Synthese von 68-Ga-Kern-dotierte Eisenoxid-Nanopartikeln für Dual Positronen-Emissions-Tomographie / (T1) Magnetic Resonance Imaging

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll erhalten⁶⁸Ga Kern-dotierte Eisenoxid-Nanopartikel über schnell Mikrowelle-driven Synthese. Die Methodik macht PET / (T₁) MRI Nanopartikel mit enzymatische Effizienz höher als 90 % und 99 % in einer 20-min-Synthese radiochemische Reinheit.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Mikrowelle Synthese um Eisenoxid-Nanopartikeln, die Kern-dotiert mit ⁶⁸Ga. Mikrowellen Technologie ermöglicht schnelle und reproduzierbare synthetische Verfahren zu erhalten. In diesem Fall ausgehend von FeCl₃ und Citrat Trinatrium Salz, Eisenoxid-Nanopartikeln beschichtet mit Zitronensäure in 10 min in der Mikrowelle gewonnen werden. Diese Nanopartikel präsentieren einen kleinen Kern von 4,2 ± 1,1 nm und eine hydrodynamische Größe 7,5 ± 2,1 nm. Darüber hinaus besitzen sie eine hohe längs-Relaxivity (R₁) Wert von 11,9 mM^-1·s^-1 und eine bescheidene transversalen Relaxivity Wert (R₂) 22,9 mM^-1·s^-1, führt zu einer geringen r₂ /R₁ -Verhältnis von 1,9. Diese Werte ermöglichen positive Kontrast-Generation in der Magnetresonanztomographie (MRT) statt negative dagegen häufig mit Eisenoxid-Nanopartikeln verwendet. Darüber hinaus, wenn ein ⁶⁸GaCl₃ Elution von einem ⁶⁸Ge /⁶⁸Ga Generator wird hinzugefügt, um die Ausgangsstoffe ergibt sich ein Nano-Radiotracer mit ⁶⁸Ga dotiert. Das Produkt erhält man mit einem hohen radiolabeling Ertrag (> 90 %), unabhängig von der ursprünglichen Aktivität verwendet. Darüber hinaus macht eine einzige Reinigungsstufe Nano-Radiomaterial bereit, verwendet in Vivozu sein.

Einleitung

Die Kombination von bildgebenden Verfahren für medizinische Zwecke hat die Suche nach verschiedenen Methoden zu synthetisieren, multimodaler Sonden^1,2,3ausgelöst. Aufgrund der Empfindlichkeit der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Scanner und die räumliche Auflösung der MRT scheinen PET/MRT-Kombinationen eine der attraktivsten Möglichkeiten, anatomische und funktionelle Informationen in der gleichen Zeit⁴sein. Im MRT T₂-gewichteten Sequenzen eingesetzt werden, Verdunkelung der Gewebe, in dem sie akkumulieren. T₁-gewichteten Sequenzen können auch verwendet werden, produzieren die Aufhellung der spezifischen Ansammlung Position⁵. Unter ihnen ist positiver Kontrast häufig die am besten geeignete Option, wie negativer Kontrast es viel schwieriger macht, Signal von endogenen Hypointense Bereiche, einschließlich derer oft präsentiert von Organen wie der Lunge⁶unterscheiden. Traditionell haben Gd-basierten molekularen Sonden eingesetzt worden, um positiven Kontrast zu erhalten. Gd-basierten Kontrastmitteln präsentieren jedoch einen großen Nachteil, nämlich ihrer Giftigkeit bei Patienten mit renaler Probleme^7,8,9ankommt. Dies hat motivierte Forschung bei der Synthese von biokompatiblen Materialien für den Einsatz als T₁ Kontrastmittel. Ein interessanter Ansatz ist die Verwendung von Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs), mit einem sehr kleinen Kern-Größe, die positiven Kontrast¹⁰bereitstellen. Aufgrund dieser extrem kleinen Kern (~ 2 nm), die meisten von der Fe^{3 +} -Ionen auf der Oberfläche, mit 5 ungepaarten Elektronen sind. Dies erhöht die longitudinale Relaxationszeit (R₁) Werte und viel geringeren Erträgen quer/längs (R₂/R₁) im Vergleich zu traditionellen IONPs, produziert das gewünschte Positive Verhältnisse Kontrast-¹¹.

IONPs mit einer Positronen-Emitter für Haustier zu verbinden, gibt es zwei wesentliche Aspekte zu berücksichtigen: Radioisotop Wahl und enzymatische Nanopartikel. In Bezug auf die erste Ausgabe ist ⁶⁸Ga eine verführerische Auswahl. Es hat eine relativ kurze Halbwertszeit (67,8 min). Seine Halbwertszeit ist geeignet für Peptid zu bezeichnen, da es gemeinsame Peptid Bioverteilung Zeiten entspricht. Darüber hinaus wird in einem Generator ermöglicht die Synthese in Bank-Modulen und Vermeidung der Notwendigkeit ein Zyklotron in der Nähe^{12,13,14 68}Ga produziert. Um die Nanopartikel Radiomarkierung, ist Oberfläche Kennzeichnung Radioisotop Einarbeitung die vorherrschende Strategie. Dies kann mit Hilfe ein Liganden, das ⁶⁸Ga zu bilden oder unter Ausnutzung der Affinität von Radiometal in Richtung zur Oberfläche der Nanopartikel. Die meisten Beispiele in der Literatur über IONPs verwenden ein Chelator. Es gibt Beispiele für die Verwendung von heterozyklische Liganden wie 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-Tetraacetic Säure (DOTA)¹⁵, 1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-Triacetic Säure (NOTA)^16,17und 1,4,7- Triazacyclononane, 1-Glutaric Acid-4,7-acetic Acid (NODAGA)¹⁸und die Verwendung von 2,3-Dicarboxypropane-1,1-Diphosphonic Säure (DPD), ein Tetradentate-Liganden- ¹⁹. Madru Et al. ²⁰ entwickelt ein Chelator-freie Strategie 2014 Label IONPs mit einem Chelator-freie Methode verwendet von einer anderen Gruppe nach hinten²¹.

Jedoch große Nachteile dieses Ansatzes beinhalten ein hohes Risiko für in Vivo Transmetallierungs-, niedrige Erträge enzymatische und langwierige Protokolle ungeeignet für kurzlebige Isotope^22,23,24. Aus diesem Grund, Wong Et al. ²⁵ entwickelt das erste Beispiel von Kern-dotierte Nanopartikeln, Geschäftsführer, ⁶⁴Cu im Kern des IONPs in einer 5-min-Synthese mit Mikrowellen-Technologie zu integrieren.

Hier beschreiben wir eine schnelle und effiziente Verfahren um das Radionuklid in den Kern der Nanopartikel enthalten entzieht viele der Nachteile von traditionellen Methoden vorgestellt. Zu diesem Zweck schlagen wir die Verwendung einer Mikrowelle-gesteuerte Synthese (MWS), die Reaktionszeiten erheblich reduziert, Erträge erhöht und verbessert die Reproduzierbarkeit, kritisch wichtige Parameter bei IONP Synthese. Die raffinierte Leistung des MWS ist aufgrund der dielektrischen Erwärmung: schnelle Probenerwärmung molekularer Dipole versuchen mit elektrischen Wechselfeld, als polare Lösungsmittel und Reagenzien für diese Art der Synthese effizienter ausrichten. Darüber hinaus führt die Verwendung von Zitronensäure als ein Tensid, zusammen mit Mikrowellen-Technologie, in extrem kleinen Nanopartikel, produzieren eine doppelte T-₁-gewichteten MRT/PET²⁶ Signal, hierin bezeichnet als ⁶⁸Ga Kern-dotierte Eisenoxid Nanopartikel (⁶⁸Ga-C-IONP).

Das Protokoll kombiniert die Verwendung von Mikrowellen-Technologie, ⁶⁸GaCl₃ als Positronen-Emitter, Eisen Chlorid, Natrium-Citrat und Hydrazinhydrat, was zu doppelten T₁-gewichteten MRT/PET nanopartikulären Material in kaum 20 Minuten. Darüber hinaus liefert konsistente Ergebnisse über einen Bereich von ⁶⁸Ga-Aktivitäten (37 MBq, 111 MBq 370 MBq und 1110 MBq) ohne erhebliche Auswirkungen auf die wichtigsten physikalisch-chemischen Eigenschaften der Nanopartikel. Die Reproduzierbarkeit der Methode mit hoher ⁶⁸Ga Aktivitäten erstreckt sich das Feld der möglichen Anwendungen, einschließlich große Tiermodellen oder Studien am Menschen. Darüber hinaus gibt es eine einzige Reinigungsstufe in das Verfahren einbezogen. Dabei werden kostenlose Gallium übersteigen Eisen Chlorid, Natrium-Citrat und Hydrazinhydrat durch Gel Filtration entfernt. Total freie Isotop Beseitigung und die Reinheit der Probe keine Toxizität sicherzustellen und verbessern Bildbearbeitung Auflösung. In der Vergangenheit haben wir bereits die Nützlichkeit dieses Ansatzes in gezielte molekulare Bildgebung^27,28gezeigt.

Protokoll

(1) Reagenz Vorbereitung

1. 0,05 M HCl
   1. Vorbereiten von 0,05 M HCl durch Zugabe von 208 µL 37 % HCl in 50 mL destilliertem Wasser.
2. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie eluent
   1. Bereiten Sie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Eluent durch Auflösen von 6,9 g Natrium Dihydrogen Phosphat-Monohydrat, 7,1 g Binatrium Wasserstoff Phosphat, 8,7 g Natriumchlorid und 0,7 g Natriumazid in 1 L Wasser vor. Gut mischen und den pH-Wert zu überprüfen. Der Eluent durch eine 0,1 µm cutoff Sterilfilter passieren und degas vor Gebrauch. Akzeptanz-Bereich: pH 6.2-7,0 (wenn nicht, stellen Sie mit [1 M] NaOH oder HCl [5 M]).

2. Synthese von Citrat-beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln

1. FeCl₃·6H₂O 75 mg und 80 mg Zitronensäure Trinatrium Salz Dihydrat in 9 mL Wasser auflösen.
   Hinweis: Diese Mengen liefern 12 mL abschließende gereinigte Nanopartikel ([Fe] ~1.4 Mg·mL^-1). Mengen können zu einem Endvolumen von 2,5 mL verkleinert werden.
2. Setzen Sie die Mischung in die Mikrowelle angepasst Kolben.
3. Laden Sie ein dynamisches Protokoll in der Mikrowelle. Stellen Sie die Temperatur auf 120 ° C, die Zeit, 10 min, Druck bis 250 Psi und die Kraft bis 240 w.
4. Fügen Sie 1 mL Hydrazinhydrat zur Reaktion.
   Hinweis: Hydrazinhydrat startet Eisen Reduktion. Daher wird eine Veränderung des Aussehens der Lösung von hellgelb bis braun, beobachtet.
5. Die Mikrowelle-Protokoll zu starten.
6. Unterdessen spülen Sie eine Gel Filtration Entsalzung Spalte mit 20 mL destilliertem Wasser.
7. Sobald das Protokoll beendet hat, erlauben Sie die Flasche bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
8. Pipette 2,5 mL der endgültige Mischung auf die Säule und die Durchströmung zu verwerfen.
   Hinweis: Die Mikrowelle stoppt das Protokoll bei 60 ° C; die Nanopartikel können hinzugefügt werden, direkt auf dem Gel Filtration Spalte bei 60 ° C.
9. Die Spalte 3 mL destilliertes Wasser hinzu und sammeln Sie die Nanopartikel in einer Glasflasche.
   Hinweis: Nanopartikel können für 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. Nach dieser Zeit erscheint Nanopartikel Aggregation, deren hydrodynamischen vergrößern.

3. Synthese von ⁶⁸-Ga-Kern-dotierte Eisenoxid-Nanopartikeln (⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Die Mikrowelle angepasst Kolben FeCl₃·6H₂O 75 mg und 80 mg Zitronensäure Trinatrium Salz Dihydrat umgesetzt.
2. Eluieren ⁶⁸Ge /⁶⁸Ga Generator mit der empfohlenen Menge und Konzentration der HCl, nach Angaben des Herstellers (in unserem Fall 4 mL 0,05 M HCl). Nach der Injektion von diesem Volume im Generator selbst abgeschirmt ist (4 mL) ⁶⁸GaCl₃ erhaltenen, gebrauchsfertig ohne weitere Verarbeitung.
   Hinweis: Befolgen Sie die entsprechenden Radioaktivität Sicherheitsmaßnahmen für die Schritte 3.2-3.12. ⁶⁸ GA ist ein Positron und Gamma-Strahler-Isotop. Der Einsatz von geeigneten Sicherheitsmaßnahmen Strahlenbelastung durch den Betreiber zu vermeiden ist entscheidend. Forscher müssen eine ALARA (so niedrig wie vernünftigerweise erreichbar) Protokoll mit typischen Abschirmung und Radionuklid-Behandlung Verfahren folgen. Darüber hinaus ist die Verwendung von einem Ring, Körper Abzeichen und eine Kontamination Detektor obligatorisch.
3. Die Mikrowelle angepasst Kolben 4 mL ⁶⁸GaCl₃ hinzufügen. Dieses Volumen kann kleiner, abhängig von der Generator-Aktivität und gewünschte endgültige Nanopartikel sein.
4. Pipette 5 mL destilliertem Wasser in die Flasche und gut mischen.
5. Laden Sie ein dynamisches Protokoll in der Mikrowelle. Stellen Sie die Temperatur auf 120 ° C, die Zeit, 10 min, Druck bis 250 Psi und die Kraft bis 240 w.
6. Fügen Sie 1 mL Hydrazinhydrat zur Reaktion.
   Hinweis: Hydrazinhydrat startet Eisen Reduktion. Daher wird eine Veränderung des Aussehens der Lösung von hellgelb bis braun, beobachtet.
7. Die Mikrowelle-Protokoll zu starten.
8. Unterdessen spülen Sie eine Gel Filtration Entsalzung Spalte mit 20 mL destilliertem Wasser.
9. Sobald das Protokoll beendet hat, erlauben Sie die Flasche bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
10. Pipette 2,5 mL der endgültige Mischung auf die Säule und die Durchströmung zu verwerfen.
    Hinweis: Die Mikrowelle stoppt das Protokoll bei 60 ° C; die Nanopartikel können die Gel-Filtration-Spalte bei 60 ° c direkt hinzugefügt werden
11. Die Spalte 3 mL destilliertes Wasser hinzu und sammeln Sie die Nanopartikel in einer Glasflasche.
12. Enzymatische Effizienz mit einem NaI-Brunnen-Typ-Detektor zu berechnen. Dieser Parameter in der Regel misst die Aktivität des ⁶⁸Ga integriert in der Reaktion. Nach Kunststoff und Reinigung Prozesse ist die Aktivität der gereinigten Probe gemessen. Wegen der kurzen Halbwertszeit von ⁶⁸Ga hat die erste Aktivität zum Zeitpunkt (t) korrigiert werden. Normierung mit der Zeit folgt die standard-Gleichung:
    N_T = N₀ · e^-λt
    Hier,
    N_T: zählt zur Zeit (t)
    N₀: zählt zur Zeit (t) = 0
    Λ: Verfall konstante
    t: verstrichene Zeit
    
    Hinweis: Enzymatische Effizienz sollte zwischen 90-95 %.

4. Analyse der ⁶⁸-Ga-Kern-dotierte Eisenoxid-Nanopartikeln (⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Dynamische Lichtstreuung
   1. Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung (DLS), um die hydrodynamischen Größe ⁶⁸Ga-C-IONP messen. Pipette 60 µL der Probe in eine Küvette und drei Messungen pro Probe durchführen. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, sollte dies mit mehreren Nanopartikel Chargen wiederholt werden.
2. Kolloidale Stabilität
   1. Beurteilen die kolloidale Stabilität des ⁶⁸Ga-C-IONP durch Messung der hydrodynamischen Größe der Probe nach der Inkubation in verschiedenen Puffern (PBS, Saline und Maus Serum) für unterschiedliche Tageszeiten, 500 µL der Probe in den einzelnen Puffern bei 37 inkubieren von 0 bis 24 h. ° C. Bei den ausgewählten Zeiten nehmen 60-µL-Aliquots und pipette sie in DLS-Küvetten, deren hydrodynamische Größe zu messen.
3. Elektronenmikroskopie
   1. Analysieren Sie die Kern-Größe ⁶⁸Ga-C-IONP mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und ringförmige dunkel-Bereich Imaging (STEM-HAADF) (Ref TEM Protokoll: NIST - NCL gemeinsame Assay-Protokoll, PCC-X, messen die Größe der Nanopartikel mittels Übertragung Elektron Microscopy).
4. Gel Filtration Radio-Chromatogramm
   1. Fraktionieren Sie der Elution in 500 µL Aliquots während der Gel-Filtration Reinigungsschritt und Messen Sie die Radioaktivität vorhanden, jeweils mit einer Activimeter; wodurch eine Gel-Filtration-Chromatogramm.
5. Radiochemische Stabilität von ⁶⁸Ga-C-IONP
   1. ⁶⁸Ga-C-IONP im Maus-Serum für 30 min bei 37 ° C inkubieren (3 X wiederholen). Nach Ablauf dieser Frist reinigen Sie die Nanopartikel durch Ultrafiltration zu und Messen Sie die Radioaktivität in der Nanopartikel und Filtrat. Keine Aktivitäten sollten in den verschiedenen Filtrate erkannt werden.
6. Relaxometrie
   1. Messen Sie längs (T₁) und quer (T₂) Relaxationszeiten in ein Relaxometer bei 1,5 T und 37 ° C. Vier verschiedene Konzentrationen von ⁶⁸Ga-C-IONP (2 mM, 1 mM, 0,5 mM und 0,25 mM) sollte gemessen werden. Plot-Entspannung-Preise (R₁= 1/T₁, R₂= 1/T₂) gegen Eisen-Konzentration. Die Steigung der Kurve erreicht wird R₁ und R₂ Werte gerendert.
7. Mr- und PET phantom Bilder
   1. In Situ Herr erwerben (T₁-gewichteten Sequenz) und PET-phantom-Bildern für eine Reihe von Verdünnungen von ⁶⁸Ga-C-IONP (0 mM, 1 mM, 6,5 mM und 9,0 mM), das zunehmende Signal in Korrelation mit der Aktivität PET und MRT zu beobachten.

Ergebnisse

⁶⁸ GA-C-IONP wurden durch die Kombination von FeCl₃, ⁶⁸GaCl₃, Zitronensäure, Wasser, synthetisiert und Hydrazin Hydrat. Diese Mischung wurde in der Mikrowelle für 10 min bei 120 ° C und 240 W unter kontrollierten Druck eingeführt. Sobald die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt hatte, wurden die Nanopartikel gereinigt durch Gel Filtration zu beseitigen nicht umgesetzte Arten (FeCl₃, Citrat, Hydrazinhydrat) und freie ⁶⁸Ga...

Diskussion

Eisenoxid-Nanopartikeln sind eine gut etablierte Kontrastmittel für T₂-gewichteten MRT. Aufgrund der Nachteile dieser Art von Kontrast für die Diagnose von bestimmten Krankheiten, T₁-gewichtete oder hellen Kontrast wird oft bevorzugt. Die hier vorgestellten Nanopartikel nicht nur diese Grenzen überwinden, durch das Angebot positiver Kontrast im MRT, sondern bieten auch eine Signal in eine funktionell bildgebendes Verfahren wie PET, über ⁶⁸Ga Einbindung in ihrem Kern. Mikrowel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron (III) chloride hexahydrate	POCH	2317294
Citric acid, trisodium salt dihydrate 99%	Acros organics	227130010
Hydrazine hydrate	Aldrich	225819
Hydrochloric acid 37%	Fisher Scientific	10000180
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Aldrich	S9638
Disodium phosphate dibasic	Aldrich	S7907
Sodium chloride	Aldrich	746398
Sodium Azide	Aldrich	S2002
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	POCH	799200119
68Ga Chloride	ITG Isotope Technologies Garching GmbH, Germany	68Ge/68Ga generator system
Microwave	Anton Paar	Monowave 300
Centrifuge	Hettich	Universal 320
Size Exclusion columns	GE Healthcare	PD-10