用石英谐振器研究磷脂结合蛋白附件 a2 与固体支持的脂质层结合动力学的耗散微重法

摘要

在这里, 我们提出了一个实验协议, 可用于确定结合亲和力和模式的相互作用, 无标签磷脂结合蛋白 a2 与固定化固体支持的双层 (slb) 同时测量蛋白质附件 a2 的质量吸收和粘弹性特性。

摘要

耗散石英晶体微平衡技术是一种简单而无标签的方法, 可同时测量传感器表面固定质量的质量吸收和粘弹性特性, 从而可以测量相互作用具有固体支撑表面的蛋白质, 如脂质双层, 实时且灵敏度高。附件是一组高度保守的磷脂结合蛋白,通过钙离子的协调与带负电荷的头群发生可逆相互作用。在这里, 我们描述了一个协议, 用于定量分析在石英传感器表面制备的亚氧化亚素 a2 (anxa2) 与平面脂质双层的结合。该协议经过优化, 可获得可靠且可重现的数据, 并包括详细的分步说明。该方法可应用于其他膜结合蛋白和双层组成。

引言

细胞膜是高度动态和复杂的结构。膜脂质的复合混合物, 与外周和/或整体相关的膜蛋白, 聚集在一起形成微域。这些膜微域的协调时空组织参与了关键的生理过程¹。膜微域动力学是由膜脂质的相互作用以及外周膜蛋白识别微域中丰富的脂质并与之相互作用的能力驱动的。蛋白质的招募到特定的脂质往往是通过脂质识别模块, 如 plecstrin 同源 (ph) 或 c2 域 2^,3。使用模型膜的生物物理分析方法是了解在分子水平上指导这些过程的基本原则的关键。

附件是一个大型多基因家族, 以其在 ca^{2 +}控制的方式中与带负电荷的膜脂质 (主要是磷脂酰丝氨酸 (ps)--结合而闻名.附件家族的第二个特点是存在一个保守的结构段, 即附件重复, 即存在四到八次, 并窝藏 ca^{2 +}-和磷脂结合位点⁴。ca^{2 +}依赖脂质相互作用使环素处于一个完美的位置, 可以感知和传递 ca^{2 +}介导的信号到目标膜。在细胞和/或人工膜系统5中, 环氧素始终能够诱导富含胆固醇、磷脂酰亚胺醇-4-5-双磷酸 (PI(4,5)P₂) 和 ps 的微域的形成.该协议描述了一种利用石英晶体微平衡耗散 (qcm-d)^6、7、8分析环素膜相互作用的方法。

这种微平衡中的基本组件是作为传感器表面的振荡晶体。分子对传感器表面的吸附和结合降低了共振频率 (f) 与质量增加成比例。如果表面均匀地涂上薄膜, 附加物质的结合可能会干扰该层的结构完整性, 并且可以另外监测粘弹性 (耗能系数 d) 的这种变化。这是一种研究蛋白质与脂质双层相互作用的广泛技术。在这种方法中, 脂质囊被吸收到适当涂层的传感器表面。脂质双层形成有利于硅基材料^9,10, 因为囊泡通常不会在其他亲水表面破裂, 如在紫外线-臭氧接触后氧化的金¹¹ 、tio212^或al2o3^13.结泡的破裂释放水相, 导致质量和耗散的特征变化。通过囊泡融合生成固体支持的双层 (slb), 简单而坚固, 可用于生成模拟细胞膜的复杂模型。

耗散石英晶体微平衡是一种无标签、灵敏的技术。一个主要的优势是可以将产生足够薄膜的任何材料涂在表面, 从而在不同的研究领域提供广泛的应用。实时观察了蛋白质与膜的相互作用, 并能直接对结果进行分析。相同的传感器表面可用于后续测量 (在执行本协议中所述的最小清洁后), 从而实现精确的内部控制和分析物之间的可比性。

研究方案

注: 缓冲器应使用0.22 微米的过滤器进行过滤, 并通过真空脱气1小时。

1. 脂质叶泡制备

1. 使用2毫升玻璃管。溶解每个脂质, 1, 2-二氧基-甘油-3-磷胆碱 (docp), 1-棕榈醇-2-油氧基-甘油-3-磷胆碱 (popc), 1-palmitoyl-2-oleyylal-抢辛-甘油-3-pex-l-丝氨酸 (辛) 和胆固醇 (chol), 在氯仿/甲醇 (50:50 vv) 制备出透明的 5 mm 脂质溶液。溶解 1, 2-二烯醇-甘油-3-磷 (1 '-米肌醇-4 ', 5 '-双磷酸) (PI(4,5)P 2) 在氯甲氧酚水混合物中 (20:9: 1 v\ v)。
2. 将溶解的脂质按所需的 poccp-丁酯比 (80/2), POPC/PI(4,5)P₂ (95/)、ppops/chol (60/20)、_{POPC/POPS/PI(4,5)P 2}/chol (60/") 和 POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P_2/chol (37/20/20) (表 1)在10毫升的玻璃管。
   注: 总脂质的最终量为500μg。
3. 使用干式氮气流蒸发有机溶剂。将脂质混合物放在高真空 (冻干) 系统中 3小时, 以去除溶剂的任何残留痕迹。
   注: 这将导致干燥的透明膜。
4. 在柠檬酸酯缓冲液1毫升 (10 mm 三柠檬酸酯, 150 mm ncl, ph 4.6) 中重新使用脂膜。在 60°c (此温度高于混合物中最高熔融脂质的相变温度约 10°c) 时, 在水浴中进行30分钟的培养, 每5分钟大力旋转一次。
   注: 这将导致形成大型的多层囊泡 (mlv)。将悬架保持在过渡温度以上。
5. 将挤出机 (在这种情况下为 60°c) 加热, 并在过渡温度 (这里为 40-50°c) 以上, 配备直径为50纳米的孔隙大小的聚碳酸酯膜, 时间为30分钟。
6. 将 mlv 悬架加载到预热挤出机中, 轻轻通过聚碳酸酯膜通过混合物 31x, 形成小单侧囊泡 (suv)¹⁴。保持温度高于过渡温度。
7. 将 suv 悬架转移到2毫升塑料反应容器中, 并添加柠檬酸缓冲液 (见步骤 1.4), 使最终体积达到2毫升。
   注: 这将产生250μgml 的最终脂质浓度。

2. 处理石英传感器

注: 始终使用推器处理石英传感器。

1. 将插入聚四氟乙烯支架中的四个传感器在 2% sds 溶液中培养≥ 30分钟, 用超纯水广泛清洗, 以完全去除 sds, 并使用干氩或氮气流将其干燥。
2. 使用等离子清洗系统完全去除任何污染物。将干燥的传感器插入等离子清洗室, 将其疏散, 并用氧气冲洗3倍。打开等离子清洁剂。使用以下工艺参数: 1 x 10-4 torr 压力、高射频 (rf) 功率和10分钟的工艺时间。关掉机器, 取出传感器。

3. 微平衡操作

注: 采用了具有四个温度控制流室的微平衡系统, 该系统采用平行配置, 连接到蠕动泵, 并设置为80μlmmin 的流速。在开放流动模式下, 缓冲器从馈线储液库泵入接收槽。在环路模式下, 接收罐与馈线储罐连接, 生成闭环。温度设置为20°c。

1. 使用推拿器, 小心地将清洗过的等离子传感器停靠到4个流室中。避免对腔内和管内可能导致泄漏的任何压力或扭转。
2. 在开放流动模式下, 用柠檬酸三价缓冲液 (10 mm 柠檬酸三钠、150 mm ncl, ph 4.6) 冲洗系统10分钟。
   注: 这需要完全 3.2 ml 的缓冲区, 但最好使用过多的缓冲区 (10 毫升)。
3. 启动该程序。开始记录使用软件的第一基本音调 (n = 1) 和言外音 (n = 3-13) 的频率和耗散的任何变化, 直到频率和耗散基线稳定 (这大约需要 40-60分钟)。
   注: 频率噪声水平 (峰值至峰值) 应低于 0.5 hz, 对于耗散, 应低于 0.1·10-6, 最大漂移 (在水溶液中) 的频率为 1 hz h, 在功耗上为 0.3·10-6/h。
4. 当基线稳定时, 将 suv 悬浮液应用于柠檬酸缓冲液 (小管中的2毫升)。使用反应容器, 去除 1.5 ml 的死体积。然后在环路模式下关闭系统。将频率/耗散移位再记录10分钟。
   注: 在此期间, 囊泡将扩散到 sio2 表面并熔合形成连续的双层 15^、16 (图 1、图 2和图 3中的步骤 2)。suv 在传感器表面的吸附是两相的, 在耗散中具有典型的频率最小值和最大值。具有从26-29 赫兹的特征频移 (取决于脂质成分) 的稳定的新频率耗散基线 (见表 1) 表明表面有一个连续的双层。
5. 当 slb 稳定 (见步骤 3.4) 时, 将系统与运行缓冲液 (10 mm hepes、150 mm ncl、ph 7.4) 平衡在所需的 ca^{2 +}浓度 (从50μm 到 1 mm cl_2,视实验而定) 的开放流动模式。40分钟
6. 将蛋白质 (此处为 anxa2) 添加到包含 ca^{2 +}的运行缓冲区中 (请参阅步骤 3.5)。在循环模式下执行蛋白质的应用, 直到达到平衡稳定状态 (图 1、图 2和图 3中的步骤 3)。
   注: 蛋白质浓度可能从1到 400 nm 不等。蛋白质吸附导致浓度依赖性的频移, 反映了质量 (蛋白质) 的吸附。
7. 在开放流动模式下的运行缓冲液中, 用 5 mm egta 螯合 ca^{2 +}离子分离约束蛋白 (图 1和图2中的步骤 4)。
   注: 恢复的频率和耗散到 slb 基线表明完全可逆性的蛋白质结合。关联分离循环可以重复比较不同的浓度或蛋白质。

4. 微平衡清洗

注: 每次测量后执行最小清洗过程。

1. 在连续开放流动模式下, 以50毫升的 ddh2o_再生微平衡系统, 从水容器中取出管道, 让系统干燥。
2. 小心地取出晶体传感器, 用 2% sds 溶液使用聚四氟乙烯支架清洗 (见步骤 2.1)。
3. 擦干放置传感器的流量模块内部的可见部分。
   注: 在一系列10次测量后执行密集的清洁过程。
4. 在 40°c (在软件中设置) 模式下使用 2% sds 溶液 (50 ml) 在连续开放流 (管) 模式下清洁系统, 使用20μl% 的流速与洗涤剂长时间接触。
5. 在流量为160μlmin 的情况下, 在连续开放流动模式下, 用250毫升的 ddh2o 进行清洁。
   注: 4个月后, 根据制造商的手册进行广泛的清洁操作。

结果

谐振频率 (f) 的减少与索尔布雷方程定义的吸附质量 (m) 呈线性关系。¹⁷

这里, f 是谐振频率, c_f是一个常数, 取决于给定石英的几何和物理特性以及谐振频率, 而 a 是传感器的表面积。

在大多数应用中, 吸附层不是完全刚性的, 而是粘弹性的。由此产生的石英传感器振荡阻尼称为耗散 (d)。被监测的耗散变化 (d) 与结合质量¹⁸的粘弹性特性相关, 定义如下:⁸。

在这里, e_耗散是在一个振荡期间失去的能量, 而_{e 存储}的是自由振荡传感器的总能量。

为了分析和量化结合参数, 通过绘制平衡频移 (f e) 对蛋白质浓度的计算, 得到了频率等温线。f e被定义为

这里,_{f t1}代表蛋白质吸附的开始,_{f t1}的平衡状态。非线性曲线拟合可以通过使用 langmuir 方程的山展开来实现, 如^下所示6^,8。

这里, f_最大值是蛋白质浓度的 f e, 导致最大 (饱和) 结合, k_d是蛋白膜复合物的表观离解常数, n 是希尔系数。

希尔系数 (n) 描述了结合的协同作用。对于 n = 1, hill 吸附模型是一个简单的 langmuir 等温线 (相等的结合位点和所有分子相互独立地结合到脂质双层)。如果 n 1, 结合配体会改变其他配体的膜结合亲和力, 要么增加 (n & gt; 1, 正协象), 要么降低 (n & lt; 1, 负协象性) 的亲和力。

图 1显示了我们实验室用于测量 ca^{2 +}依赖结合期间共振和频率变化以及 anxa2 释放到液相中脂质双层的实验工作流程示意图。示例记录如图 2所示。图 2a显示了频率曲线的记录,图 2 b 显示了耗散的变化。在脂质体的加入下频率的显著下降 (图 2 a [步骤 1]) 表明它们的吸附。由于填充缓冲区的囊泡不是刚性的, 而是粘弹性的, 所以耗散会增加 (图 2 b [步骤 1])。随后, 结状囊泡破裂。囊泡内缓冲液的伴随释放会减少吸附质量, 直到达到稳定的高原 (图 2 a [步骤 2])。值得注意的是, 加入囊泡会导致较高的耗散转变, 而由于 slb 的刚性同质性, 对双层的响应变化要小得多 (图 2 b [步骤 2])。图 2 a 和2A 中的步骤3记录了 anxa2 与脂质的结合, 这增加了质量, 如清晰的频移所示, 但不会干扰双层结构, 如耗散的唯一微小变化所示。当 chategta 去除 ca2⁺ (图 1和图 2 [步骤 4]) 时, anxa2 与脂膜分离。频率, 以及耗散记录, 转移到水平看到的只有与双层(比较步骤 2和2 b 中的步骤2和 2 b), 表明 anxa2 绑定完全依赖于 ca^{2 +} , 并与脂质膜保持完整。

anxa2 和大多数环状素一样, 依赖于 ps 等带负电荷的脂质。当脂质双层中不存在持久性有机污染物时, 就可以清楚地看到这一点 (图 3)。图 3a显示了频率曲线的记录,图 3b显示了耗散的变化。请注意, 频率转移到-25 hz 的稳定基线, 但耗散不会改变 (图 3 b [步骤 2]), 这表明形成了适当的双层。但是,在 ca^{2 +} (图 3a和 3A [步骤 3]) 或 egta (图 3. 3] 的存在下添加 anxa2 后, 没有观察到频率 ( 图 3 a) 或耗散 (图 3 b) 的变化.3 a和3A [步骤 4]), 因为 anxa2 不能与脂质膜相互作用。

图 1: 实验工作流程的图形模型.此工作流程说明了囊泡对亲水性传感器表面的吸收 (步骤 1)、导致 slb 形成的囊泡模糊破裂 (步骤 2)、anxa2 的 ca⁺依赖性吸附 (步骤 3) 和与 egta 相关的解吸 (步骤 4)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 典型的录制.这些面板显示 (a) 第7个过音谐振频率的时间依赖性监测和 (b) 测量过程中石英传感器的耗散变化。脂质体的应用会导致频率基线的快速下降, 而耗散基线则会增加 (步骤 1)。基线的稳定表示双层的形成 (步骤 2)。anxa2 (200 nm) 吸附 (在 ca^{2 +}存在的情况下) 在含有 posp 的脂质双层上增加质量, 而不会显著改变耗散, 这表明脂膜没有受到干扰 (步骤 3)。用 egta 恢复 ca2⁺螯合后的频率基线表明蛋白质的总解吸 (第4步)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:阴性对照实验, 表明在没有持久性有机污染物的情况下, anxa2 不会与 slb 结合.这些面板显示了脂质体的添加和 slb 形成 (步骤1和 2)。在引入 anxa2 (步骤 3;200 nm, 在 ca^{2 +}存在的情况下) 或 egta (步骤 4) 后, (a) 频率或 (b) 耗散没有明显变化.请点击这里查看此图的较大版本. 

组成	slb 形成后的 f/hz	d *10-6形成 slb 后
poppc/unep/pops/s。4 (80:20)	26.3±0。2	0.26±0.03
POPC/PI(4,5)P2 (95:5)	26.5±0。5	0.31±0.02
ppocp/popsc醇 (60:20:20)	292±0。2	0.45±0.09
poc/ppisp/PI(4,5)P 2/chol (60:17:3:20)	29.6±0。6	0.43±0.10
popc/dopc/poppsp/PI(4,5)P 2/chol (37:20:20:3:20)	29.4±0。4	0.39±0.14

表 1: slb 的脂质组成和形成数据^7..

讨论

为了以定量和定性的方式回答有关细胞膜结构-功能关系的问题, 细胞生物学从使用基于成熟和广泛使用的技术的生物物理方法中获益匪浅, 包括原子力显微镜 (afm)、表面等离子体共振 (spr) 和这里使用的 qcm-d 技术。我们在以前的研究中表明, 环素蛋白以 ca^{2 +}依赖的方式与具有高亲和力的固定化膜结合。我们使用第7个言外音 (f7) 的频率和耗散变化, 因为这代表了检测灵敏度和振荡稳定性的最佳妥协。

这种技术还允许定量描述膜-蛋白质相互作用。anxa2 结合膜的特点是正协同作用, 由保守的环素核心域介导, 并取决于胆固醇的存在。在其他^地方详细报告了 anxa2 和 AnxA2 的定量数据。

此协议中有许多关键步骤。立即使用脂质体;否则, 小囊泡可能会融合成较大的囊泡, 表面张力较小, 从而抑制脂质双层的形成。在测量过程中保持恒定的温度。温度的每一个微小偏差都会导致不可忽略的频率和耗散变化。避免气泡;否则, 系统是不稳定的, 不会建立基线。

sauerbrey 方程允许将观测到的频率变化直接转换为质量变化, 因此被广泛使用。然而, 共振频率的变化与增加的质量之间的线性相关性的假设只适用于在传感器表面形成刚性和均匀膜的组件。sauerbrey 方程不能用于粘弹性吸附剂, 如富含水的蛋白质膜、含有水的脂质层, 甚至不能用于吸附细胞。在这里, 需要更复杂的数学模型。因此, 同时监测频率和耗散的变化是极其重要的。为了检测测量过程中的结构变化, 可以绘制d 与f 比率, 一条直线表示没有构象变化。

这种技术的一个主要优点是可以使用非常广泛的材料作为基材。此外, 它是研究广泛的大分子相互作用的可靠和直接的方法, 因为表面涂层膜 (如 slb) 的适当形成, 以及进一步的蛋白质-脂质相互作用, 可以在网上监测。

该协议可应用于其他膜相互作用的蛋白质, 例如 bar 域蛋白¹⁹、erm (ezrin、radixin 和 moesin) 蛋白家族, 它们在膜细胞骨架连接^20、21 中具有重要作用 ^、22或含有 c2 或 ph 域的蛋白质。此外, 该技术在生物材料研究中的广泛应用也已成功出版, 从而建立了 qcm 作为一个适合的实验平台, 用于研究更复杂的大分子组件甚至更复杂的高分子组件的相互作用。细胞^23,24。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Calciumchloride	Merck	017-013-00-2	99%
Chloroform	Roth	4432.1	99%
DOPC	Avanti	850375P
EGTA	PanReac AppliChem	A0878	99%
HEPES	PanReac AppliChem	A1069
Methanol	PanReac AppliChem	A3493
PiP2	Avanti	850155P
POPC	Avanti	850457P
POPS	Avanti	840034P
Sodiumchloride	PanReac AppliChem	A1149
SDS	Roth	183
Trisodium citrate	PanReac AppliChem	A3901
Equipment
Extruder Liposofast	Avestin
Qsense E4 Analyzer	Qsense
QSense Dfind	Qsense
Pump IPC 4	Ismatec	ISM 930
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm	Qsense	QSX 303
PC Membranes 0.05μm	Avanti polar lipids	610003
OriginPro	OriginLab Corporation		Version 8 and 9