fumée de cigarette⁴. L'exposition chimique (p. ex., à l'élastase) produit un type grave d'emphysème, tandis que la fumée de cigarette entraîne un emphysème léger^8,9. On croit que la fumée de cigarette est la principale cause de la pathogénie de la MPOC; par conséquent, le choix de la fumée de cigarette comme un moyen de créer un modèle de souris COPD est raisonnable¹⁰. De nombreuses études ont utilisé la fumée de cigarette pour créer de l'emphysème chez la souris. Par exemple, Nikula et coll. ont réussi à créer un modèle de souris emphyséamée à partir de souris femelles B6C3F1 en les exposant à la fumée de cigarette pendant 7 ou 13 mois¹¹. Nous avons également établi un modèle de souris emphyséame via la protéine marqueur de sénescence/SMP-30 SOURIS KO¹². Il est crucial d'effectuer une méthode de fixation pulmonaire qui peut correctement visualiser ce modèle d'emphysème doux par l'exposition à la fumée de cigarette.

Diverses méthodes de fixation pulmonaire ont été établies¹³. Cependant, il n'existe pas de méthode standard d'or de fixation des tissus pulmonaires pour évaluer l'emphysème¹⁴. Plusieurs études de ce laboratoire ont montré que le système de fixation présenté ici est utile en créant une condition stable pour l'évaluation de l'emphysème^{12,15,16,17,18}. Le principal avantage du système actuel est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même condition à la fois sans effondrement pulmonaire ou la déflation. Le système actuel de fixation pulmonaire utilise un équipement spécial qui permet de gonfler les échantillons pulmonaires à une pression constante appropriée pendant une période donnée. Cet équipement spécial se compose de trois pièces, y compris un conteneur inférieur, conteneur supérieur, et la pompe. Les échantillons pulmonaires sont placés dans le récipient inférieur qui est relié à des agents de fixation sous pression, ce qui entraîne une différence de pression de 25 cmH₂O dans le niveau d'agents entre les contenants supérieurs et inférieurs¹⁹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Les méthodes suivantes ont été approuvées par les comités de soins et d'utilisation des animaux de l'École de médecine de l'Université de Juntendo. Les Lignes directrices pour une bonne conduite des expériences animales, Conseil des sciences du Japon, 1er juin 2006 ont été suivies. Il y a trois étapes principales dans cette méthode : 1) dissection de souris, 2) exsanguination de poumon, et 3) fixation des tissus de poumon assistés par l'équipement spécialisé. Typiquement, les spécimens de poumon sont traités à l'intégration après 48 h de fixation^{12,15,16,17,18}.

1. Dissection de souris

1. Mesurez le poids corporel de la souris, puis déterminez la quantité de pentobarbital à administrer.
2. Injecter pentobarbital intraperitoneally à une dose de 70 mg/kg de poids corporel et confirmer l'anesthésie par l'absence de réaction à la pincée d'orteil.
3. Injectez l'aiguille à un angle de 45 degrés jusqu'à ce qu'elle pénètre dans la peau et le muscle. Dessiner le piston et confirmer un aspirateur à air, puis injecter le pentobarbital.
4. Confirmer l'anesthésie par l'absence de mouvement réflexe.
   REMARQUE : L'utilisation de la souris anesthésiée par opposition à une souris euthanasiée est recommandée pour l'exsanguination entièrement pulmonaire.
5. Couper la peau de la souris et le muscle abdominal à la ligne médiane, visant la zone céphalique.
6. Couper latéralement pour fournir un espace de travail plus large.

2. Exsanguination pulmonaire

1. Exposer la couche de diaphragme et la perforer avec des forceps.
2. Ouvrez l'espace thoracique et coupez la zone sternale, permettant aux poumons et au cœur d'être vus clairement.
3. Couper le cœur dans l'oreillette gauche et le ventricule droit.
4. Insérer une canule (24 G) dans la zone du ventricule droit et la diriger vers la zone céphalique jusqu'à ce qu'elle atteigne l'artère pulmonaire, comme le montre la figure 1.
5. Allumez la pompe et laissez circuler la saline (PBS) tamponnée par le phosphate 1x (environ 200 ml/h) jusqu'à ce que tous les tissus pulmonaires changent pour devenir de couleur blanche.

3. Fixation du tissu pulmonaire

1. Enlever la trachée, les poumons et le cœur.
2. Libérez les trois organes en coupant les tissus conjonctifs environnants.
3. Attachez la bronche principale droite avec un fil de suture et coupez tous les lobes du poumon droit.
4. (Facultatif) : les lobes du poumon droit se composent de quatre parties. Couper ces parties de la bronche principale droite et diviser les parties pour le traitement en tant qu'échantillons de tissus congelés.
5. Insérez le cœur et les lobes du poumon gauche dans des agents de fixation, situés à l'intérieur d'une seringue de 10 ml.
   CAUTION: Les agents de fixation sont dangereux. Portez un équipement de protection approprié (p. ex., de longs gants en caoutchouc) et travaillez dans une pièce bien aérée.
6. Créer une condition de vide à l'aide d'une seringue de 10 ml pour gonfler le poumon, comme le montre la figure 2.
7. Insérer une canule (20 G) dans la trachée et nouer un noeud.
8. Gonflez le poumon avec des agents de fixation pour vérifier les fuites, à l'aide d'une seringue de 1 ml.
9. Transfert à l'équipement de pression de fixation pulmonaire, comme illustré à la figure 3.
10. Après les périodes de fixation, retirez l'échantillon de poumon liant la trachée avec un noeud.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Tel que décrit précédemment, l'équipement spécialisé, qui génère une pression constante prolongée, peut être divisé en trois parties (figure 3A). La partie inférieure est le point où insérer l'échantillon pulmonaire (Figure 4A). Le poumon est relié par une canule (20 G) à la pointe de l'écoulement formalin à l'aide d'une bite d'arrêt à trois voies (Figure 4B). L...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

La procédure de fixation pour les poumons de rongeurs présentée ici n'est pas nouvelle; cependant, ce système présente plusieurs avantages. Tout d'abord, il peut fixer de nombreux poumons (maximum de 20) avec la même condition à la fois. La Society of Toxicologic Pathology affirme que la pression pour l'instillation de la gravité varie de 22 à 25 cmH₂O²². Notamment, plusieurs études ont effectué la fixation pulmonaire à une pression de 25 cmH₂O^13...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin (formalin neutral buffer solution)	Wako	060-01667
Bent forceps	Hammacher	HSC187-11
Cannula, size 20G	Terumo	SR-FS2032
Cannula, size 22G	Terumo	SR-OT2225C	Cannula to exsanguinate lung
Forceps	Hammacher	HSC184-10
Kimtowel	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	61000
Kimwipe	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	62011
Lower container (acrylic glass material)	Tokyo Science	Custom-made	Pressure equipment component
Roller pump	Nissin Scientific Corp	NRP-75	Pump machine to exsanguinate lung
Roller pump RP-2000	Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)	160200	Pressure equipment pump
Silicone tube Ø 9 mm	Sansyo	94-0479	Pressure equipment component
Somnopentyl (64.8 mg/mL)	Kyoritsu Seiyaku	SOM02-YA1312	Pentobarbital Sodium
Surgical scissor	Hammacher	HSB014-11
Suture thread, size 0	Nescosuture	GA01SW
Syringe, 1 mL	Terumo	SS-01T
Syringe, 1 ml with needle	Terumo	SS-01T2613S
Syringe, 10 mL	Terumo	SS-10ESZ
Three-way stopcock	Terumo	TS-TR1K01
Upper container (acrylic glass material)	Tokyo Science	Custom-made	Pressure equipment component