Sintesi di nanoparticelle Core-drogati di ossido di ferro di 68Ga per Dual tomografia a emissione di positroni/Imaging di risonanza magnetica (T1)

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere⁶⁸Ga ossido drogato con nucleo di ferro via veloce a microonde-driven sintesi di nanoparticelle. La metodologia rende PET / (T₁) MRI nanoparticelle con efficienza superiore al 90% e purezza radiochimica del 99% in una sintesi di 20 min di radiolabeling.

Abstract

Qui, descriviamo una sintesi a microonde per ottenere nanoparticelle di ossido di ferro nucleo-drogato con ⁶⁸GA. forno a microonde tecnologia consente veloce e riproducibile procedure sintetiche. In questo caso, a partire da citrato trisodico sale, nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con acido citrico sono ottenute in 10 min in forno a microonde e FeCl₃ . Queste nanoparticelle presentano una dimensione di piccolo nucleo di 4,2 ± 1,1 nm e una dimensione di idrodinamica di 7,5 ± 2.1 nm. Inoltre, essi hanno un valore alto relaxivity longitudinale (r₁) 11,9 mM^-1p^-1 e un valore modesto relaxivity trasversale (r₂) di 22,9 mM^-1p^-1, che si traduce in un basso r₂ /r₁ rapporto di 1,9. Questi valori abilitare la generazione di contrasto positivo nell'imaging a risonanza magnetica (MRI) invece di contrasto negativo, comunemente utilizzato con nanoparticelle di ossido di ferro. Inoltre, se un'eluizione ⁶⁸GaCl₃ da un ⁶⁸Ge / generatore di⁶⁸Ga viene aggiunto i materiali di partenza, si ottiene un nano-radiotraccitore drogato con ⁶⁸Ga. Il prodotto è ottenuto con un alto rendimento radiolabeling (> 90%), indipendentemente dall'attività iniziale utilizzato. Inoltre, una fase di purificazione singolo rende il nano-radiomaterial pronto per essere usato in vivo.

Introduzione

La combinazione di tecniche di imaging per scopi medici ha innescato la ricerca di diversi metodi per sintetizzare multimodale sonde^1,2,3. A causa della sensibilità di scanner per tomografia a emissione di positroni (PET) e la risoluzione spaziale di MRI, PET/MRI combinazioni sembrano essere una delle più attraenti possibilità, fornire informazioni anatomiche e funzionali allo stesso tempo⁴. In MRI, T₂-sequenze ponderati possono essere utilizzati, oscurando i tessuti in cui si accumulano. T₁-ponderate sequenze possono anche essere utilizzati, producendo la brillantatura delle specifiche accumulo posizione⁵. Tra questi, contrasto positivo è spesso l'opzione più adeguata, come contrasto negativo lo rende molto più difficile da differenziare il segnale proveniente da aree ipointense endogeno, compresi quelli spesso presentato da organi come i polmoni⁶. Tradizionalmente, sonde molecolari basati su Gd sono state impiegate per ottenere il contrasto positivo. Tuttavia, gli agenti di contrasto a base di Gd presenti un grave inconveniente, vale a dire la loro tossicità, che è fondamentale nei pazienti con problemi renali^7,8,9. Questo ha motivato ricerca nella sintesi di materiali biocompatibili per il loro uso come agenti di contrasto di₁ T. Un approccio interessante è l'uso di nanoparticelle dell'ossido di ferro (IONPs), con una dimensione estremamente piccolo nucleo, che forniscono il contrasto positivo¹⁰. A causa di questo nucleo estremamente piccolo (~ 2 nm), la maggior parte del Fe^{3 +} gli ioni sono sulla superficie, con 5 elettroni spaiati. Questo aumenta il tempo di rilassamento longitudinale (r₁) valori e rese molto più basso trasversale/longitudinale (r₂/r₁) rapporti rispetto ai tradizionali IONPs, producendo il positivo desiderato ¹¹il contrasto.

Per combinare IONPs con un emettitore di positroni per animale domestico, ci sono due questioni chiave per prendere in considerazione: elezione del radioisotopo e nanoparticelle radiolabeling. Per quanto riguarda il primo problema, ⁶⁸Ga è una scelta allettante. Ha un'emivita relativamente breve (67,8 min). La sua emivita è adatto per l'etichettatura del peptide poiché corrisponde a tempi di biodistribuzione del peptide comuni. Inoltre, ⁶⁸Ga è prodotto in un generatore, consentendo la sintesi in moduli di panca ed evitando la necessità di un ciclotrone è vicino a^12,13,14. Al fine di medicinali nanoparticella, superficie-etichettatura incorporazione del radioisotopo è la strategia prevalente. Questo può essere fatto utilizzando un legante che chelati ⁶⁸Ga o approfittando dell'affinità di radiometal verso la superficie della nanoparticella. Maggior parte degli esempi nella letteratura riguardo IONPs utilizzare un chelante. Ci sono esempi dell'uso di ligandi eterociclici come 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacetico acido (DOTA)¹⁵, 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-bioconjugate acido (NOTA)^16,17e 1,4,7- triazacyclononane, 1-glutarico acido-4,7-acetico (NODAGA)¹⁸e l'uso di acido 2,3-dicarboxypropane-1,1-diphosphonic (DPD), un ligando di tetradentato ¹⁹. Madru et al. ²⁰ si sono sviluppati un chelante-free strategia nel 2014 per etichetta IONPs utilizzando un metodo privo di chelante utilizzato da un altro gruppo posteriorly²¹.

Tuttavia, svantaggi principali di questo approccio includono un alto rischio di in vivo Transmetallazione, basso radiolabeling rendimenti e lunghe protocolli inadatti per gli isotopi di breve durata^22,23,24. Per questo motivo, Wong et al. ²⁵ ha sviluppato il primo esempio di nanoparticelle core-drogati, riuscendo a incorporare ⁶⁴Cu nel nucleo di IONPs in una sintesi di 5-min utilizzando la tecnologia a microonde.

Qui, descriviamo una procedura rapida ed efficiente per incorporare il radionuclide nel nucleo della nanoparticella, eludendo molti degli svantaggi presentati dai metodi tradizionali. A tal fine, proponiamo l'uso di una sintesi a microonde-driven (MWS), che riduce notevolmente i tempi di reazione, aumenta i rendimenti e migliora la riproducibilità, parametri criticamente importanti nella sintesi IONP. Prestazioni raffinate di MWS sono dovuto riscaldamento dielettrico: campione rapido riscaldamento come dipoli molecolari tenta di allineare con il campo elettrico alternato, essendo polare solventi e reagenti più efficienti per questo tipo di sintesi. Inoltre, l'uso di acido citrico come un tensioattivo, insieme con tecnologia a microonde, si traduce in nanoparticelle estremamente piccole, producendo una doppia T₁-ponderata segnale di²⁶ MRI / dell'animale domestico, qui indicato come ossido di ferro ⁶⁸Ga Core-drogati nanoparticelle (⁶⁸Ga-C-IONP).

Il protocollo combina l'uso di tecnologia di microonda, ⁶⁸GaCl₃ come emettitore di positroni, cloruro ferroso, citrato di sodio e idrato di idrazina, con conseguente doppia T₁-weighted MRI/materiale nanoparticolato in appena 20 min. Inoltre, produce risultati costanti sopra una gamma di ⁶⁸attività Ga (37 MBq, 111 MBq, 370 MBq e 1110 MBq) con nessun effetto significativo sulle proprietà fisico-chimiche principali delle nanoparticelle. La riproducibilità del metodo utilizzando alto ⁶⁸Ga attività si estende il campo delle possibili applicazioni, tra cui grandi modelli animali o studi umani. Inoltre, c'è una fase di purificazione singolo inclusa nel metodo. Nel processo, l'eventuale eccedenza del libero Gallio, idrato di idrazina, citrato di sodio e cloruro di ferro vengono rimossi mediante gel filtrazione. Eliminazione totale dell'isotopo gratis e la purezza del campione non garantire nessuna tossicità e migliorare la risoluzione dell'immagine. In passato, abbiamo già dimostrato l'utilità di questo approccio in imaging molecolare mirata^27,28.

Protocollo

1. preparazione dei reagenti

1. HCl 0,05 M
   1. Preparare 0,05 M HCl aggiungendo µ l 208 del 37% HCl a 50 mL di acqua distillata.
2. Cromatografia liquida ad alte prestazioni eluente
   1. Preparate ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) eluente sciogliendo 6,9 g di sodio diidrogeno fosfato monoidrato, 7,1 g di fosfato disodico, 8,7 g di cloruro di sodio e 0,7 g di sodio azide in 1 L di acqua. Mescolare bene e controllare il pH. Passare l'eluente attraverso un filtro sterile cutoff di 0,1 µm e degassare prima dell'uso. Gamma di accettazione: pH 6,2-7.0 (se non, regolare con NaOH [1m] o HCl [5 M]).

2. sintesi di nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con citrato

1. Sciogliere 75 mg di FeCl₃·6H₂O e 80 mg di acido citrico trisodico biidrato sale a 9 mL di acqua.
   Nota: Queste quantità forniscono 12 mL di nanoparticelle purificate finale ([Fe] ~1.4 mg·mL^-1). Quantità può essere ridotta per ottenere un volume finale di 2,5 mL.
2. Mettere il composto nella beuta di forno a microonde-adattato.
3. Caricare un protocollo dinamico nel microonde. Impostare la temperatura a 120 ° C, il tempo di 10 min, la pressione a 250 psi e il potere di 240 w.
4. Aggiungere 1 mL di idrazina idrata alla reazione.
   Nota: Idrato di idrazina inizia la riduzione del ferro. Di conseguenza, un cambiamento nell'aspetto della soluzione, dal giallo chiaro al marrone, è osservato.
5. Avviare il protocollo di forno a microonde.
6. Nel frattempo, sciacquare una colonna di gel filtrazione dissalazione con 20 mL di acqua distillata.
7. Una volta che ha terminato il protocollo, lasciare il pallone a raffreddare a temperatura ambiente.
8. Pipettare 2,5 mL della miscela finale sulla colonna e scartare il flusso continuo.
   Nota: Il forno a microonde si ferma il protocollo a 60 ° C; le nanoparticelle possono essere aggiunti direttamente alla colonna gel filtrazione a 60 ° C.
9. Aggiungere 3 mL di acqua distillata alla colonna e raccogliere le nanoparticelle in un flaconcino di vetro.
   Nota: Le nanoparticelle possono essere conservate a temperatura ambiente per 1 settimana. Dopo tale orario, l'aggregazione delle nanoparticelle appare, aumentando la loro dimensione idrodinamico.

3. sintesi di nanoparticelle di ⁶⁸Ga Core-drogati di ossido di ferro (⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Mettere 75 mg di FeCl₃·6H₂O e 80 mg di acido citrico sale trisodico diidrato nel pallone di forno a microonde-adattato.
2. Eluire il ⁶⁸Ge / generatore di⁶⁸Ga utilizzando il volume consigliato e la concentrazione di HCl, secondo il venditore (nel nostro caso, 4 mL di 0,05 M HCl). Dopo l'iniezione di quel volume nel generatore di schermate, (4 mL di) ⁶⁸GaCl₃ è ottenuta, pronto all'uso senza ulteriore elaborazione.
   Nota: Seguire le corrispondenti misure di sicurezza di radioattività per passaggi 3.2-3.12. ⁶⁸ GA è un isotopo emettitore di positroni e gamma. L'uso delle misure di sicurezza adeguate per evitare l'esposizione alle radiazioni da parte dell'operatore è fondamentale. I ricercatori devono seguono un protocollo di ALARA (basso quanto ragionevolmente ottenibile) utilizzando schermatura tipica e le procedure di gestione del radionuclide. Inoltre, l'uso di un anello, distintivi di corpo e un rilevatore di contaminazione è obbligatorio.
3. Aggiungere 4 mL di ⁶⁸GaCl₃ nel matraccio di forno a microonde-adattato. Questo volume può essere più piccolo, a seconda dell'attività del generatore e attività desiderata delle nanoparticelle finale.
4. Pipettare 5 mL di acqua distillata nel pallone e mescolare bene.
5. Caricare un protocollo dinamico nel microonde. Impostare la temperatura a 120 ° C, il tempo di 10 min, la pressione a 250 psi e il potere di 240 w.
6. Aggiungere 1 mL di idrazina idrata alla reazione.
   Nota: Idrato di idrazina inizia la riduzione del ferro. Di conseguenza, un cambiamento nell'aspetto della soluzione, dal giallo chiaro al marrone, è osservato.
7. Avviare il protocollo di forno a microonde.
8. Nel frattempo, sciacquare una colonna di gel filtrazione dissalazione con 20 mL di acqua distillata.
9. Una volta che ha terminato il protocollo, lasciare il pallone a raffreddare a temperatura ambiente.
10. Pipettare 2,5 mL della miscela finale sulla colonna e scartare il flusso continuo.
    Nota: Il forno a microonde si ferma il protocollo a 60 ° C; le nanoparticelle possono essere aggiunti direttamente alla colonna di gel filtrazione a 60 ° C.
11. Aggiungere 3 mL di acqua distillata alla colonna e raccogliere le nanoparticelle in un flaconcino di vetro.
12. Calcolare radiolabeling efficienza utilizzando un pozzo-tipo rivelatore di NaI. Questo parametro misura in genere l'attività di ⁶⁸Ga incorporato nella reazione. Dopo processi sintetici e purificazione, l'attività del campione purificato viene misurata. A causa della breve emivita di ⁶⁸Ga, l'attività iniziale deve essere corretto al tempo (t). Normalizzazione con il tempo segue l'equazione standard:
    N_T = N₀ · e^-λt
    Qui,
    N_T: conta al tempo (t)
    N₀: conta al tempo (t) = 0
    Λ: costante di decadimento
    t: tempo trascorso
    
    Nota: Radiolabeling efficienza dovrebbe essere tra 90-95%.

4. analisi delle nanoparticelle di ⁶⁸Ga Core-drogati di ossido di ferro (⁶⁸Ga-C-IONP)

1. Diffusione dinamica della luce
   1. Diffusione dinamica della luce (DLS) consente di misurare la dimensione idrodinamica di ⁶⁸Ga-C-IONP. Pipettare 60 µ l del campione in una provetta ed eseguire tre misure per campione. Per garantire la riproducibilità, questo dovrebbe essere ripetuto con diversi lotti di nanoparticelle.
2. Stabilità colloidale
   1. Valutare la stabilità colloidale di ⁶⁸Ga-C-IONP misurando le dimensioni idrodinamica del campione dopo incubazione in diversi buffer (PBS, soluzione fisiologica e siero di topo) per tempi diversi, che vanno da 0 a 24 h. Incubare 500 µ l del campione in ogni buffer 37 ° C. Ai selezionati volte, prendere le aliquote 60-µ l e dispensare loro nelle cuvette DLS per misurare il loro formato idrodinamico.
3. Microscopia elettronica
   1. Analizzare la dimensione del nucleo di ⁶⁸Ga-C-IONP mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e anulare scuro-campo imaging (staminali-ottenute) (ref protocollo TEM: NIST - protocollo di analisi congiunta di NCL, PCC-X, misura la dimensione di nanoparticelle mediante microscopio elettronico Microscopia).
4. Gel filtrazione radio-cromatogramma
   1. Frazionare l'eluizione in aliquote di 500-µ l durante la fase di purificazione di gel-filtrazione e misurare la radioattività presente in ciascuna usando un calibratore de dose; quindi, di rendere un cromatogramma di gel-filtrazione.
5. Radiochimica stabilità di ⁶⁸Ga-C-IONP
   1. Incubare ⁶⁸Ga-C-IONP nel siero di topo per 30 min a 37 ° C (ripetuto 3 volte). Dopo tale scadenza, purificare le nanoparticelle di ultrafiltrazione e misurare la radioattività presente nelle nanoparticelle e filtrato. Nei filtrati diversi dovrebbe essere rilevata alcuna attività.
6. Rilassometria
   1. Misura longitudinale (T₁) e trasversale (T₂) tempi di rilassamento in un relaxometer a 1.5 T e 37 ° C. Quattro differenti concentrazioni di ⁶⁸Ga-C-IONP (2 mM, 1 mM, 0.5 mM e 0,25 mM) devono essere misurate. Tracciare la velocità di rilassamento (r₁= 1/T₁, r₂= 1/T₂) contro la concentrazione di ferro. La pendenza della curva ottenuta esegue il rendering di valori r₁ e r₂ .
7. Immagini fantasma MR e PET
   1. Acquisire in situ MR (T₁-weighted sequenza) e immagini fantasma dell'animale domestico per una serie di diluizioni di ⁶⁸Ga-C-IONP (0 mM, 1 mM, 6.5 mM e 9,0 mM) per osservare l'aumento del segnale in correlazione con l'attività di PET e MRI.

Risultati

⁶⁸ GA-C-IONP sono stati sintetizzati combinando FeCl₃, ⁶⁸GaCl₃, acido citrico, acqua, e idrato di idrazina. Questa miscela è stata introdotta nel microonde per 10 min a 120 ° C e 240 W sotto pressione controllata. Una volta che il campione aveva raffreddato a temperatura ambiente, le nanoparticelle sono state purificate mediante gel filtrazione per eliminare specie non reagito (FeCl₃, citrato, idrato di idrazina) e liberare ^68<...

Discussione

Nanoparticelle di ossido di ferro sono un agente di contrasto ben consolidata per T₂-weighted MRI. Tuttavia, a causa di inconvenienti di questo tipo di contrasto per la diagnosi di alcune patologie, T₁-ponderata o brillante contrasto è preferito molte volte. Le nanoparticelle qui presentate non solo superare queste limitazioni offrendo contrasto positivo in MRI, ma offrono anche un segnale in una tecnica di imaging funzionale, come la PET, via ⁶⁸incorporazione di Ga nel loro nuc...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron (III) chloride hexahydrate	POCH	2317294
Citric acid, trisodium salt dihydrate 99%	Acros organics	227130010
Hydrazine hydrate	Aldrich	225819
Hydrochloric acid 37%	Fisher Scientific	10000180
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Aldrich	S9638
Disodium phosphate dibasic	Aldrich	S7907
Sodium chloride	Aldrich	746398
Sodium Azide	Aldrich	S2002
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	POCH	799200119
68Ga Chloride	ITG Isotope Technologies Garching GmbH, Germany	68Ge/68Ga generator system
Microwave	Anton Paar	Monowave 300
Centrifuge	Hettich	Universal 320
Size Exclusion columns	GE Healthcare	PD-10