Synthèse de 68Ga dopée à base d’oxyde de fer nanoparticules pour tomographie par émission de double/imagerie de résonance magnétique (T1)

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour obtenir⁶⁸Ga dopée à base d’oxyde de fer nanoparticles via rapide axée sur les micro-ondes synthèse. La méthode rend PET / (T₁) MRI nanoparticules avec radiomarquage efficacité supérieure à 90 % et la pureté radiochimique de 99 % dans une synthèse de 20 min.

Résumé

Nous décrivons ici une synthèse micro-ondes afin d’obtenir des nanoparticules d’oxyde de fer coeur dopé avec ⁶⁸GA. micro-ondes permet la technologie rapide et reproductibles procédures synthétiques. Dans ce cas, à partir de FeCl₃ et citrate trisodique sel, nanoparticules d’oxyde de fer recouverts d’acide citrique sont obtenus en 10 min dans le four à micro-ondes. Ces nanoparticules présentent une taille petit noyau de 4,2 ± 1,1 nm et une taille hydrodynamique de 7,5 ± 2,1 nm. En outre, ils ont une valeur élevée relaxivité longitudinale (r₁) 11,9 mM^-1·s^-1 et une valeur modeste relaxivité transversal (r₂) de 22,9 mM^-1·s^-1, qui se traduit par une faible r₂ /r₁ ratio de 1,9. Ces valeurs permettent la génération de contraste positif dans l’imagerie par résonance magnétique (IRM) au lieu de contraste négatif, couramment utilisé avec des nanoparticules d’oxyde de fer. En outre, si une élution ⁶⁸GaCl₃ d’un ⁶⁸Ge /⁶⁸Ga générateur est ajouté aux produits de départ, un nano-traceurs radioactifs dopé avec ⁶⁸Ga est obtenue. Le produit est obtenu avec un rendement élevé radiolabeling (> 90 %), quel que soit l’activité initiale utilisée. En outre, une étape de purification unique rend la nano-radiomaterial prêt à être utilisé in vivo.

Introduction

La combinaison de techniques d’imagerie à des fins médicales a déclenché la quête de différentes méthodes synthétiser les sondes multimodal^1,2,3. En raison de la sensibilité du scanner par émission de positrons (TEP) et la résolution spatiale de l’IRM, combinaisons TEP/IRM semblent être une des plus attrayantes possibilités, fournissant des informations anatomiques et fonctionnelles à la même époque⁴. En IRM, T₂-séquences pondérés peuvent être utilisés, noircissement des tissus dans lesquels ils s’accumulent. T₁-séquences pondérées peuvent également être utilisés, en produisant l’éclaircissement de l’accumulation des emplacement⁵. Parmi eux, contraste positif est souvent l’option plus adéquate, comme contraste négatif le rend beaucoup plus difficile de différencier le signal hypointense endogène zones, y compris celles souvent présentés par les organes comme les poumons⁶. Traditionnellement, sondes moléculaires Gd ont été employées pour obtenir contraste positif. Cependant, les agents de contraste à base de Gd présentent un inconvénient majeur, à savoir leur toxicité, ce qui est essentiel chez les patients atteints de problèmes rénaux^7,8,9. Cela a motivé recherche dans la synthèse de matériaux biocompatibles pour leur utilisation comme agents de contraste de₁ T. Une approche intéressante est l’utilisation de nanoparticules d’oxyde de fer (IONPs), avec une taille très petit noyau, qui fournissent le contraste positif¹⁰. En raison de ce très petit noyau (~ 2 nm), la plupart de la Fe^{3 +} les ions sont sur la surface, avec 5 électrons non appariés. Cela augmente le temps de relaxation longitudinale (r₁) valeurs et rendements beaucoup moins transversal/longitudinal (r₂/r₁) ratios par rapport aux traditionnels IONPs, produisant le positif souhaité ¹¹de contraste.

Pour combiner les IONPs avec un émetteur de positrons pour animal de compagnie, il y a deux principaux aspects à prendre en compte : élection de radio-isotopes et nanoparticules radiomarquage. Concernant la première question, ⁶⁸Ga est un choix séduisant. Il a une demi-vie relativement courte (67,8 min). Sa demi-vie est adaptée pour le peptide étiquetage puisqu’il correspond à commune peptide biodistribution fois. En outre, ⁶⁸Ga est produite dans un générateur, permettant la synthèse dans les modules de banc et en évitant la nécessité d’un cyclotron à proximité de^12,13,14. Pour radiolabel la NANOPARTICULE, incorporation de radio-isotope surface-étiquetage est la stratégie répandue. Cela peut être fait à l’aide d’un ligand qui chélate ⁶⁸Ga ou en profitant de l’affinité de la radiometal vers la surface de la NANOPARTICULE. La plupart des exemples dans la documentation relative à IONPs utilisent un chélateur. Il existe des exemples d’utilisation de ligands hétérocycliques comme 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tétraacétique acide (DOTA)¹⁵, 1,4,7-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacétique acide (NOTA)^16,17et 1,4,7- 1,4,7-triazacyclononane, 1-glutarique acide-4,7-acétique (NODAGA)¹⁸et l’utilisation de l’acide 2, 3-dicarboxypropane-1, 1-diphosphonique (DPD), une de ligand tétradentate ¹⁹. Madru et al. ²⁰ mis au point un chélateur exempt stratégie en 2014 à l’étiquette IONPs à l’aide d’une méthode sans chélateur utilisée par un autre groupe postérieurement²¹.

Toutefois, les inconvénients majeurs de cette approche incluent un risque élevé d’en vivo transmétallation, faibles rendements radiolabeling et protocoles longs inadaptés pour les isotopes de courte durée^22,23,24. Pour cette raison, Wong et al. ²⁵ a développé le premier exemple de nanoparticules dopées au noyau, réussissant à incorporer ⁶⁴Cu dans le noyau des IONPs dans une synthèse de 5 min à l’aide de la technologie des micro-ondes.

Ici, nous décrivons une procédure rapide et efficace pour intégrer le radionucléide dans le noyau de la NANOPARTICULE, trompant beaucoup des inconvénients présentés par les méthodes traditionnelles. À cette fin, nous proposons l’utilisation d’une synthèse pilotée par micro-ondes (MWS), qui réduit considérablement les temps de réaction augmente les rendements et améliore la reproductibilité, paramètres extrêmement importants dans la synthèse IONP. L’exécution raffinée de MWS est due à chauffage diélectrique : échantillon rapide chauffage que les dipôles moléculaires essaient d’aligner avec le champ électrique alternatif, étant des solvants polaires et réactifs plus efficaces pour ce type de synthèse. En outre, l’utilisation de l’acide citrique comme un agent tensio-actif, ainsi que de la technologie des micro-ondes, entraîne des nanoparticules extrêmement petites, produisant un double T₁-²⁶ signal du MRI/PET pondérée, ci-après désignée par oxyde de fer dopé Ga Core ⁶⁸ nanoparticules (⁶⁸Ga-C-IONP).

Le protocole combine l’utilisation de la technologie des micro-ondes, ⁶⁸GaCl₃ comme émetteur de positrons, chlorure ferreux, citrate de sodium et l’hydrate d’hydrazine, résultant en double T₁-pondérée en fonction du matériau NANOPARTICULAIRES MRI/PET à peine 20 min. En outre, il donne des résultats cohérents sur une plage de ⁶⁸activités Ga (37 MBq, 111 MBq, 370 MBq et 1110 MBq) avec aucun effet significatif sur les principales propriétés physico-chimiques des nanoparticules. La reproductibilité de la méthode à l’aide d’activités Ga haut ⁶⁸étend le champ d’applications possibles, y compris les modèles animaux de grande taille ou les études chez l’homme. En outre, il y a une étape de purification unique incluse dans la méthode. Dans le processus, tout excès de gallium gratuit, chlorure ferreux, citrate de sodium et l’hydrate d’hydrazine sont éliminés par filtration sur gel. Élimination de l’isotope libre total et la pureté de l’échantillon n’assurent aucune toxicité et renforcent d’imagerie de résolution. Dans le passé, nous avons déjà démontré l’utilité de cette approche ciblée de^27,d’imagerie moléculaire²⁸.

Protocole

1. préparation du réactif

1. 0,05 M HCl
   1. Préparer, 0,05 M HCl en ajoutant 208 µL de 37 % HCl à 50 mL d’eau distillée.
2. Éluant de chromatographie liquide à haute performance
   1. Préparer éluant de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en dissolvant 6,9 g de dihydrogénophosphate de sodium monohydraté, 7,1 g de phosphate disodique, 8,7 g de chlorure de sodium et 0,7 g d’azide de sodium dans 1 L d’eau. Bien mélanger et vérifier le pH. Traverser un filtre stérile coupure de 0,1 µm de l’éluant et dégazer avant utilisation. Gamme d’acceptation : pH 6.2 et 7.0 (sinon, ajuster avec du NaOH [1 M] ou HCl [5 M]).

2. synthèse de nanoparticules d’oxyde de fer revêtu Citrate

1. Dissoudre 75 mg de FeCl₃·6H₂O et 80 mg de dihydrate sel trisodique de l’acide citrique dans 9 mL d’eau.
   Nota : Ces quantités donnent 12 mL de nanoparticules purifiés finales ([Fe] ~1.4 µg·ml^-1). Quantités peuvent être réduites pour obtenir un volume final de 2,5 mL.
2. Mettre le mélange dans le flacon adapté au micro-ondes.
3. Charger un protocole dynamique au micro-ondes. Réglez la température à 120 ° C, le temps de 10 min, la pression à 250 lb/po2 et la puissance de 240 w.
4. Ajouter 1 mL de l’hydrate d’hydrazine dans la réaction.
   Remarque : L’hydrate d’Hydrazine commence la réduction du fer. Par conséquent, un changement dans l’apparence de la solution, du jaune clair au brun, est observé.
5. Commencer le protocole de micro-ondes.
6. Pendant ce temps, rincer une dessalement colonne de gel filtration avec 20 mL d’eau distillée.
7. Lorsque le protocole est terminée, laisser le ballon se refroidir à température ambiante.
8. Pipetter 2,5 mL de mélange final sur la colonne et jeter le cheminement.
   Remarque : Le four s’arrête le protocole à 60 ° C ; les nanoparticules peuvent être ajoutés directement à la colonne de filtration sur gel à 60 ° C.
9. Ajouter 3 mL d’eau distillée à la colonne et de recueillir les nanoparticules dans un flacon en verre.
   Remarque : Les nanoparticules peuvent être stockés à température ambiante pendant 1 semaine. Passé ce délai, agrégation de nanoparticules apparaît, augmentant leur taille hydrodynamique.

3. synthèse de nanoparticules de dopée à base d’oxyde de fer Ga ⁶⁸(⁶⁸-Ga-C-IONP)

1. Mettre 75 mg de FeCl₃·6H₂O et 80 mg de dihydrate sel trisodique de l’acide citrique dans le ballon adapté au micro-ondes.
2. Éluer les ⁶⁸Ge / générateur de Ga⁶⁸en utilisant le volume recommandé et la concentration de HCl, selon le fournisseur (dans notre cas, 4 mL de 0,05 M HCl). Après l’injection de ce volume dans le générateur autonome blindé, (4 mL de) ⁶⁸GaCl₃ est obtenue, prêt à l’emploi sans traitement supplémentaire.
   Remarque : Suivez les mesures de sécurité de radioactivité correspondant pour obtenir la procédure 3.2-3.12. ⁶⁸ GA est un isotope émetteur de positrons et gamma. L’utilisation des mesures de sécurité appropriés pour éviter l’exposition aux rayonnements de l’opérateur est déterminante. Les chercheurs doivent suivre un protocole d’ALARA (aussi bas que raisonnablement possible) à l’aide de blindage typique et les procédures de traitement des radionucléides. En outre, l’utilisation d’un anneau, insignes du corps et un détecteur de contamination est obligatoire.
3. Ajouter 4 mL de ⁶⁸GaCl₃ au ballon adapté au micro-ondes. Ce volume peut être plus petit, selon l’activité génératrice et l’activité souhaitée des nanoparticules finales.
4. Pipette 5 mL d’eau distillée dans le ballon et bien mélanger.
5. Charger un protocole dynamique au micro-ondes. Réglez la température à 120 ° C, le temps de 10 min, la pression à 250 lb/po2 et la puissance de 240 w.
6. Ajouter 1 mL de l’hydrate d’hydrazine dans la réaction.
   Remarque : L’hydrate d’Hydrazine commence la réduction du fer. Par conséquent, un changement dans l’apparence de la solution, du jaune clair au brun, est observé.
7. Commencer le protocole de micro-ondes.
8. Pendant ce temps, rincer une dessalement colonne de gel filtration avec 20 mL d’eau distillée.
9. Lorsque le protocole est terminée, laisser le ballon se refroidir à température ambiante.
10. Pipetter 2,5 mL de mélange final sur la colonne et jeter le cheminement.
    Remarque : Le four s’arrête le protocole à 60 ° C ; les nanoparticules peuvent être ajoutés directement à la colonne de filtration sur gel à 60 ° C.
11. Ajouter 3 mL d’eau distillée à la colonne et de recueillir les nanoparticules dans un flacon en verre.
12. Calculer radiolabeling efficacité à l’aide d’un détecteur d’évidement de NaI. Ce paramètre mesure généralement l’activité de la ⁶⁸Ga incorporé dans la réaction. Après le processus de synthèse et purification, l’activité de l’échantillon purifié est mesurée. En raison de la courte demi-vie de ⁶⁸Ga, l’activité initiale doit être corrigée en temps (t). Normalisation avec temps suit l’équation générale :
    N_T = N₀ · e^-λt
    Ici,
    N_T: compte à un moment (t)
    N₀: compte à un moment (t) = 0
    Λ : constante de désintégration
    t: temps écoulé
    
    NOTE : Radiolabeling efficacité devrait être entre 90 et 95 %.

4. analyse des nanoparticules de dopée à base d’oxyde de fer Ga ⁶⁸(⁶⁸-Ga-C-IONP)

1. Diffusion dynamique de la lumière
   1. Diffusion dynamique de la lumière (DLS) permet de mesurer la taille hydrodynamique de ⁶⁸Ga-C-IONP. Pipetter 60 µL de l’échantillon dans une cuvette et d’effectuer trois mesures de taille par exemple. Afin d’assurer la reproductibilité, cela doit être répété avec plusieurs lots de nanoparticules.
2. Stabilité colloïdale
   1. Évaluer la stabilité colloïdale de ⁶⁸Ga-C-IONP en mesurant la taille hydrodynamique de l’échantillon après incubation dans différents tampons (PBS, une solution saline et sérum de souris) à des moments différents, allant de 0 à 24 h. Incuber 500 µL de l’échantillon dans chaque tampon à 37 ° C. Au fois, prendre 60-µL d’extraits et Pipeter eux dans des cuvettes de DLS pour mesurer leur taille hydrodynamique.
3. Microscopie électronique
   1. Analyser la taille de la base de ⁶⁸Ga-C-IONP à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM) et l’imagerie de champ sombre annulaire (tige-HAADF) (Réf protocole TEM : NIST - protocole d’analyse conjointe de NCL, PCC-X, mesurer la taille des nanoparticules à l’aide électronique à Transmission Microscopie).
4. Gel filtration radio-chromatogramme
   1. Fractionner l’élution en aliquotes de 500 µL au cours de l’étape de purification-filtration sur gel et mesurer la radioactivité présente dans chacun d’eux à l’aide d’un activimeter ; ainsi, rendre un chromatogramme filtration sur gel.
5. Radiochimie stabilité de ⁶⁸Ga-C-IONP
   1. Incuber les ⁶⁸Ga-C-IONP dans le sérum de souris pendant 30 min à 37 ° C (répété 3 fois). Passé ce délai, purifier les nanoparticules par ultrafiltration et mesurer la radioactivité présente dans les nanoparticules et le filtrat. Aucune activité ne devrait être détectée dans les filtrats différents.
6. Relaxométrie
   1. Mesure longitudinale (T₁) et transversale (T₂) temps de relaxation dans un relaxometer à 1,5 T et 37 ° C. Quatre concentrations différentes de ⁶⁸Ga-C-IONP (2 mM, 1 mM, 0,5 mM et 0. 25 mM) doivent être mesurées. Tracer le taux de relaxation (r₁= 1/T₁, r₂= 1/T₂) contre la concentration de fer. La pente de la courbe obtenue restitue les valeurs r₁ et r₂ .
7. M. et PET images fantômes
   1. Acquérir sur place M. (T₁-pondéré de séquence) et les images fantômes PET pour une série de dilutions de ⁶⁸Ga-C-IONP (0 mM, 1 mM, 6,5 mM et 9,0 mM) pour observer le signal de plus en plus en corrélation avec l’activité de l’animal et l’IRM.

Résultats

⁶⁸ GA-C-IONP ont été synthétisés en combinant FeCl₃, ⁶⁸GaCl₃, acide citrique, eau, et l’hydrazine hydrate. Ce mélange a été introduit dans le four à micro-ondes pendant 10 min à 120 ° C et 240 W sous pression contrôlée. Une fois que l’échantillon avait refroidi à la température ambiante, les nanoparticules ont été purifiés par filtration sur gel pour éliminer les espèces n’ayant pas réagis (FeCl₃, citrate, l...

Discussion

Les nanoparticules d’oxyde de fer sont un agent de contraste bien établie pour T₂-weighted MRI. Cependant, en raison des inconvénients de ce type de contraste pour le diagnostic de certaines pathologies, T₁-contraste lumineux ou non est souvent préféré. Les nanoparticules présentées ici non seulement surmonter ces limites en offrant un contraste positif en IRM, mais offrent également un signal dans une technique d’imagerie fonctionnelle, comme animal de compagnie, via ⁶⁸

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron (III) chloride hexahydrate	POCH	2317294
Citric acid, trisodium salt dihydrate 99%	Acros organics	227130010
Hydrazine hydrate	Aldrich	225819
Hydrochloric acid 37%	Fisher Scientific	10000180
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate	Aldrich	S9638
Disodium phosphate dibasic	Aldrich	S7907
Sodium chloride	Aldrich	746398
Sodium Azide	Aldrich	S2002
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	POCH	799200119
68Ga Chloride	ITG Isotope Technologies Garching GmbH, Germany	68Ge/68Ga generator system
Microwave	Anton Paar	Monowave 300
Centrifuge	Hettich	Universal 320
Size Exclusion columns	GE Healthcare	PD-10