Fijación pulmonar bajo presión constante para la evaluación del enfisema en ratones

Resumen

Aquí se presenta un protocolo útil para la fijación pulmonar que crea una condición estable para la evaluación histológica de muestras pulmonares a partir de un modelo de ratón de enfisema. La principal ventaja de este modelo es que puede fijar muchos pulmones con la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación.

Resumen

El enfisema es una característica significativa de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Los estudios que involucran un modelo de ratón enfisematoso requieren una fijación pulmonar óptima para producir muestras histológicas confiables del pulmón. Debido a la naturaleza de la composición estructural del pulmón, que consiste en gran parte de aire y tejido, existe el riesgo de que colapse o se desinflen durante el proceso de fijación. Existen varios métodos de fijación pulmonar, cada uno de los cuales tiene sus propias ventajas y desventajas. El método de fijación pulmonar presentado aquí utiliza presión constante para permitir una evaluación óptima del tejido para estudios utilizando un modelo de pulmón de ratón enfisematoso. La principal ventaja es que puede arreglar muchos pulmones con la misma condición a la vez. Los especímenes pulmonares se obtienen de ratones crónicos expuestos al humo del cigarrillo. La fijación pulmonar se realiza utilizando equipos especializados que permiten la producción de presión constante. Esta presión constante mantiene el pulmón en un estado razonablemente inflado. Por lo tanto, este método genera un espécimen histológico del pulmón que es adecuado para evaluar el enfisema leve inducido por humo de cigarrillo.

Introducción

La EPOC es una de las principales causas mundiales de muerte¹. El humo del cigarrillo es la causa más importante de la EPOC, pero los mecanismos de la patogénesis siguen estando incompletamente definidos. La EPOC demuestra dos características principales, incluyendo la limitación progresiva del flujo de aire y una respuesta inflamatoria anormal del pulmón. El trastorno hemofusostoso ocurre con frecuencia en los pulmones de los pacientes con EPOC². Los hallazgos patológicos del enfisema se caracterizan por la destrucción de la pared alveolar³. Se han utilizado varias especies animales para generar modelos de EPOC in vivo (es decir, perros, conejillos de indias, monos y roedores)⁴. Sin embargo, el ratón se ha convertido en el más utilizado en la construcción de modelos de EPOC. Esto tiene muchas ventajas, incluyendo su bajo costo, capacidad para ser modificado genéticamente, amplia disponibilidad de información genómica, disponibilidad de anticuerpos, y la capacidad de utilizar una variedad de cepas de ratón⁵. En la actualidad, no hay ningún modelo de ratón que pueda imitar todas las características de la EPOC humana; por lo tanto, los investigadores individuales deben elegir qué modelo es el más adecuado para la investigación específica de la EPOC⁶. El modelo de ratón enfisematoso es uno de los muchos modelos de ratón EPOC que están disponibles actualmente. Los modelos adicionales incluyen el modelo de ratón de exacerbación, el modelo de comorbilidades sistémicas y el modelo de susceptibilidad a la EPOC^7.

El modelo de ratón enfisematoso puede ser generado por varios tipos de agentes exógenos, incluyendo agentes químicos y exposición al humo del cigarrillo⁴. La exposición química (p. ej., a la elestasa) produce un tipo grave de enfisema, mientras que el humo del cigarrillo produce un enfisema leve^8,9. Se cree que el humo del cigarrillo es la principal causa de la patogénesis de la EPOC; por lo tanto, la elección del humo del cigarrillo como medio para crear un modelo de ratón COPD es razonable¹⁰. Muchos estudios han utilizado humo de cigarrillo para crear enfisema en el ratón. Por ejemplo, Nikula y otros crearon con éxito un modelo de ratón enfisematoso de ratones hembra B6C3F1 exponiéndolos al humo del cigarrillo durante 7 o 13 meses¹¹. También hemos establecido un modelo de ratón enfisematoso a través de la proteína marcador de senescencia/SMP-30 KO ratones¹². Es crucial realizar un método de fijación pulmonar que pueda visualizar adecuadamente este modelo de enfisema leve por exposición al humo del cigarrillo.

Se han establecido varios métodos para la fijación pulmonar¹³. Sin embargo, no existe un método estándar de oro de fijación de tejido pulmonar para evaluar el enfisema¹⁴. Varios estudios de este laboratorio han demostrado que el sistema de fijación presentado aquí es útil mediante la creación de una condición estable para la evaluación del enfisema^{12,15,16,17,18}. La principal ventaja del sistema actual es que puede fijar muchos pulmones con la misma condición a la vez sin colapso pulmonar o deflación. El sistema de fijación pulmonar actual utiliza algunos equipos especiales que permiten inflar muestras pulmonares a una presión constante adecuada durante un período determinado. Este equipo especial consta de tres partes, incluyendo un contenedor inferior, contenedor superior y bomba. Las muestras pulmonares se colocan en el contenedor inferior que está conectado a los agentes de fijación presurizados, lo que resulta en una diferencia de presión de 25 cmH₂O en el nivel de agentes entre los contenedores superior e inferior^19.

Protocolo

Los siguientes métodos han sido aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela universitaria de Medicina de Juntendo. Se siguieron las Directrices para la correcta realización de experimentos con animales, Consejo Científico del Japón, 1 de junio de 2006. Hay tres pasos principales en este método: 1) disección del ratón, 2) exsanguinación pulmonar y 3) fijación de tejidos pulmonares asistidos por equipos especializados. Típicamente, los especímenes pulmonares se procesan para su incrustación después de 48 h de fijación^{12,15,16,17,18}.

1. Disección del ratón

1. Mida el peso corporal del ratón y, a continuación, determine la cantidad de pentobarbital que se debe administrar.
2. Inyectar pentobarbital por vía intraperitoneal a una dosis de 70 mg/kg de peso corporal y confirmar la anestesia por la ausencia de reacción al pellizco del dedo del dedo del día.
3. Inyectar la aguja en un ángulo de 45o hasta que penetre en la piel y el músculo. Dibuje el émbolo y confirme un vacío de aire, luego inyecte el pentobarbital.
4. Confirmar la anestesia por ausencia de movimiento reflejo.
   NOTA: Se recomienda usar un ratón anestesiado en lugar de un ratón eutanasiado para una exsanguinación pulmonar completa.
5. Cortar la piel del ratón y el músculo abdominal en la línea medial, apuntando a la zona cefálica.
6. Corte lateralmente para proporcionar un espacio de trabajo más amplio.

2. Exsanguinación pulmonar

1. Exponga la capa de diafragma y perforela con fórceps.
2. Abra el espacio torácico y corte el área esternal, permitiendo que los pulmones y el corazón sean vistos claramente.
3. Cortar el corazón en la aurícula izquierda y el ventrículo derecho.
4. Inserte una cánula (24 G) en el área del ventrículo derecho y dirijala a la zona cefálica hasta que llegue a la arteria pulmonar, como se muestra en la Figura 1.
5. Encienda la bomba y permita que la solución salina 1x con fosfato (PBS) circule (aproximadamente 200 ml/h) hasta que todo el tejido pulmonar cambie a un color blanco.

3. Fijación del tejido pulmonar

1. Retire la tráquea, los pulmones y el corazón.
2. Libere los tres órganos cortando los tejidos conectivos circundantes.
3. Ate el bronquio principal derecho con un hilo de sutura y corte todos los lóbulos del pulmón derecho.
4. (Opcional): los lóbulos del pulmón derecho constan de cuatro partes. Corte estas partes del bronquio principal derecho y divida las partes para su procesamiento como muestras de tejido congelado.
5. Inserte el corazón y los lóbulos del pulmón izquierdo en agentes de fijación, ubicados dentro de una jeringa de 10 ml.
   ADVERTENCIA: Los agentes de fijación son peligrosos. Use un equipo de protección adecuado (por ejemplo, guantes de goma largos) y trabaje en una habitación bien ventilada.
6. Cree una condición de vacío utilizando una jeringa de 10 ml para inflar el pulmón, como se muestra en la Figura 2.
7. Inserte una cánula (20 G) en la tráquea y ate un nudo.
8. Infle el pulmón con agentes de fijación para comprobar si hay fugas, utilizando una jeringa de 1 ml.
9. Transferencia a equipos de presión de fijación pulmonar, como se ilustra en la Figura 3.
10. Después de los períodos de fijación, retire la muestra pulmonar que ate la tráquea con un nudo.

Resultados

Como se describió anteriormente, el equipo especializado, que genera una presión constante extendida, se puede dividir en tres partes(Figura 3A). La parte inferior es el punto en el que insertar la muestra pulmonar(Figura 4A). El pulmón está conectado a través de una cánula (20 G) a la punta del flujo de formalina utilizando una polla de parada de tres vías(Figura 4B). La pre...

Discusión

El procedimiento de fijación para los pulmones de roedores que se presenta aquí no es novedoso; sin embargo, este sistema tiene varias ventajas. En primer lugar, puede fijar muchos pulmones (máximo de 20) con la misma condición a la vez. La Sociedad de Patología Toxicológica afirma que la presión por la insclasificación de gravedad varía de 22–25 cmH₂O²². En particular, varios estudios han realizado fijación pulmonar a una presión de 25 cmH₂O^13<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% formalin (formalin neutral buffer solution)	Wako	060-01667
Bent forceps	Hammacher	HSC187-11
Cannula, size 20G	Terumo	SR-FS2032
Cannula, size 22G	Terumo	SR-OT2225C	Cannula to exsanguinate lung
Forceps	Hammacher	HSC184-10
Kimtowel	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	61000
Kimwipe	Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark)	62011
Lower container (acrylic glass material)	Tokyo Science	Custom-made	Pressure equipment component
Roller pump	Nissin Scientific Corp	NRP-75	Pump machine to exsanguinate lung
Roller pump RP-2000	Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)	160200	Pressure equipment pump
Silicone tube Ø 9 mm	Sansyo	94-0479	Pressure equipment component
Somnopentyl (64.8 mg/mL)	Kyoritsu Seiyaku	SOM02-YA1312	Pentobarbital Sodium
Surgical scissor	Hammacher	HSB014-11
Suture thread, size 0	Nescosuture	GA01SW
Syringe, 1 mL	Terumo	SS-01T
Syringe, 1 ml with needle	Terumo	SS-01T2613S
Syringe, 10 mL	Terumo	SS-10ESZ
Three-way stopcock	Terumo	TS-TR1K01
Upper container (acrylic glass material)	Tokyo Science	Custom-made	Pressure equipment component