散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

要約

ここでは、結合親和性と固定化固相担膜 (SLB) と A2 を同時に測定することによりアネキシン ラベル無料リン脂質結合蛋白質の相互作用のモードを決定するために用いることができる実験的プロトコルを提案する、質量吸収とアネキシン A2 蛋白質の粘弾性特性。

要約

散逸水晶振動子微量天秤法が同時に相互作用の測定が可能、センサー表面の吸収固定化質量の質量吸収および粘弾性特性を測定する簡単なラベル無料アプローチタンパク質などリアルタイムでの脂質二重膜の固相担面と高い感度を有する。アネキシンは、カルシウム イオンの調整を介して負荷電の headgroups を可逆的操作リン脂質結合蛋白質の非常に節約されたグループです。ここでは、A2 をアネキシンの結合を定量的に解析する採用されたプロトコルについて述べる (AnxA2) 水晶振動子センサーの表面上に作製した平面脂質二重膜に。このプロトコルは、堅牢かつ再現性のあるデータを取得するように最適化し、詳細な説明が含まれています。このメソッドは、他の膜結合タンパク質と二分子膜組成に適用できます。

概要

細胞膜は、非常にダイナミックで複雑な構造です。末梢および/または一体に関連する膜蛋白質と脂質の化合物の混合物は、フォーム ミクロ相分離構造を組み立てます。これら膜ミクロ ドメインの協調空間組織は重要な生理的過程¹で関与しています。膜創製の原動力は、周辺膜蛋白質を認識し、脂質、ミクロ相分離構造の濃縮と対話の能力によってと同様、膜脂質の相互作用によって駆動されています。特定の脂質をタンパク質の募集は頻繁に脂質認識モジュールを介して達成、プレクストリン相同性 (PH) や C2 ドメイン^2,3など。モデル膜の生物物理学的分析法は、分子レベルでこれらのプロセスを管理する基本原則を理解するための鍵です。

大規模な多遺伝子発現解析-家族、アネキシン負荷電膜脂質、ホスファチジルセリン (PS)、主に Ca^{2 +}でバインドする能力で知られている-方法²を制御します。アネキシンの家族の第 2 の特徴は保存された構造のセグメントの存在、つまり現在の 4 または 8 回し、Ca^{2 +}- とリン脂質の結合サイト⁴港湾を繰り返す、アネキシンします。Ca^{2 +}-依存脂質膜相互作用を感知し、Ca^{2 +}を伝えるための最適なポジションに、アネキシンの場所-ターゲット膜へのシグナリングを仲介します。一貫して、アネキシンがコレステロール、ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸 (PI (4, 5) P₂) と PS、携帯電話および/または人工膜システム⁵の両方を豊かにミクロ相分離構造の形成を誘導することができます。このプロトコルでは、水晶振動子微量天秤散逸 (QCM-D)^6,7、8を使用してアネキシン膜の相互作用を分析する方法について説明します。

この天秤の基本的なコンポーネントは、センサーの表面として機能する振動結晶です。吸着および/またはセンサーの表面に分子の結合量の増加に比例して共振周波数 (f) が減少します。フィルム表面は均等に、追加物質の結合は、この層の構造の整合性と干渉するかもしれないし、粘弾性 (エネルギー損失係数 D) におけるこのような変更をまた監視できます。これは脂質とタンパク質の相互作用を研究する広範な技術です。このアプローチで脂質ベシクルは適切にコーティングされたセンサーの表面に吸収されます。脂質二分子膜の形成は、小胞が多いと他の親水性の表面で破裂しない石英材料^9,10、有利な金¹¹酸化アル_{や TiO2の¹²、UV オゾン暴露後のよう2}O₃¹³。合体の小胞の破裂は、質量と放熱特性変化につながる水相を解放します。固相担 (SLB) 膜小胞の融合によっての世代はシンプルで堅牢、細胞膜を模倣する複雑なモデルを生成するために使用できます。

散逸の水晶振動子は、無料のラベル、機密性の高い手法です。最大の利点は、このように多様な研究分野でのアプリケーションの広い範囲を提供する表面に十分に薄膜を生成する任意の材料をコートする可能性です。膜タンパク質の相互作用を観察、リアルタイムと結果を直接分析することができます。(後で最小限の洗浄で行うこのプロトコルで記述されている)、その後の測定で同じセンサーの表面を使用ことができますこのように正確な内部統制および検体間の比較可能性を可能にします。

プロトコル

注: 0.22 μ m のフィルターを使用して、1 時間真空脱泡、バッファーをフィルターする必要があります。

1. 脂質小胞の準備

1. 2 mL ガラス管を使用します。それぞれの脂質を溶解 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (ダイレクトオン)、ホスホコリン (POPC)、1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (POP)、クロロホルムの混合物中のコレステロール (哲)/メタノール (50: 50 v/v) クリア 5 mM 脂質溶液を調製します。クロロホルム/メタノール/水 (20:9:1 v/v) の混合物の 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4, 5) P₂) を解散します。
2. POPC/ポップス (80/20) POPC/PI (4, 5) P₂の目的のモル比で分解された脂質を結合 (95/5) POPC/ダイレクトオン/ポップ/PI (4, 5) P₂/Chol (37/20/20/3/20) (、POPC/ポップ/PI (4, 5) P₂/Chol (60/17/3/20)、POPC/ポップ/哲 (60/20/20)表 1)10 mL ガラス管。
   注: 最終総脂質量は 500 μ g です。
3. 窒素の乾燥したストリームを使用して有機溶媒を蒸発させます。残留溶媒の痕跡を削除する 3 h の高真空 (凍結乾燥) システムに脂質混合物を残します。
   注: ドライ クリア フィルムでこの結果します。
4. 1 mL のクエン酸バッファー (10 mM-クエン、150 mM の NaCl、pH 4.6) では、脂質膜を再懸濁します。水風呂と渦で 30 分間インキュベート 60 ° c (この温度は混合物で最も高い溶解脂質の相転移温度より 10 ° C 前後) 脂質懸濁液それは 5 分ごとに積極的に。
   注: これは大きい、多重小胞 (Mlv) の形成に結果します。転移温度以上の懸濁液を保ちます。
5. 30 分間転移温度 (これは 40-50 ° C) の上直径 50 nm の細孔サイズ ポリカーボネート膜を装備 (この場合は 60 ° C) で押出機を予熱します。
6. 予熱した押出機に MLV サスペンションを読み込み、小型単層ベシクル (Suv)¹⁴を形成するポリカーボネート膜を通して混合物 31 x をそっと渡します。転移温度以上の温度を保ちます。
7. SUV の懸濁液を 2 mL プラスチック製反応容器に転送し、クエン酸バッファーを追加 (手順 1.4 参照) 2 mL 最終巻をさせる。
   注: これは最終的な脂質濃度 250 μ G/ml になります。

2. 水晶センサーの取り扱い

注: は常にピンセットを持つ水晶センサーを処理します。

1. 4 つを孵化させなさいセンサー挿入 ≥ 30 分洗浄 2 %sds 溶液ポリテトラフルオロ エチレン ホルダーに広く超純粋な水と完全に SDS を削除して乾燥アルゴンまたは窒素のストリームを使用して乾燥させます。
2. プラズマ洗浄システムを使用すると、任意の汚染物質を完全に削除します。プラズマ洗浄室で乾燥センサーを挿入、商工会議所、避難およびそれをフラッシュ酸素と 3 倍。プラズマ クリーナーの電源を入れます。次のプロセス パラメーターを使用して: 1 x 10^-4 Torr の圧力、高周波 (RF) 電源と処理時間の 10 分。コンピューターの電源を切り、センサーを取り出します。

3. 振動子微量天秤の操作

注: 並列構成では、蠕動ポンプに接続されているし、80 μ L/分の流量設定の 4 つの温度制御された部屋天秤システムが使われました。オープン フロー モードでバッファーは受水槽にフィーダー貯留層から励起されました。ループ モードでは受水槽は、閉じたループを生成するフィーダー タンクと接続されました。温度は 20 ° C に設定しました。

1. 慎重にプラズマ洗浄センサーは 4 流の部屋に、ピンセットを使用してドッキングします。任意の圧力やチャンバーと漏れの原因となる管のねじりを避けるため。
2. 10 分間オープン フロー モードでクエン酸バッファー (クエン酸、10 mM ナトリウム-塩化ナトリウム、pH 4.6 150 mM) を使用してシステムをフラッシュします。
   注: これはバッファーの正確 3.2 mL 必要ですがバッファー (10 mL) の超過分を使用することをお勧めします。
3. プログラムを起動します。周波数と最初の基本的なトーンの散逸の変更の記録を開始 (n = 1) と倍音 (n = 3-13) 周波数と電力のベースラインが安定するまでに、ソフトウェアを使用して (これは約 40-60 分かかります)。
   注: 周波数騒音レベル (ピーク) は散逸、0.1·10 よりも低いため、0.5 Hz より低い必要があります^-6頻度と 0.3·10 で 1 Hz/h (水溶液) の最大ドリフトで損失で^-6/h。
4. ベースラインが安定しているときは、SUV の懸濁液クエン酸バッファー (細い管で 2 mL) を適用します。反応容器を使用して、1.5 mL のデッド ボリュームを削除します。ループ フロー モードでシステムを閉じます。10 分間周波数/消費電力シフトを記録します。
   注: この時間の間に小胞が SiO₂表面に広げるし、ヒューズ連続膜^15,16 (図 1図 2、および図 3の手順 2) を形成します。Suv センサーの表面への吸着は 2 相性で、最小値と最大損失の典型的な周波数。26-29 Hz から (脂質) によって特徴的な周波数シフトと新しい周波数/消費電力ベースラインが安定 (表 1参照) 表面に連続的な層を示します。
5. SLB が安定した場合 (ステップ 3.4 を参照)、必要な Ca^{2 +}濃度 (まで 50 μ M からを 1 mM CaCl_2、実験によって) のオープン モードで実行中のバッファー (10 mM HEPES、150 mM の NaCl、pH 7.4) を使用してシステムの平衡40 分。
6. タンパク質を追加 (ここでは AnxA2) バッファーの実行に含まれる Ca^{2 +} (ステップ 3.5 を参照)。(図 1図 2、および図 3の手順 3) 平衡定常状態に達するまで、ループ フロー モードで蛋白質のアプリケーションを実行します。
   注: 蛋白質の集中からまで及ぶかもしれない 1 400 nM。タンパク質吸着は、質量 (タンパク質) の吸着を反射濃度依存性周波数シフトの結果します。
7. 5 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸オープン フロー モード (図 1および図 2の手順 4) 実行中のバッファー内の Ca^{2 +}イオンをキレートでバインドされた蛋白質を分離します。
   注: 周波数と SLB ベースラインに損失を回復はタンパク結合の合計の可逆性を示します。濃度の異なるまたはタンパク質を比較する会合解離のサイクルを繰り返すことができます。

4. 振動子洗浄

注: は、各データ測定後最小限の洗浄手順を実行します。

1. DdH₂連続オープン フロー モード O の ml の 50 天秤システムを再生成、水容器からチューブを削除し、乾燥を実行システム。
2. 慎重に水晶センサーを取り外してポリテトラフルオロ エチレン ホルダーを使用して 2 %sds の溶液で拭いて (手順 2.1 を参照してください)。
3. センサーが置かれたフロー モジュール内部の目に見える部分を乾燥します。
   注: は、集中的な一連の 10 の測定後の手順のクリーニングを実行します。
4. 洗剤と拡張された接触の 20 μ L/分の流量を使用して、連続的な開いた流れ (チューブ) モードの 40 ° c (ソフトウェアのセットアップ) 2 %sds 溶液 (50 mL) を使用してシステムをきれい。
5. DdH₂O 160 μ L/分の流量で連続的な開いた流れモードで 250 mL できれい。
   注: 4 ヶ月後に製造元のマニュアルによると大規模なクリーニング手順を実行します。

結果

Sauerbrey の同等化によって定義されている吸着質量 (Δm) と直線的に共振周波数 (Δf) の減少と相関関係します。¹⁷

ここで、f は共振周波数、C_fは与えられた水晶と共振周波数の幾何学的および物理的な特性に依存する定数、A はセンサー面積。

ほとんどのアプリケーションで、吸着層は粘弾性が完全に剛体ではありません。水晶センサー振動の減衰結果は損失 (D) と呼ばれます。変更 (ΔD) バインドされている大量の¹⁸の粘弾性特性との相関、監視対象の損失の⁸通り定義されます。

ここでは、1 つの発振周期中に失われたエネルギーを電子_消費し、自由に振動センサーの総エネルギーは、電子_{保存します}。

分析し、バインディング パラメーターの定量化、周波数等温線、タンパク質の濃度に対して平衡周波数シフト (ΔΔf_e) をプロットすることによって派生します。ΔΔf_eとして定義されて

ここでは、Δf_t1は、タンパク質吸着と Δf_t2平衡状態の始まりを表します。非線形カーブ フィットは、ラングミュア式^6,8通りの丘の拡張を使用して実行できます。

ここでは、最大 (飽和) バインディングの結果のタンパクの ΔΔf_e ΔΔf_maxは、K_dはタンパク質/膜複合体の見かけの解離定数、n はヒル係数。

ヒル係数 (n) は、バインディングの協同性を説明します。N = 1、丘吸着モデルはラングミュアの単純な等温線 (等しく結合部位とすべての分子互いにバインドの脂質二重膜)。N ≠ 1、バインドされたリガンドに結合親和性他の配位子の膜が変更された場合、どちらかは (n > 1、正の協同性) を増加または減少する (n < 1、負の協同性) 親和性。

図 1は、Ca^{2 +}の間に共鳴の周波数シフトを測定する私たちの研究室で使用される実験ワークフローの模式図を示しています-液相での脂質二重膜に依存して結合および AnxA2 の。模範的な記録を図 2に示します。図 2A頻度曲線の記録、図 2B消費シフトを示しています。リポソーム (図 2A [ステップ 1]) の添加によって頻度の顕著な低下は、吸着を示します。バッファー満たされた小胞は、剛性ではありませんが、粘弾性、損失増加 (図 2B [ステップ 1])。その後、合体の小胞が破裂します。小胞内部バッファーの併用のリリースは、安定した高原 (図 2A [ステップ 2]) に達するまで吸着質量を減少します。注記のうち、2 層に応えてシフトははるかに小さい SLB (図 2B [ステップ 2]) の剛体均質な性質のため、小胞の追加結果高放熱シフト。ステップ 3図 2Aおよび2Bのレコードの AnxA2 のバインディング明確な周波数シフトが見られるように、質量を追加しますが、二層構造と干渉しない、脂質に損失の唯一の小さな変更によって示される。Ca^{2 +}がキレート剤グリコールエーテルジアミン四酢酸 (図 1および図 2 [ステップ 4]) によって削除されると、脂質膜から AnxA2 が切り離されます。AnxA2 バインドが完全に Ca に依存を示す 2 層のみ (比較手順 2 および 4図 2 aと2Bの) で見られるレベルに散逸録音と同様に、周波数シフト^{2 +}とする脂質膜そのまま残ります。

AnxA2、最もように、アネキシン PS. など負荷電脂質によって異なりますこれは POP が存在しないときは明らかに見られる脂質二重膜 (図 3)。図 3A頻度曲線の記録、図 3B消費シフトを示しています。注、頻度転位-25 Hz で安定したベースラインにまだ損失ではない変更適切な二分子膜形成を (図 3B [ステップ 2])、示す。ただし、周波数 (図 3A) の損失 (図 3B) に変更後に観察しない Ca^{2 +} (図 3Aと3B [ステップ 3]) の存在下で AnxA2 の追加またはグリコールエーテルジアミン四酢酸 (図3 aと3B [ステップ 4])、AnxA2 は、脂質膜と対話できません。

図 1:実験的ワークフローのグラフィカル モデル。このワークフローを示します (ステップ 1)、親水性センサー表面に小胞吸収 SLB 形成 (手順 2)、および Ca^{2 +}につながる小胞融合/破裂-依存吸着 (ステップ 3) と AnxA2 のグリコールエーテルジアミン四酢酸依存脱着 (ステップ 4)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

図 2: 模範的な記録します。これらのパネルの表示 (A) 第 7 倍音共鳴周波数の時間依存の監視と散逸 (B) シフト水晶センサー測定中。リポソームの応用は、放散基準 (ステップ 1) の増加に対し周波数基準の急速な低下を引き起こします。ベースラインの安定化は、(手順 2) 二重膜の形成を示します。AnxA2 (200 nM) (存在下で Ca^{2 +}) ポップスを含む脂質二分子膜への吸着散逸、脂質膜が混乱しないことを示す (ステップ 3) を大幅に変更せず大量に追加します。グリコールエーテルジアミン四酢酸と Ca^{2 +}キレートに周波数基準の回復は、(手順 4) タンパク質の全脱離を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3:AnxA2 が POP の不在での SLBs にバインドされないことを示す負の制御実験。これらのパネルは、リポソームと SLB 形成 (手順 1 と 2) の追加を示します。AnxA2 の付加の後で明白な周波数 (A) または (B) 消滅の変更はありません (Ca^{2 +}の存在下で、3; 200 nM ステップ) またはグリコールエーテルジアミン四酢酸 (ステップ 4)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

組成	ΔΔF/Hz SLBs の形成の後	ΔΔD * 10-6 SLB の形成の後
POPC/ポップス (80:20)	26.3 ± 0.2	0.26 ± 0.03
POPC/PI (4, 5) P2 (95:5)	26.5 ± 0.5	0.31 ± 0.02
POPC/ポップ/哲 (60:20:20)	29.2 ± 0.2	0.45 ± 0.09
POPC/ポップス/PI (4, 5) P2/Chol (60:17:3: 20)	29.6 ± 0.6	0.43 ± 0.10
POPC/ダイレクトオン/ポップス/PI (4, 5) P2/Chol (37:20:20: 3:20)	29.4 ± 0.4	0.39 ± 0.14

表 1: SLB の脂質組成と生成データ⁷.

ディスカッション

定量的および定性的な両方細胞膜の構造と機能の関係に関する質問に答えるため生物物理アプローチの使用から非常に細胞生物学利益確立に基づいて、広く技術を使用、原子を含む力の顕微鏡 (AFM)、表面プラズモン共鳴 (SPR) と QCM-D 法がここに採用します。アネキシン タンパク質 Ca^{2 +}の結合する前の研究で示した-高親和性固定化膜に依存する方法。周波数を使用して消費シフト第 7 倍音 (Δf7) これは検出感度と振動安定性の最良の妥協点を表すため。

この手法には、膜タンパク質間相互作用の定量的な説明ができます。膜への AnxA2 バインドは、保存されたアネキシン コア ドメインによって仲介される、コレステロールの存在に依存する正の協同性が特徴です。AnxA2 と AnxA8 に掲載されるために得られる定量的なデータは別の場所で^6,8を詳しく説明します。

このプロトコルには多くの重要なステップがあります。すぐにリポソームを使用します。そうでなければ、小さな小胞は、脂質二分子膜形成の阻害につながる以下の表面張力より大きい小胞に溶けるでしょう。測定中に一定の温度を維持します。各温度のバラツキが少ないは、無視できない頻度と消費シフトの結果します。空気の泡を避けるためさもなければ、システムは安定して、ベースラインを確立しません。

Sauerbrey の同等化は、観測周波数の直接変換質量の変化に変更は、したがって、広く使用されることができます。ただし、共振周波数の変化と付加質量の線形相関の仮定はのみセンサー表面上剛性と均一な膜を形成するコンポーネントの場合は true を保持します。Sauerbrey の同等化は粘弾性吸着脂質層に取り込まれた水は、水が豊富なタンパク質フィルムなどには使用できませんまたは細胞をも吸着します。ここより複雑な数理モデルが必要です。したがって、非常に周波数や消費電力の変化を同時に監視することが重要です。測定の間に構造変化を検出するには、ΔD対Δf 比をプロットできます、構造変化がないことを示す直線と。

この手法の主な利点は、基板として材料の非常に広い範囲を使用する可能性が。また、表面コーティング膜 (SLB) などの適切な形成としてそれ以上のタンパク質-脂質相互作用だけでなく、高分子の相互作用の広い範囲を研究するための信頼性の高い直接法をオンラインで監視することができますです。

このプロトコルは、他の膜と相互作用するタンパク質など、適用ドメイン蛋白質¹⁹、バー膜骨格リンケージ^{20,21 で重要な役割を持っている ERM (モエシン、ラデキシン、エズリン) タンパク質ファミリー ,22}、または C2 または PH ドメインを含むタンパク質。さらに、生物学的材料の研究にこの手法の適用の広い範囲が正常に公開されたより複雑な高分子アセンブリあるいは相互作用の研究に適して実験プラットフォームとして水晶振動子を確立^23,24をセルします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Calciumchloride	Merck	017-013-00-2	99%
Chloroform	Roth	4432.1	99%
DOPC	Avanti	850375P
EGTA	PanReac AppliChem	A0878	99%
HEPES	PanReac AppliChem	A1069
Methanol	PanReac AppliChem	A3493
PiP2	Avanti	850155P
POPC	Avanti	850457P
POPS	Avanti	840034P
Sodiumchloride	PanReac AppliChem	A1149
SDS	Roth	183
Trisodium citrate	PanReac AppliChem	A3901
Equipment
Extruder Liposofast	Avestin
Qsense E4 Analyzer	Qsense
QSense Dfind	Qsense
Pump IPC 4	Ismatec	ISM 930
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm	Qsense	QSX 303
PC Membranes 0.05μm	Avanti polar lipids	610003
OriginPro	OriginLab Corporation		Version 8 and 9