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  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
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摘要

在这里, 我们提出了一个协议,获得68ga 掺杂氧化铁纳米粒子通过快速微波驱动合成。该方法使 pet/i 1) mri 纳米颗粒在20分钟的合成中具有90% 以上的放射性标记效率和99% 的放射化学纯度。

摘要

在这里, 我们描述了微波合成, 以获得氧化铁纳米粒子掺杂与 68 ga. 微波技术实现快速和可重复的合成过程。在这种情况下, 从 ficl3和柠檬酸三钠开始, 在10分钟内在微波中获得涂有柠檬酸的氧化铁纳米颗粒。这些纳米粒子的核心尺寸为 4.2±1.1 nm, 流体动力尺寸为 7.5±2.1 nm。此外, 它们具有 11.9 mm-1·s-1 的高纵向松弛性 (r1) 值和 22.9 mm-1-1的适度横向松弛度值 (r2), 从而导致较低的 r2 /r1 比率为1.9。这些值可在磁共振成像 (mri) 中产生正对比度, 而不是用于氧化铁纳米粒子的负对比度。此外, 如果在起始材料中加入68ge-68 ga 发生器中的68gal3 洗脱,则可获得掺杂 68 ga 的纳米辐射仪.无论使用何种初始活性, 该产品都具有较高的放射性标记产率 (& gt; 90%)。此外, 一个单一的纯化步骤使纳米辐射材料准备在体内使用。

引言

医疗成像技术的结合引发了对合成多模态探针123的不同方法的探索。由于正电子发射断层扫描 (pet) 扫描仪的灵敏度和 mri 的空间分辨率, pet/mri 组合似乎是最吸引人的可能性之一, 同时提供解剖和功能信息 4。在 mri 中, 可以使用 t2 加权序列, 使它们积累的组织变暗。t1加权序列也可以使用, 产生特定聚集位置5的亮化。其中, 正对比往往是最充分的选择, 因为负对比使信号更难以与内源性低指区域区分开来, 包括那些经常由肺等器官呈现的区域.传统上, 基于 gd 的分子探针被用来获得正对比。然而, 基于 gd 的造影剂存在一个主要的缺点, 即其毒性, 这在肾病患者7,8,9中至关重要。这促使了在合成生物相容性材料作为 t1 造影剂的研究方面取得了积极的努力。一个有趣的方法是使用氧化铁纳米粒子 (ionps), 具有非常小的核心尺寸, 提供积极的对比10。由于这个非常小的核心 (~ 2 纳米), 大多数的 fe3 +离子都在表面, 每个都有5个未配对的电子。这增加了纵向松弛时间 (r1) 值, 并产生更低的横向比 (r2/r1) 相比, 传统的 ionps, 产生所需的正对比11

要将 nanoparticle 与 pet 的正电子发射器结合, 需要考虑两个关键问题: 放射性同位素选择和纳米粒子放射性标记。关于第一个问题, 68ga 是一个诱人的选择。它的半衰期相对较短 (67.8 分)。它的半衰期适合于肽标记, 因为它与普通肽生物分布时间相匹配。此外,发电机中生产 68 ga, 使其能够在工作台模块中进行合成, 并避免了在 121314附近使用回旋加速器。为了使纳米颗粒的放射性, 表面标记放射性同位素的结合是目前流行的策略。这可以使用螯合 68 ga 的配体或利用与纳米粒子表面的辐射相互关系来完成。文献中有关 ionps 的大多数例子都使用螯合剂。有使用杂环配体的例子, 如 1, 4, 7, 10-四氮唑二钠-1, 4, 7, 10-四乙酸 (dota)15, 1, 4, 7-三氮环酮-1, 4, 7-三乙酸 (nota)16,17, 和 1, 4, 7-三氮环酮烯 1-谷氨酸 4-7-乙酸 (nodaga)18, 并使用 2, 3-二羧基丙酸-1-二膦酸 (dpd), 四聚体脂质 19. madru等人20在2014年制定了一项无螯合剂战略, 使用另一个集团在第21后使用的无螯合剂方法给 ionps 贴上标签.

然而, 这种方法的主要缺点包括体内转金属的高风险、低放射性标记的产量以及不适合寿命短的同位素222324 的冗长协议。为此, wong等人.25开发了第一个掺杂核纳米粒子的例子, 在使用微波技术进行的5分钟合成中, 成功地将64铜纳入了 nanoparticles 的核心。

在这里, 我们描述了一个快速和有效的程序, 以纳入纳米粒子的核心, 阐明了传统方法提出的许多缺点。为此, 我们建议使用微波驱动合成 (mws), 它大大缩短了反应时间, 提高了产量, 并增强了可重复性, 这在 ionp 合成中至关重要。mws 的精细化性能是由于介电加热: 快速样品加热, 因为分子偶极子试图与交变电场对齐, 是极性溶剂和试剂更有效地用于这种合成。此外, 使用柠檬酸作为表面活性剂, 加上微波技术, 产生了非常小的纳米粒子, 产生了双 t1 加权 micet 26 信号, 这里表示为68ga 核掺杂氧化铁纳米粒子 (68ga-c-ionp)。

该协议结合了微波技术, 68gocl3作为正电子发射器, 氯化铁, 柠檬酸钠, 水合氨, 导致双 t 1 加权 mri\ pet 纳米颗粒材料在几乎20分钟。此外, 它在68ga 活性 (37 mbq、111 mbq、370 mbq 和 1110 mbq) 范围内产生一致的结果, 对纳米粒子的主要物理化学特性没有显著影响。该方法使用高68ga 活性的重现性扩展了可能的应用领域, 包括大型动物模型或人类研究。此外, 该方法中还包含一个单一的纯化步骤。在此过程中, 任何过量的游离镓、氯化铁、柠檬酸钠和水合氨都通过凝胶过滤去除。完全自由的同位素消除和样品的纯度确保无毒性, 并提高成像分辨率。在过去, 我们已经证明了这种方法在有针对性的分子成像27,28的有用性。

研究方案

1. 试剂制备

  1. 0.05 m hcl
    1. 将0.08μl 的 37% hcl 添加到50毫升的蒸馏水中, 制备 0.05 m hcl。
  2. 高效液相色谱洗脱液
    1. 通过溶解6.9 克一水二氢钠、7.1 克磷酸氢二钠、8.7 克氯化钠和0.7 克氮化钠, 制备高效液相色谱 (hplc) 洗脱液。混合好, 检查 ph 值。使用前, 通过0.1μm 的切断无菌过滤器和除气。验收范围: ph 6.2-7.0 (如果不是, 请与 naoh [1 m] 或 hcl [5m] 调整。

2. 醋酸铁包氧化铁纳米粒子的合成

  1. 在9毫升的水中溶解 75毫克的 ficl 3·6h2o 和80毫克柠檬酸三钠二水.
    注: 这些数量提供了12毫升的最终纯化纳米粒子 ([fe] ~ 1.4 mg·ml-1)。数量可以缩小, 以获得2.5 毫升的最终体积。
  2. 将混合物放入微波适应的烧瓶中。
  3. 在微波中加载动态协议。将温度设置为 120°c, 时间设置为 10分钟, 压力设置为 250 psi, 功率设置为 240 w。
  4. 在反应中加入1毫升的水合氨。
    注: 水合物开始减少铁。因此, 观察到溶液的外观发生了变化, 从浅黄色到棕色。
  5. 启动微波协议。
  6. 同时, 用20毫升的蒸馏水冲洗凝胶过滤脱盐柱。
  7. 协议完成后, 让烧瓶在室温下冷却。
  8. 将最终混合物的移液器 2.5 ml 放在柱上, 并丢弃流经。
    注: 微波在60°c 时停止协议;纳米颗粒可在60°c 时直接添加到凝胶过滤柱中。
  9. 在柱中加入3毫升蒸馏水, 并将纳米颗粒收集在玻璃瓶中。
    注: 纳米粒子可在室温下储存1周。在这段时间之后, 纳米颗粒聚集出现, 增加了它们的流体动力尺寸。

3. 68ga 皮质掺杂氧化铁纳米粒子的合成 (68ga c-ionp)

  1. 将75毫克的 ficl3·6h2o和80毫克柠檬酸三钠二水放入微波适应的烧瓶中.
  2. 根据供应商的说法, 使用hcl的推荐体积和浓度 (在我们的情况下, 4 毫升 0.05 m hcl), 使用推荐hcl 体积和浓度来缓解 68 ge:68 ga 发生器。在自屏蔽发生器中注入该体积后, 获得 (4 毫升) 68 gacl3 ,无需进一步处理即可使用。
    注: 步骤 3.2-3.12 遵循相应的放射性安全措施。68ga 是一种正电子和伽玛发射体同位素。使用适当的安全措施以避免操作人员暴露在辐射下至关重要。研究人员必须遵循 alara (尽可能低的合理可实现) 协议, 使用典型的屏蔽和放射性核素处理程序。此外, 必须使用戒指、身体徽章和污染检测器。
  3. 在微波适应的烧瓶加入4毫升 68 gacl 3. 根据发电机的活性和最终纳米粒子的所需活性, 这个体积可以更小。
  4. 将5毫升的蒸馏水放入烧瓶中, 搅拌均匀。
  5. 在微波中加载动态协议。将温度设置为 120°c, 时间设置为 10分钟, 压力设置为 250 psi, 功率设置为 240 w。
  6. 在反应中加入1毫升的水合氨。
    注: 水合物开始减少铁。因此, 观察到溶液的外观发生了变化, 从浅黄色到棕色。
  7. 启动微波协议。
  8. 同时, 用20毫升的蒸馏水冲洗凝胶过滤脱盐柱。
  9. 协议完成后, 让烧瓶在室温下冷却。
  10. 将最终混合物的移液器 2.5 ml 放在柱上, 并丢弃流经。
    注: 微波在60°c 时停止协议;纳米颗粒可在60°c 时直接添加到凝胶过滤柱中。
  11. 在柱中加入3毫升蒸馏水, 并将纳米颗粒收集在玻璃瓶中。
  12. 使用 nai 井型探测器计算放射性标记效率。此参数通常测量参与反应的68ga 的活性。经过合成和纯化后, 对纯化样品的活性进行了测定。由于半衰期较短, 为68ga, 最初的活动必须在时间 (t) 进行纠正。随时间归一化遵循标准方程:
    nt = ne-t
    这里
    n t: 在时间计数 (T)
    n0: 计数在时间 (t) = 0
    *: 衰变常数
    t: 经过的时间
    figure-protocol-2270
    注: 辐射标记效率应在 90%-95% 之间。

4. 68ga 皮质掺杂氧化铁纳米颗粒 (68ga c-ionp) 的分析

  1. 动态光散射
    1. 利用动态光散射 (dls) 测量68ga-c-ionp 的流体动力尺寸。将样品的液相60μl 放入立方, 并对每个样品进行三次尺寸测量。为确保重现性, 应在多个纳米颗粒批次中重复使用。
  2. 胶体稳定性
    1. 通过测量不同时间 (pbs、盐水和小鼠血清) 中不同时间 (从0至 24h) 中培养后样品的水动力大小, 评估68ga-c-ionp 的胶体稳定性. 在每个缓冲液中孵育 500μl, 在37。°c。在选定的时间, 采取 60μl aliquots 和移液器, 他们进入 dls 立方体, 以测量其流体动力大小。
  3. 电子显微镜
    1. 利用透射电子显微镜 ( tem) 和环形暗场成像 (stem-hadf) 分析 68 ga-c-ionp 的核心尺寸 (参考 tem 协议: nits-ncl 联合检测协议, pcc-x, 用透射电子测量纳米粒子的尺寸显微镜)。
  4. 凝胶过滤无线电色谱仪
    1. 在凝胶过滤净化步骤中, 将洗脱分离成 500μl aliquots, 并用活化剂测量每个材料中存在的放射性;因此, 渲染凝胶过滤色谱图。
  5. 68ga-c-ionp 的放射性化学稳定性
    1. 在 37°c (重复 3倍) 时, 在小鼠血清中培养68ga-c-ionp 30分钟。之后, 通过超滤净化纳米颗粒, 测定纳米颗粒和滤液中的放射性。在不同的滤液中不应检测到任何活性。
  6. 松弛法
    1. 在 1.5 t 和37°c 的松弛计中测量纵向 (t1) 和横向 (t2) 松弛时间.应测量四种不同浓度的 68 ga-c-ionp (2 mm、1 mm、0.5 mm 和 0.25 mm)。打印放松率 (r1= 1.5 1, r2= 半 2) 对铁浓度。得到的曲线斜率呈现 r 1 r2 值。
  7. mr 和 pet 幻影图像
    1. 获得68 ga-c-ionp(0 mm、1 mm、6.5 mm 和 9.0 mm) 的一系列稀释的原位 mr (t1 加权序列) 和 pet 幻影图像, 以观察与 pet 活性和 mM 相关的增加信号。

结果

68将 ficl368gocl 3、柠檬酸、水和水合氨合成了 ga-c-ionp。这种混合物在120°c 和控制压力下被引入微波炉10分钟。一旦样品冷却到室温, 纳米颗粒通过凝胶过滤进行纯化, 以消除未反应的物种 (fecl 3, 柠檬酸,水合氨) 和游离68ga (图 1)。

利用动态光散射 (dls) 测?...

讨论

氧化铁纳米颗粒是一种成熟的 t加权 mri 造影剂。然而, 由于这种类型的对比度的缺点, 诊断某些疾病, t1 加权或明亮的对比度是许多倍的首选。这里介绍的纳米粒子不仅克服了这些限制, 在 mri 提供了积极的对比, 而且还提供了一个信号, 在功能成像技术, 如 pet, 通过68ga 纳入其核心。微波技术增强了这种可复制的纳米粒子合成, 将反应时间大大缩短到总共约 20分钟 (?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究得到了西班牙经济和竞争力部 (赠款编号: saf2016-79993-p) 和卡洛斯三世健康研究所 (赠款编号: dts16/00059) 的赠款支持。该中心由新闻中心和专业大学基金会提供支助, 是 severo ochoa 英才中心 (meic 奖 sev-2015-0505)。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Iron (III) chloride hexahydratePOCH2317294
Citric acid, trisodium salt dihydrate 99%Acros organics227130010
Hydrazine hydrateAldrich225819
Hydrochloric acid 37%Fisher Scientific10000180
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateAldrichS9638
Disodium phosphate dibasicAldrichS7907
Sodium chlorideAldrich746398
Sodium AzideAldrichS2002
Sodium dihydrogen phosphate anhydrousPOCH799200119
68Ga Chloride ITG Isotope Technologies Garching GmbH, Germany68Ge/68Ga generator system
MicrowaveAnton PaarMonowave 300
CentrifugeHettichUniversal 320
Size Exclusion columnsGE HealthcarePD-10

参考文献

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