Síntese de nanopartículas de núcleo dopado com óxido de ferro Ga 68para tomografia por emissão de pósitrons Dual/imagem latente de ressonância magnética de (T1)

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter⁶⁸Ga núcleo dopado com óxido de ferro nanopartículas através de rápido orientado para o microondas síntese. A metodologia processa PET/nanopartículas de MRI (T₁) com eficiência superior a 90% e a pureza radioquímica de 99% em uma síntese de 20 min de radioativos.

Resumo

Aqui, descrevemos uma síntese de microondas para obter nanopartículas de óxido de ferro, núcleo-dopado com ⁶⁸ga. microondas tecnologia permite rápido e reprodutíveis procedimentos sintéticos. Neste caso, a partir de FeCl₃ e citrato trissódico sal, nanopartículas de óxido de ferro revestidas com ácido cítrico são obtidas em 10 min no microondas. Essas nanopartículas apresentam um pequeno núcleo de 4,2 ± 1,1 nm e um tamanho hidrodinâmico de 7,5 ± 2,1 nm. Além disso, eles têm um valor de alta relaxivity longitudinal (r₁) de 11,9 mM^-1·s^-1 e um valor modesto relaxivity transversal (r₂) de 22,9 mM^-1·s^-1, resulta em um baixo r₂ /r₁ proporção de 1,9. Estes valores permitem geração de contraste positivo na ressonância magnética (RM) em vez de contraste negativo, geralmente usado com nanopartículas de óxido de ferro. Além disso, se uma eluição ⁶⁸GaCl₃ de um ⁶⁸Ge /⁶⁸gerador de Ga é adicionado para as matérias-primas, um nano-radiotracer dopado com ⁶⁸Ga é obtido. O produto é obtido com um radiolabeling de alto rendimento (> 90%), independentemente da atividade inicial utilizada. Além disso, uma etapa de purificação único processa o nano-radiomaterial pronto para ser usado na vivo.

Introdução

A combinação de técnicas de imagem para fins médicos provocou a busca de métodos diferentes sintetizar multimodal sondas^1,2,3. Devido a sensibilidade dos scanners de tomografia por emissão de pósitrons (PET) e a resolução espacial de MRI, combinações de PET/RM parecem ser uma das possibilidades mais atraentes, fornecendo informações anatômicas e funcionais no mesmo tempo⁴. No MRI, T₂-sequências ponderadas podem ser usados, escurecimento dos tecidos em que se acumulam. T₁-sequências ponderadas também podem ser utilizadas, produzindo a iluminação do local específico de acumulação⁵. Entre eles, o contraste positivo é, muitas vezes, a opção mais adequada, como contraste negativo torna muito mais difícil de diferenciar o sinal de áreas hypointense endógenos, incluindo aqueles com frequência são apresentados por órgãos como os pulmões,⁶. Tradicionalmente, baseado em Gd sondas moleculares têm sido empregadas para obter contraste positivo. No entanto, agentes de contraste baseados em Gd apresentam uma grande desvantagem, ou seja, sua toxicidade, que é crítica em pacientes com problemas renais^7,8,9. Isto tem motivada pesquisas na síntese de materiais biocompatíveis para a sua utilização como agentes de contraste de₁ T. Uma abordagem interessante é a utilização de nanopartículas de óxido de ferro (IONPs), com um tamanho extremamente pequeno núcleo, que fornecem contraste positivo¹⁰. Devido a este núcleo extremamente pequeno (~ 2 nm), a maioria de Fe^{3 +} íons estão na superfície, com 5 elétrons unpaired cada. Isto aumenta o tempo de relaxamento longitudinal (r₁) valores e rendimentos muito inferior longitudinal/transversal (r₂/r₁) proporções em relação ao tradicionais IONPs, produzindo o desejado positivo contraste,¹¹.

Para combinar IONPs com um emissor de pósitrons para animal de estimação, há duas questões fundamentais a ter em conta: eleição de radioisótopos e nanopartículas radioativos. Quanto à primeira questão, ⁶⁸Ga é uma opção atraente. Tem uma meia-vida relativamente curta (67,8 min). Sua meia-vida é adequado para a rotulagem de peptídeo desde que combina com tempos de biodistribuição peptídeo comum. Além disso, ⁶⁸Ga é produzido em um gerador, permitindo a síntese em módulos de banco e evitando a necessidade de um ciclotron nas proximidades de^12,13,14. A fim de radiolabel as nanopartículas, incorporação de radioisótopos de superfície-rotulagem é a estratégia predominante. Isso pode ser feito usando um ligante que quelatos ⁶⁸Ga ou aproveitando-se da afinidade do radiometal em direção a superfície da nanopartículas. A maioria dos exemplos na literatura relativa IONPs usar um quelante. Há exemplos do uso de ligantes heterocíclicos como 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)¹⁵, 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic ácido (NOTA)^16,17e 1,4,7- triazacyclononane, 1-glutárico ácido-4,7 ácido acético (NODAGA)¹⁸e o uso de ácido 2,3-dicarboxypropane-1,1-comerciais (DPD), um ligante de tetradentate ¹⁹. Madru et al ²⁰ desenvolveu um quelante livre estratégia em 2014 a etiqueta IONPs usando um método livre de quelante usado por outro grupo, posteriormente,²¹.

No entanto, grandes desvantagens desta abordagem incluem um alto risco de transmetalação na vivo , baixos rendimentos radioativos e longos protocolos impróprios para isótopos de curta duração^22,23,24. Por esta razão, Wong et al . ²⁵ desenvolveu o primeiro exemplo de nanopartículas de núcleo-dopado, gerenciando a incorporar ⁶⁴Cu no núcleo dos IONPs em uma síntese de 5-min usando a tecnologia de microondas.

Aqui, descrevemos um procedimento rápido e eficiente para incorporar o radionuclídeo para o núcleo da nanopartículas, iludindo muitos dos inconvenientes apresentados pelos métodos tradicionais. Para tal, propomos a utilização de uma síntese orientada por microondas (MWS), que reduz consideravelmente os tempos de reação, aumenta o rendimento e aumenta a reprodutibilidade, parâmetros criticamente importantes na síntese IONP. O desempenho refinado do MWS é devido ao aquecimento dieléctrico: amostra rápida aquecimento como dipolos moleculares tentam alinhar com o campo elétrico alternado, sendo mais eficiente para este tipo de síntese de reagentes e solventes polares. Além disso, o uso de ácido cítrico como tensoativo, juntamente com a tecnologia de microondas, resulta em nanopartículas extremamente pequenas, produzindo um duplo T₁-ponderado sinal de²⁶ MRI/PET, aqui denotado como ⁶⁸núcleo Ga-dopado com óxido de ferro nanopartículas (⁶⁸Ga-C-IONP).

O protocolo combina o uso da tecnologia de microondas, ⁶⁸GaCl₃ como emissor de pósitrons, citrato de sódio, cloreto de ferro e hidrato de hidrazina, resultando em duplo T₁-ponderada material nanoparticulares de MRI/PET em quase 20 min. Além disso, que produz resultados consistentes em uma faixa de ⁶⁸atividades Ga (37 MBq, 111 MBq, 370 MBq e 1110 MBq) sem efeitos significativos sobre as principais propriedades físico-químicas das nanopartículas. A reprodutibilidade do método usando alta ⁶⁸Ga atividades estende o campo de aplicações possíveis, incluindo modelos animais grandes ou estudos em seres humanos. Além disso, há uma etapa de purificação única incluída no método. No processo, qualquer excesso de enciclopédia gálio, hidrato de hidrazina, citrato de sódio e cloreto de ferro são removidos por filtração em gel. Eliminação total de isótopo livre e a pureza da amostra não garantir nenhuma toxicidade e aumentar a resolução de imagem. No passado, já demonstrámos a utilidade desta abordagem no alvo molecular da imagem latente de^27,28.

Protocolo

1. preparação do reagente

1. HCl 0,05 M
   1. Prepare-se 0,05 M HCl adicionando µ l 208 de 37% HCl a 50 mL de água destilada.
2. Eluente de cromatografia líquida de alta eficiência
   1. Prepare-se cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) eluente dissolvendo 6,9 g de sódio dihidrogeno fosfato mono-hidratado, 7,1 g de hidrogenofosfato dissódico, 8,7 g de cloreto de sódio e 0,7 g de azida de sódio em 1 litro de água. Misture bem e verifique o pH. Passe o eluente através de um filtro estéril corte de 0,1 µm e desgaseificar antes do uso. Intervalo de aceitação: pH 6,2-7,0 (se não, ajustar com NaOH [1 M] ou [5m] de HCl).

2. síntese de nanopartículas de óxido de ferro revestido de citrato

1. Dissolva 75 mg de FeCl₃·6H₂O e 80 mg de ácido cítrico trissódico dihidratado sal em 9 mL de água.
   Nota: Estas quantidades fornecem 12 mL de nanopartículas purificadas finais ([Fe] ~1.4 mg·mL^-1). As quantidades podem ser escaladas para baixo para obter um volume final de 2,5 mL.
2. Coloque a mistura no recipiente de microondas-adaptado.
3. Carrega um protocolo dinâmico no microondas. Definir a temperatura de 120 ° C, o tempo de 10 min, a pressão de 250 psi e o poder de 240 w.
4. Adicione 1 mL de hidrato de hidrazina para a reação.
   Nota: Hidrato de hidrazina inicia redução de ferro. Portanto, uma mudança na aparência da solução, do amarelo claro ao marrom, é observada.
5. Inicie o protocolo de microondas.
6. Enquanto isso, lave uma coluna do desalting filtração de gel com 20 mL de água destilada.
7. Quando tiver terminado o protocolo, permitir que o balão arrefecer à temperatura ambiente.
8. Pipetar 2,5 mL da mistura final para a coluna e descartar o escoamento.
   Nota: O microondas para o protocolo a 60 ° C; as nanopartículas podem ser adicionadas diretamente à coluna de filtração de gel a 60 ° C.
9. Adicionar 3 mL de água destilada à coluna e coletar as nanopartículas em um frasco de vidro.
   Nota: Nanopartículas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante 1 semana. Após este tempo, agregação de nanopartículas aparece, aumentando seu tamanho hidrodinâmico.

3. síntese de nanopartículas de óxido de ferro dopado com núcleo Ga ⁶⁸(⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Coloque 75 mg de FeCl₃·6H₂O e 80 mg de ácido cítrico trissódico dihidratado sal para o balão de microondas-adaptado.
2. Eluir a ⁶⁸Ge / gerador de⁶⁸Ga usando o volume recomendado e a concentração de HCl, de acordo com o fornecedor (no nosso caso, 4 mL de 0,05 M de HCl). Após a injeção do volume no gerador autoprotegido, (4 mL) ⁶⁸GaCl₃ é obtido, pronta para uso sem processamento adicional.
   Nota: Siga as medidas de segurança de radioatividade correspondente para etapas 3.2-3.12. ⁶⁸ GA é um isótopo de emissor de pósitrons e raios gama. A utilização das medidas de segurança adequadas para evitar a exposição à radiação pelo operador é crucial. Os investigadores devem seguir um protocolo ALARA (tão baixo quanto razoavelmente possível) usando blindagem típica e procedimentos de manipulação de radionuclídeos. Além disso, o uso de um anel, emblemas do corpo e um detector de contaminação é obrigatório.
3. Adicione 4 mL de ⁶⁸GaCl₃ no balão de microondas-adaptado. Este volume pode ser menor, dependendo da atividade do gerador e atividade desejada de nanopartículas finais.
4. Pipetar 5 mL de água destilada para o frasco e misture bem.
5. Carrega um protocolo dinâmico no microondas. Definir a temperatura de 120 ° C, o tempo de 10 min, a pressão de 250 psi e o poder de 240 w.
6. Adicione 1 mL de hidrato de hidrazina para a reação.
   Nota: Hidrato de hidrazina inicia redução de ferro. Portanto, uma mudança na aparência da solução, do amarelo claro ao marrom, é observada.
7. Inicie o protocolo de microondas.
8. Enquanto isso, lave uma coluna do desalting filtração de gel com 20 mL de água destilada.
9. Quando tiver terminado o protocolo, permitir que o balão arrefecer à temperatura ambiente.
10. Pipetar 2,5 mL da mistura final para a coluna e descartar o escoamento.
    Nota: O microondas para o protocolo a 60 ° C; as nanopartículas podem ser adicionadas diretamente à coluna de filtração de gel a 60 ° C.
11. Adicionar 3 mL de água destilada à coluna e coletar as nanopartículas em um frasco de vidro.
12. Calcule a eficiência radioativos usando um detector de poço-tipo NaI. Este parâmetro normalmente mede a atividade da ⁶⁸Ga incorporado na reação. Após processos sintéticos e purificação, a atividade da amostra purificada é medida. Por causa da meia-vida curta de ⁶⁸Ga, a atividade inicial tem de ser corrigida no tempo (t). Normalização com tempo segue a equação padrão:
    N_T = N₀ · e^-λt
    Aqui,
    N._T: conta no tempo (t)
    N₀: conta no tempo (t) = 0
    Λ: constante de decaimento
    t: tempo transcorrido
    
    Nota: Radioativos eficiência devem estar entre 90% - 95%.

4. análise de nanopartículas de óxido de ferro dopado com núcleo Ga ⁶⁸(⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Difusão dinâmica da luz
   1. Use Difusão dinâmica da luz (DLS) para medir o tamanho hidrodinâmico de ⁶⁸Ga-C-IONP. Pipetar 60 µ l de amostra uma cubeta e executar três medições de tamanho, por exemplo. Para garantir a reprodutibilidade, isto deve ser repetido com vários lotes de nanopartículas.
2. Estabilidade coloidal
   1. Avaliar a estabilidade coloidal de ⁶⁸Ga-C-IONP, medindo o tamanho hidrodinâmico da amostra após incubação em buffers diferentes (PBS, soro fisiológico e soro de rato) por vezes diferentes, variando de 0 a 24 h. Incubar a 500 µ l da amostra em cada buffer em 37 ° C. No selecionado vezes, tome alíquotas de 60 µ l e pipetá-los para cubetas DLS para medir seu tamanho hidrodinâmico.
3. Microscopia eletrônica
   1. Analisar o tamanho do núcleo de ⁶⁸Ga-C-IONP usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e imagem de campo escuro anular (tronco-HAADF) (ref protocolo TEM: NIST - NCL conjunta protocolo do ensaio, PCC-X, medindo o tamanho de nanopartículas utilizando transmissão eletrônica Microscopia).
4. Rádio-cromatograma do gel filtração
   1. Fracionar a eluição em alíquotas de 500 µ l durante a etapa de purificação do gel-filtração e medir a radioatividade presente em cada um usando um activimeter; tornando assim, um cromatograma do gel de filtração.
5. Estabilidade de radioquímica de ⁶⁸Ga-C-IONP
   1. Incube ⁶⁸Ga-C-IONP no soro de rato por 30 min a 37 ° C (repete 3x). Após esse tempo, purificar as nanopartículas por ultrafiltração e medir a radioatividade presente nas nanopartículas e filtrado. Deve ser detectada nenhuma atividade em diferentes filtrados.
6. Em materiais
   1. Medir longitudinal (T₁) transversal (T₂) tempos de relaxamento em um relaxometer em 1.5 T e 37 ° C. Quatro diferentes concentrações de ⁶⁸Ga-C-IONP (2 mM, 1 mM, 0.5 mM e 0,25 mM) devem ser medidas. Plotar taxas de relaxamento (r₁= 1/T₁, r₂= 1/T₂) contra a concentração de ferro. O declive da curva obtida processa valores r₁ e r₂ .
7. Sr. e PET imagens fantasmas
   1. Adquirir em situ senhor (T₁-ponderada a sequência) e imagens fantasmas de PET para uma série de diluições de ⁶⁸Ga-C-IONP (0 mM, 1mm, 6,5 mM e 9,0 mM) para observar o sinal de crescente em correlação com a atividade de PET e MRI.

Resultados

⁶⁸ GA-C-IONP foram sintetizados pela combinação de FeCl₃, ⁶⁸GaCl₃, ácido cítrico, água, e hidrato de hidrazina. Esta mistura foi introduzida no microondas durante 10 minutos a 120 ° C e 240 W sob pressão controlada. Uma vez que a amostra tinha arrefecido à temperatura ambiente, as nanopartículas foram purificadas por gel filtração para eliminar as espécies não tenha reagidos (FeCl₃, citrato, hidrato de hidrazina) e livre ...

Discussão

Nanopartículas de óxido de ferro são um agente de contraste bem estabelecida para T₂-weighted MRI. No entanto, devido as desvantagens deste tipo de contraste para o diagnóstico de determinadas patologias, T₁-ponderada ou brilhante contraste é muitas vezes preferido. As nanopartículas aqui apresentadas não só superar essas limitações, oferecendo o contraste positivo no MRI, mas também oferecem um sinal em uma técnica de imagem funcional, tais como PET, através de ⁶⁸in...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron (III) chloride hexahydrate	POCH	2317294
Citric acid, trisodium salt dihydrate 99%	Acros organics	227130010
Hydrazine hydrate	Aldrich	225819
Hydrochloric acid 37%	Fisher Scientific	10000180
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Aldrich	S9638
Disodium phosphate dibasic	Aldrich	S7907
Sodium chloride	Aldrich	746398
Sodium Azide	Aldrich	S2002
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	POCH	799200119
68Ga Chloride	ITG Isotope Technologies Garching GmbH, Germany	68Ge/68Ga generator system
Microwave	Anton Paar	Monowave 300
Centrifuge	Hettich	Universal 320
Size Exclusion columns	GE Healthcare	PD-10