Síntesis de 68Ga dopado a base de óxido de hierro nanopartículas de doble emisión de positrones/proyección de imagen de resonancia magnética (T1)

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener⁶⁸Ga dopado a base de óxido de hierro nanopartículas vía rápida basada en microondas síntesis de. La metodología hace PET/MRI (T₁) las nanopartículas con radiolabeling eficiencias superiores al 90% y la pureza radioquímica del 99% en una síntesis de 20 minutos.

Resumen

Aquí, describimos una síntesis de microondas para obtener óxido de hierro nanopartículas núcleo dopado con ⁶⁸GA. microondas tecnología permite rápido y reproducibles procedimientos sintéticos. En este caso, a partir de FECLAS₃ y citrato trisódico sal, nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con ácido cítrico se obtienen en 10 minutos en el microondas. Estas nanopartículas presentan un tamaño pequeño núcleo de 4.2 ± 1.1 nm y una hidrodinámica de 7,5 nm ± 2.1. Por otra parte, tienen un valor alto relaxivity longitudinal (r₁) 11,9 mM^-1·s^-1 y un valor modesto relaxivity transversal (r₂) de 22,9 mM^-1·s^-1, que se traduce en una baja r₂ /r₁ proporción de 1,9. Estos valores permiten la generación positiva de contraste en resonancia magnética (MRI) en lugar de contraste negativo, comúnmente utilizado con nanopartículas de óxido de hierro. Además, si una elución ⁶⁸GaCl₃ desde un ⁶⁸Ge /⁶⁸generador de Ga es añadido a las materias primas, se obtiene un nano-radiosonda dopado con ⁶⁸Ga. Se obtiene el producto con un alto rendimiento radiolabeling (> 90%), independientemente de la actividad inicial utilizada. Además, un paso de purificación solo hace el nano-radiomaterial listo para ser usado en vivo.

Introducción

La combinación de técnicas de imagen para fines médicos ha provocado la búsqueda de diferentes métodos sintetizar sondas multimodal^1,2,3. Debido a la sensibilidad de los escáneres de tomografía por emisión de positrones (PET) y la resolución espacial de la RM, combinaciones de PET/MRI parecen ser una de las más atractivas posibilidades, proporcionar información anatómica y funcional en el mismo tiempo⁴. En MRI, T₂-pueden utilizarse secuencias ponderadas, oscurecimiento de los tejidos en los que se acumulan. T₁-secuencias ponderadas pueden usarse también, produciendo el brillo de la ubicación de acumulación específicos⁵. Entre ellos, contraste positivo suele ser la opción más adecuada, como contraste negativo, resulta mucho más difícil de distinguir la señal de áreas hipointensas endógeno, los presentados a menudo por órganos como los pulmones⁶incluidos. Tradicionalmente, se han empleado sondas moleculares basados en Gd para obtener contraste positivo. Sin embargo, agentes de contraste basados en Gd presentan un gran inconveniente, a saber, su toxicidad, que es fundamental en pacientes con problemas renales^7,8,9. Esto tiene motivos investigación en la síntesis de materiales biocompatibles, para su uso como agentes de contraste de₁ T. Un enfoque interesante es el uso de óxido de hierro nanopartículas (IONPs), con un tamaño extremadamente pequeño núcleo, que aportan contraste positivo¹⁰. Debido a este núcleo extremadamente pequeño (~ 2 nm), la mayoría de la Fe^{3 +} iones están en la superficie, con 5 electrones desparejados. Esto aumenta el tiempo de relajación longitudinal (r₁) valores y rendimientos mucho inferior transversal/longitudinal (r₂/r₁) proporciones en comparación con el tradicionales IONPs, produciendo el deseado positivo contraste¹¹.

Para combinar IONPs con un emisor de positrones para mascota, hay dos cuestiones claves a tener en cuenta: elección de radioisótopo y nanopartículas radiolabeling. Con respecto a la primera cuestión, ⁶⁸Ga es una opción atractiva. Tiene una vida media relativamente corta (67,8 min). Su vida media es conveniente para el péptido etiquetado ya que coincide con épocas de biodistribución de péptidos comunes. Por otra parte, ⁶⁸Ga se produce en un generador, que permite la síntesis en los módulos de banco y evitando la necesidad de un ciclotrón cercano^12,13,14. Para radiolabel la nanopartícula, superficie de etiquetado incorporación de radioisótopos es la estrategia predominante. Esto puede hacerse usando un ligando que quela ⁶⁸Ga o tomando ventaja de la afinidad del radiometal hacia la superficie de la nanopartícula. Más ejemplos en la literatura referente a IONPs utilizan un quelante. Hay ejemplos de la utilización de ligandos heterocíclicos como 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacético ácido (DOTA)¹⁵1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic ácido (NOTA)^16,17y 1,4,7- triazacyclononane, 1-glutárico ácido ácido-4,7-acético (NODAGA)¹⁸y el uso del ácido 2,3-dicarboxypropane-1,1-oxálico (DPD), un ligando de tetradentate ¹⁹. Madru et al. ²⁰ desarrolló un quelante libre estrategia en 2014 a la etiqueta IONPs utilizando un método libre de quelante utilizado por otro grupo posterior²¹.

Sin embargo, grandes inconvenientes de este enfoque incluyen un alto riesgo de reductora en vivo , bajos rendimientos radiolabeling y largos protocolos inadecuados para isótopos de breve duración^22,23,24. Por esta razón, Wong et al. ²⁵ se convirtió en el primer ejemplo de nanopartículas núcleo dopado, logrando incorporar ⁶⁴Cu en la base de las IONPs en una síntesis de 5-min utilizando la tecnología de microondas.

Aquí, describimos un procedimiento rápido y eficiente para incorporar el radionúclido en el núcleo de la nanopartícula, eludir muchos de los inconvenientes presentados por los métodos tradicionales. Para ello, proponemos la utilización de una síntesis basada en microondas (MW), que reduce considerablemente los tiempos de reacción, aumenta los rendimientos y mejora la reproducibilidad, parámetros críticamente importantes en síntesis IONP. El refinado funcionamiento del MWS es debido al calentamiento dieléctrico: rápida muestra como dipolos moleculares intentan alinearse con el campo eléctrico alterno, siendo más eficiente para este tipo de síntesis de reactivos y solventes polares. Además, el uso de ácido cítrico como surfactante, junto con la tecnología de microondas, resulta en nanopartículas muy pequeñas, produciendo un doble T₁-ponderada señal de²⁶ RM/PET, denotada aquí como ⁶⁸Ga núcleo dopado óxido de hierro nanopartículas (⁶⁸Ga-C-IONP).

El protocolo combina el uso de la tecnología de microondas, ⁶⁸GaCl₃ como emisor de positrones, cloruro de hierro, citrato de sodio, hidrato de hidracina, resultando en doble T₁-weighted materiales nanoparticulados de RM/PET en apenas 20 minutos. Por otra parte, rinde resultados constantes en un rango de ⁶⁸actividades Ga (37 MBq, 111 MBq, 370 MBq y 1110 MBq) sin efectos significativos sobre las principales propiedades físico-químicas de las nanopartículas. La reproducibilidad del método con alta ⁶⁸Ga actividades amplía el campo de posibles aplicaciones, incluyendo modelos de animales grandes o estudios en humanos. Además, hay un paso de purificación solo incluido en el método. En el proceso, cualquier exceso de libre galio, cloruro de hierro, citrato de sodio e hidrato de hidracina se eliminan por filtración en gel. Eliminación de isótopos libre total y la pureza de la muestra de no garantizar la toxicidad y mejoran la proyección de imagen de resolución. En el pasado, ya hemos demostrado la utilidad de este enfoque en^27,proyección de imagen molecular específica²⁸.

Protocolo

1. preparación del reactivo

1. Ácido clorhídrico de 0,05 M
   1. Preparar 0.05 M de HCl agregando 208 μl del 37% HCl a 50 mL de agua destilada.
2. Eluyente de cromatografía líquida de alto rendimiento
   1. Disolver 6,9 g de Sodio dihidrogenofosfato monohidrato, 7,1 g de fosfato de hidrógeno disódico, 8,7 g de cloruro de sodio y 0,7 g de azida de sodio en 1 L de agua para preparar eluyente de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Mezclar bien y comprobar el pH. Pasar el eluyente a través de un filtro estéril corte de 0,1 μm y desgasificar antes de su uso. Rango de aceptación: pH 6.2-7.0 (si no, ajuste con [1 M] de NaOH o HCl [5 M]).

2. síntesis de nanopartículas de óxido de hierro recubierto de citrato

1. Disolver 75 mg de FECLAS₃·6H₂O y 80 mg de ácido cítrico trisódico dihidrato de sal en 9 mL de agua.
   Nota: Estas cantidades proporcionan 12 mL de nanopartículas purificadas finales ([Fe] ~1.4 mg·mL^-1). Cantidades pueden ser reducidas para obtener un volumen final de 2,5 mL.
2. Ponga la mezcla en el matraz de microondas adaptados.
3. Cargar un protocolo dinámico en el microondas. Ajustar la temperatura a 120 ° C, el tiempo de 10 min, la presión hasta 250 psi y la energía de 240 w.
4. Añadir 1 mL de hidrato de hidracina para la reacción.
   Nota: Hidrato de hidracina comienza reducción de hierro. Por lo tanto, se observa un cambio en la apariencia de la solución, de amarillo claro a marrón.
5. Iniciar el protocolo de microondas.
6. Mientras tanto, enjuague una desalación columna de gel filtración con 20 mL de agua destilada.
7. Una vez finalizado el protocolo, deje que el matraz se enfríe a temperatura ambiente.
8. Pipetear 2,5 mL de la mezcla final en la columna y descartar el flujo a través.
   Nota: El horno de microondas deja el protocolo a 60 ° C; las nanopartículas pueden añadirse directamente a la columna de gel filtración a 60 ° C.
9. Añadir 3 mL de agua destilada a la columna y recoger las nanopartículas en un frasco de vidrio.
   Nota: Las nanopartículas pueden almacenarse a temperatura ambiente durante 1 semana. Después de este tiempo, agregación de nanopartículas aparece, aumentando su tamaño hidrodinámico.

3. síntesis de nanopartículas de óxido de hierro dopado a base de Ga ⁶⁸(⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Poner 75 mg de FECLAS₃·6H₂O y 80 mg de ácido cítrico sal trisódico dihidrato en el matraz de microondas adaptados.
2. Eluir el ⁶⁸Ge⁶⁸generador de Ga utilizando el volumen recomendado y la concentración de HCl, según el proveedor (en nuestro caso, 4 mL de 0.05 M de HCl). Después de la inyección de ese volumen en el generador tubular (4 mL de) ⁶⁸GaCl₃ es obtenida, listo para usar sin la transformación posterior.
   Nota: Siga las medidas de seguridad correspondientes de radiactividad para pasos 3.2-3.12. ⁶⁸ GA es un isótopo emisor de positrones y gamma. Es crucial el uso de las medidas de seguridad apropiadas para evitar la exposición a la radiación por el operador. Los investigadores deben seguir un protocolo ALARA (tan bajo como sea razonablemente posible) con típico de blindaje y procedimientos de manipulación de radionúclidos. Por otra parte, es obligatorio el uso de un anillo, insignias del cuerpo y un detector de contaminación.
3. Añadir 4 mL de ⁶⁸GaCl₃ en el matraz adaptados al microondas. Este volumen puede ser menor, dependiendo de la actividad del generador y la actividad deseada de nanopartículas finales.
4. Pipetear 5 mL de agua destilada en el matraz y mezclar bien.
5. Cargar un protocolo dinámico en el microondas. Ajustar la temperatura a 120 ° C, el tiempo de 10 min, la presión hasta 250 psi y la energía de 240 w.
6. Añadir 1 mL de hidrato de hidracina para la reacción.
   Nota: Hidrato de hidracina comienza reducción de hierro. Por lo tanto, se observa un cambio en la apariencia de la solución, de amarillo claro a marrón.
7. Iniciar el protocolo de microondas.
8. Mientras tanto, enjuague una desalación columna de gel filtración con 20 mL de agua destilada.
9. Una vez finalizado el protocolo, deje que el matraz se enfríe a temperatura ambiente.
10. Pipetear 2,5 mL de la mezcla final en la columna y descartar el flujo a través.
    Nota: El horno de microondas deja el protocolo a 60 ° C; las nanopartículas pueden añadirse directamente a la columna de gel filtración a 60 ° C.
11. Añadir 3 mL de agua destilada a la columna y recoger las nanopartículas en un frasco de vidrio.
12. Calcular radiolabeling eficacia usando un detector de tipo pozo de NaI. Este parámetro normalmente mide la actividad de la ⁶⁸Ga incorporado en la reacción. Después de procesos sintéticos y purificación, se mide la actividad de la muestra purificada. Debido a la corta vida media de ⁶⁸Ga, la actividad inicial tiene que corregirse en el tiempo (t). Normalización con el tiempo sigue la ecuación de estándar:
    N_T = N₀ · e^-λt
    Aquí,
    N_T: cuenta en el tiempo (t)
    N₀: cuenta en el tiempo (t) = 0
    Λ: constante de decaimiento
    t: el tiempo transcurrido
    
    Nota: Radiolabeling eficiencia debe ser entre 90% - 95%.

4. Análisis de ⁶⁸Ga dopado a base de óxido de hierro nanopartículas (⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Dispersión ligera dinámica
   1. Uso dinámica dispersión de la luz (DLS) para medir el tamaño hidrodinámico de ⁶⁸Ga-C-IONP. Pipetee 60 μL de la muestra en una cubeta y realizar tres mediciones de tamaño por ejemplo. Para asegurar la reproducibilidad, esto debe repetirse con varias tandas de nanopartículas.
2. Estabilidad coloidal
   1. Evaluar la estabilidad coloidal de ⁶⁸Ga-C-IONP midiendo el tamaño hidrodinámico de la muestra después de la incubación en diferentes tampones (PBS, solución salina y suero de ratón) de diferentes épocas, que van desde 0 a 24 h. Incubar 500 μl de la muestra en cada búfer en 37 ° C. En el seleccionado, tomar alícuotas de 60 μL y pipetear en cubetas DLS para medir el tamaño hidrodinámico.
3. Microscopia electrónica
   1. Analizar el tamaño de la base de ⁶⁸Ga-C-IONP utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM) y proyección de imagen de campo oscuro anular (madre-HAADF) (referencia protocolo TEM: NIST - protocolo de ensayo conjunto de NCL, PCC-X, mide el tamaño de las nanopartículas usando electrónica de transmisión Microscopia).
4. Radio-cromatograma de la filtración de gel
   1. Fraccionar la elución en alícuotas de 500 μl durante la etapa de purificación del gel filtración y medir la radiactividad presente en cada uno con un activimeter; haciendo así, un cromatograma de gel filtración.
5. Estabilidad radioquímica de ⁶⁸Ga-C-IONP
   1. Incubar ⁶⁸Ga-C-IONP en suero de ratón durante 30 min a 37 ° C (repetir 3 x). Después de ese tiempo, purificar las nanopartículas por ultrafiltración y medir la radiactividad presente en las nanopartículas y filtrado. Ninguna actividad debe ser detectada en los diferentes filtrados.
6. Relaxometría
   1. Medida longitudinal (T₁) y transversal (T₂) tiempos de relajación en un relaxometer a 1.5 T y 37 ° C. Cuatro diferentes concentraciones de ⁶⁸Ga-C-IONP (2 mM, 1 mM, 0.5 mM y 0,25 mM) se deben medir. Trama de tipos de relajación (r₁= 1/T₁, r₂= 1/T₂) contra la concentración de hierro. La pendiente de la curva obtenida representa valores de r₁ y r₂ .
7. Imágenes fantasmas Señor y PET
   1. Adquirir en situ Señor (T₁-weighted secuencia) e imágenes fantasmas de mascota para una serie de diluciones de ⁶⁸Ga-C-IONP (0 mM, 1 mM, 6.5 mM y 9,0 mM) para observar la señal creciente en correlación con la actividad de PET y MRI.

Resultados

⁶⁸ GA-C-IONP se sintetizaron mediante la combinación de FECLAS₃, ⁶⁸GaCl₃, ácido cítrico, agua, e hidrato de hidracina. Esta mezcla fue introducida en el microondas durante 10 minutos a 120 ° C y 240 W bajo presión controlada. Una vez que la muestra había enfriado a temperatura ambiente, las nanopartículas se purificaron por gel filtración para eliminar especies no reaccionadas (FECLAS₃, citrato, hidrato de hidracina) y libre d...

Discusión

Nanopartículas de óxido de hierro están un agente de contraste bien establecida para T₂-weighted MRI. Sin embargo, debido a los inconvenientes de este tipo de contraste para el diagnóstico de determinadas patologías, T₁-contraste ponderada o brillante es muchas veces preferible. Las nanopartículas presentadas no sólo superar estas limitaciones, ofreciendo contraste positivo en MRI pero también ofrecen una señal en una técnica de imagen funcional, como el PET, a través de ^68<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron (III) chloride hexahydrate	POCH	2317294
Citric acid, trisodium salt dihydrate 99%	Acros organics	227130010
Hydrazine hydrate	Aldrich	225819
Hydrochloric acid 37%	Fisher Scientific	10000180
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Aldrich	S9638
Disodium phosphate dibasic	Aldrich	S7907
Sodium chloride	Aldrich	746398
Sodium Azide	Aldrich	S2002
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	POCH	799200119
68Ga Chloride	ITG Isotope Technologies Garching GmbH, Germany	68Ge/68Ga generator system
Microwave	Anton Paar	Monowave 300
Centrifuge	Hettich	Universal 320
Size Exclusion columns	GE Healthcare	PD-10