改进杆状病毒表达载体生产昆虫细胞分泌植物蛋白

摘要

在这里, 我们提出了利用昆虫细胞和杆状病毒蛋白表达系统来产生大量植物分泌蛋白的蛋白质结晶的协议。用 GP67 或昆虫 hemolin 信号肽对昆虫细胞中植物蛋白分泌表达进行了改进, 并对杆状病毒表达载体进行了修正。

摘要

对科学家来说, 表达重组分泌真核蛋白用于结构和生物化学研究是一个挑战。杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统是用于表达重组真核分泌蛋白的系统之一, 具有一定的转化后修饰。分泌蛋白需要通过分泌通路进行蛋白质糖基化、二硫化键形成和其他转化后的修饰。为改善现有分泌植物蛋白的昆虫细胞表达, 在启动子和多克隆点之间添加 GP67 或 hemolin 信号肽序列, 对杆状病毒表达载体进行修改。新设计的改进后的载体系统成功地生产出了拟南芥可溶性重组分泌植物受体蛋白的高产。对两种表达的植物蛋白, 拟南芥和 PRK3 膜受体的胞外域进行了结晶, 用于 x 射线晶体的研究。改进后的矢量系统是一种改良的工具, 可用于动物王国中重组分泌蛋白的表达。

引言

研究实验室有能力生产大量的均质重组蛋白, 用于生化和生物物理特征, 尤其是 x 射线晶体学研究。大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等具有良好的外源表达系统, 其中杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统是其中最常用的技术生产大量的结构折叠大型重组真核蛋白的蛋白质结晶¹。

对杆状病毒表达系统的表达载体进行了设计, 以包含强多角体或 P10 启动子, 以产生高产量的重组细胞内蛋白^2,3。为了制作重组杆状病毒, 该基因被克隆成含有杆状使用杆状多 nucleopolyhedroviral 基因组多角体 (polh) 轨迹的昆虫载体。然后对生成的构造进行排序, 验证其正确的开放阅读框架 (ORF)。通过转染过程将正确的构造引入宿主昆虫细胞。兴趣基因通过同源重组插入病毒基因组。这一事件导致重组病毒基因组的生产, 然后复制, 以产生重组发芽病毒粒子¹。

在表达系统中最常用的昆虫细胞是 Sf9 和高五 (Hi5) 细胞。Sf9 细胞是 Sf21 蛹卵巢细胞的克隆分离物, Hi5 细胞是由父母夜蛾镍卵巢细胞系 TN-368^4,5所衍生的克隆分离株。transfections、病毒扩增和斑块检测是在 Sf9 细胞上进行的, 而 Hi5 细胞通常被选择以产生更高数量的重组蛋白⁶。值得注意的是, Hi5 细胞由于其产生突变病毒的倾向而不适合于病毒后代的产生和扩增。传统上, 25-30 °c 的温度范围被认为对昆虫细胞的培养是有益的。然而, 据报道, 27-28 °c 是最佳的温度为昆虫细胞生长和传染^7,8。

在基因之前引入一个强烈的信号序列是分泌蛋白的高表达所必需的。该信号序列将有效地引导转化后的重组蛋白转化为内质网的蛋白质分泌和转化后的修改必要的适当折叠和稳定³。信号肽序列, 如杆状病毒包络蛋白 GP64/67, 蜜蜂蜂毒等, 已被选择, 以促进分泌重组蛋白的表达在杆状病毒介导的表达系统³。GP67 的信号肽的引入, 以提高分泌重组蛋白的表达率, 与使用目标基因⁹的内在信号肽相比较。Hemolin 是大丝蛾Hyalophora cecropia的血淋巴蛋白, 引起细菌感染¹⁰。由于诱导表达水平较高, 该基因的信号肽序列可以用来调节杆状病毒-昆虫细胞系统中重组蛋白的分泌表达。

Tracheary 元素分化抑制因子受体 (TDR) 和花粉受体激酶 3 (PRK3) 都属于植物亮氨酸丰富的重复受体样激酶 (LRR RLK) 蛋白^{11,12 的家庭}.为了研究植物受体蛋白家族的结构和功能, 以及促进其他植物分泌蛋白的结构和生化特性, 对杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行了改进, 以提高蛋白质质量和产量。利用两种修饰表达载体在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中成功地表达了 TDR 和 PRK3 的胞外域。TDR 和 PRK3 蛋白的胞外域均已结晶。本文报道了两种改进的杆状病毒表达载体的大量重组分泌植物蛋白的表达和纯化, 通过在启动子和多克隆之间加入 GP67 或 hemolin 信号序列。网站。

研究方案

注: 采用修饰表达载体的昆虫细胞/杆状病毒系统, 用于分泌植物蛋白的表达和结晶。

1. 用 GP67 信号肽对杆状病毒表达载体进行植物蛋白分泌表达的改进

1. 合成一个 DNA 片段, 包含 5 ' BglII 切割站点¹³, GP67 分泌信号序列, 和一个多克隆网站与 NotI, BamHI, EcoRI, StuI, 贝里沙, SpeI, XbaI, PstI 和 XhoI (图 1A)。
   注: 由于 BglII 和 BamHI 消化 dna 导致相同的粘合剂末端, 线性化的载体可以结扎到被消化的脱氧核糖核酸片断, 当退火的结扎序列的 BglII 和 BamHI 站点将被变异到不是裂解的序列无论是 BglII 或 BamHI¹⁴。
2. 消化4µg 的 dna 与 BglII 和 XhoI, 和4µg 的表达载体 dna BamHI 和 XhoI¹⁴。将每种限制酶的10个单位与1x 浓度反应缓冲器中的 DNA 混合 (50 毫米醋酸钾, 20 毫米三醋酸盐, 10 毫米醋酸镁, 100 µg/毫升 BSA, pH 7.9 在25°c) 和孵化混合物在37°c 为 4 h。
   1. 用 dna 凝胶萃取试剂盒¹⁵纯化分离的 dna 片段和线性化的载体 dna。
3. 在含有 1x T4 DNA 连接酶反应缓冲器 (50 毫米三盐酸) 的 10-µL 结扎反应混合物中, 将100的线性化向量 DNA 与 400 ng 的被消化 dna 片段混合在一起; 10 毫米氯化镁₂, 1 毫米 ATP, 和10毫米的德勤, pH 7.5 在25°c) 和5个单位的 T4 DNA连接酶.孵育反应混合物在16°c 为16小时。
4. 将结扎合剂的5µL 转化为100µL 的 DH5α合格细胞, 遵循标准的转换协议, 并选择在氨苄西林-LB 琼脂板¹⁶上产生的菌落。拿起 5-10 殖民地和生长每殖民地在2毫升的 LB 培养基包含100µg/毫升氨苄西林在 220 rpm 和37°c 在一个震动孵化器为 16 h。
5. 提取每个质粒 dna 与 dna miniprep 试剂盒¹⁷和确认克隆的 dna 测序与底漆 AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG。
6. PCR-放大a.拟南芥基因片段编码残留物 30-642 从合成 TDR 基因构造 (向前底漆: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, 反向底漆: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC)。在 dna 聚合酶反应缓冲器中放大30周期的 dna, 其中包含0.5 毫米 dNTP 混合, 0.2 µM 底漆, 0.1 µg 的模板 dna, 0.4 毫米氯化镁₂和1反应单元的 dna 聚合酶。
   1. 为 PCR 周期步骤, 设置最初变性在95°c 三十年代, 然后30周期变性在95°c 三十年代, 退火在55°c 为三十年代, 并且引伸在72°c 为 1 min, 以最后的引伸在72°c 为5分钟。
7. 用 NotI 和 BamHI 限制限制性酶对 PCR 片段和修饰载体进行消化。用线性化向量结扎基因片段。将 100 ng 的线性化矢量 DNA 与400的消化 dna 片段 (含 T4 dna 连接酶反应缓冲器和5单位 T4 dna 连接酶) 的µL 结扎反应混合物混合。孵育反应混合物在16°c 为16小时。
8. 将结扎合剂的5µL 转化为100µL 的 DH5α合格细胞, 遵循标准的转换协议, 并选择在氨苄西林-LB 琼脂板¹⁶上产生的菌落。通过 DNA 测序确认正确的克隆。

2. 昆虫 Hemolin 信号肽用于植物蛋白分泌表达的杆状病毒表达载体的改进

1. 合成一个 DNA 片段, 包含 5 ' BglII 切割站点¹³, 昆虫 hemolin 分泌信号序列, 和一个多克隆网站与 NotI, BamHI, EcoRI, StuI, 贝里沙, SpeI, XbaI, PstI 和 XhoI (图 1B)。
2. 消化4µg 的 dna 与 BglII 和 XhoI, 和4µg 的表达载体 dna BamHI 和 XhoI¹⁴。将每种限制酶的10个单位与1x 浓度反应缓冲器中的 DNA 混合 (50 毫米醋酸钾, 20 毫米三醋酸盐, 10 毫米醋酸镁, 100 µg/毫升 BSA, pH 7.9 在25°c) 和孵化混合物在37°c 为 4 h。
   1. 用 dna 凝胶萃取试剂盒¹⁵纯化分离的 dna 片段和线性化的载体 dna。
3. 在含有 1x T4 DNA 连接酶反应缓冲器 (50 毫米三盐酸) 的 10-µL 结扎反应混合物中, 将100的线性化向量 DNA 与 400 ng 的被消化 dna 片段混合在一起; 10 毫米氯化镁₂, 1 毫米 ATP, 和10毫米的德勤, pH 7.5 在25°c) 和5个单位的 T4 DNA连接酶.孵育反应混合物在16°c 为16小时。
4. 将结扎合剂的5µL 转化为100µL DH5α合格细胞, 并选择氨苄西林-LB 琼脂板上的菌落。拾起 5-10 殖民地并且生长每个殖民地在一个2毫升 LB 媒介包含100µg/毫升氨苄西林在 220 rpm 和37°c 在一个震动孵化器为 16 h。
5. 用 dna miniprep 试剂盒¹⁷提取质粒 dna, 并通过 AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG 的 dna 测序确认克隆。
6. PCR-放大a. 芥花粉受体激酶 3 (PRK3) 基因片段编码残留物 20-237 从合成 PRK3 基因构造 (向前底漆: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, 反向底漆: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTGTGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC)。在 dna 聚合酶反应缓冲器中放大30周期的 dna, 其中包含0.5 毫米 dNTP 混合, 0.2 µM 底漆, 0.1 µg 的模板 dna, 0.4 毫米氯化镁₂和1反应单元的 dna 聚合酶。
   1. 为 PCR 周期步骤, 设置初始变性在95°c 三十年代, 然后30周期变性在95°c 三十年代, 退火在55°c 为三十年代, 并且延长在72°c 为三十年代在每个周期之内, 并且最后的引伸在72°c 为5分钟。
7. 用 NotI 和 BamHI 限制限制性酶对 PCR 片段和修饰载体进行消化。用线性化向量结扎基因片段。将 100 ng 的线性化矢量 DNA 与400的消化 dna 片段 (含 T4 dna 连接酶反应缓冲器和5单位 T4 dna 连接酶) 的µL 结扎反应混合物混合。孵育反应混合物在16°c 为16小时。
8. 将结扎合剂的5µL 转化为100µL 的 DH5α合格细胞, 遵循标准的转换协议, 并选择在氨苄西林-LB 琼脂板¹⁶上产生的菌落。通过 DNA 测序确认正确的克隆。

3. 以重组蛋白表达盒为载体的杆状病毒结构的制作和扩增

1. 利用构造质粒100的 DH10Bac, 在杆状病毒表达系统¹的协议下, 转化40µL 的合格细胞。在37摄氏度的48小时内孵化转化板。
2. 从每个变换板上提取两个白色的菌落, 将每个菌落接种2毫升的 LB 培养基, 其中含有50µg 卡那霉素、7µg/毫升庆大霉素, 以及10µg/毫升四环素。遵循杆状病毒表达系统¹的协议提取和验证 bacmid DNA。整除每个 DNA 在两个管与20µL 每一个, 并存储管在-20 摄氏度。
   注意: 以下步骤需要无菌操作。
3. 在培养基中培养10% 胎牛血清 (血清) 和100µg/毫升 (或100国际单位/毫升) 青霉素-链霉素抗生素, 在27摄氏度至80% 井板的 Sf9 细胞。根据组织培养板上覆盖面积的百分比估计汇流的百分比。
4. 在两个无菌1.5 毫升离心管中准备以下解决方案。
   1. 管 1: 每次转染, 稀释20µL bacmid DNA 成100µL unsupplemented Sf9 细胞培养基, 无抗生素。轻轻地把稀释后的管子的侧面混合。
   2. 管 2: 对每转染, 稀释8µL 脂转染试剂成100µL unsupplemented Sf9 细胞培养基无抗生素。将稀释液彻底混合, 吹打上下6x。
5. 结合两个解决方案, 轻轻地混合在一起, 吹打慢慢向上和向下 3x, 并孵化他们在室温下 20-40 分钟。
6. 用3毫升的 unsupplemented Sf9 细胞培养培养基 Sf9 单层细胞 2x, 无抗生素。每次转染, 添加0.8 毫升的 unsupplemented Sf9 细胞培养基, 不含抗生素, 每管含有脂质 DNA 混合物。轻轻地将管子的内容混合在一起, 慢慢地吹打3x。从盘子中吸取洗涤介质, 然后用转染混合物覆盖样品。
7. 在添加转染混合物后, 在27摄氏度的5小时内孵化出所染的板。用完整的 Sf9 细胞培养基取代转染培养基, 其中含有10% 只血清和100µg/毫升 (或100国际单位/毫升) 青霉素-链霉素抗生素。在27摄氏度孵育转染板 4 d。
8. 收获和放大重组杆状病毒。
   1. 在 4 d 孵化后, 在不育的15毫升圆锥管中收集感染板的上清。以 1010 x g为5分钟旋转上清, 去除细胞碎片。丢弃颗粒并将上清醒酒到干净的管子上, 将其贮存在摄氏4摄氏度, 长达1年。
      注意: 这是 P0 病毒。它可以 aliquoted 和储存在-80 摄氏度, 在较长的时间内。
   2. 为了放大每种重组病毒, 在150毫米的板块上生长一层 Sf9 细胞到80% 汇合。从盘子中吸取培养基, 将2毫升的 P0 病毒添加到附着在盘子上的细胞中, 在27摄氏度孵化器中孵化出1小时的平板。每隔15分钟摇动盘子, 将培养基与细胞混合。
      1. 添加25毫升完整的恩典的媒体含有10% 血清和100µg/毫升 (或100国际单位/毫升) 青霉素-链霉素抗生素。在27摄氏度孵化器中孵化出 3 d 的盘子, 以获得 P1 通道病毒。
   3. 在不育的50毫升圆锥管中收集被感染的盘子的上清, 并在 1010 x g处旋转5分钟以去除细胞碎片。醒酒到干净的管, 并保存在4摄氏度, 长达1年。
      注: P1 病毒可以 aliquoted 和储存在-80 摄氏度, 较长一段时间。
   4. 为了将病毒从 P1 扩大到 P2 通道, 在150毫米的盘子上长出一层 Sf9 细胞到90% 汇合处, 吸出盘子的培养基, 在盘子中加入2毫升 P1 病毒, 并在27摄氏度孵化器中孵化1小时。
   5. 重复步骤3.8.2 和3.8.3 获取病毒的 P2 和 P3 通道。不要将 P3 病毒存储2月以上。

4. 蛋白质表达, NiNTA 纯化和结晶

1. 培养 1 L Hi5 昆虫细胞在文化媒介与100µg 或 ml (或100国际单位/毫升) 青霉素-链霉素抗生素到密度 2 x 10⁶在 100 rpm 在27°c 孵化器振动筛。向下旋转 570 x g的细胞为5分钟, 醒酒上清, 并用重悬的细胞在20毫升的新鲜生产的 P3 病毒, 并保持在室温下1小时. 轻轻摇动旋转瓶, 并用重悬细胞1x 每15分钟。
2. 将细胞转移到1升的培养基上, 用100µg/毫升 (或100国际单位/毫升) 青霉素-链霉素抗生素, 培养细胞在 100 rpm 在27°c 孵化器振动筛为 72 h. 在 1010 x g的细胞中旋转5分钟, 然后收集上清。
3. 使用 ph 指示条将上清液的 ph 值调整为 8.0, 加入0.1 米 HCl 或0.1 米氢氧化钠, 并在最终浓度下添加捆绑缓冲器, 在 pH 8.0、100毫米氯化钠和5毫米咪唑中含有20毫米的三个缓冲器。添加一定数量的 NiNTA 树脂 (10-40 毫升) 根据估计产量的表达他标记的重组蛋白。
   1. 在4°c 的1小时内, 将溶液与低速的磁搅拌混合在一起, 清洗树脂并洗脱标准 NiNTA 纯化协议¹⁸中的绑定蛋白。
4. 以纯化蛋白为离子交换和凝胶过滤层析, 以及其他蛋白质纯化方法, 产生均匀样品。
   注: 对于 TDR 胞外区, 20 毫米三, pH 8, 100 毫米氯化钠被用作凝胶过滤缓冲器。对 PRK3 胞外区, 20 毫米双三, pH 6, 100 毫米氯化钠作为首选凝胶过滤缓冲剂。

结果

如图 1所示, 两种改进的 pFastBac1 杆状病毒表达载体用于表达 GP67 或 hemolin 信号序列的分泌蛋白, 以取代目标基因的内在信号序列。病毒 GP67 和昆虫 hemolin 基因已被证明具有较高的分泌表达水平的细胞。融合蛋白与这两个信号序列中的任何一个有望大大提高分泌表达水平。在这两种改进的向量中, 都设计了相同的多个克隆站点 (MCS)。NotI 站点被蓄意放置?...

讨论

鉴于生物系统中数以千计的蛋白质的大小和稳定性的多样性, 研究实验室通常有经验来决定哪些异种表达系统必须选择用于表达特定的蛋白质。大肠杆菌表达系统往往是由于细菌生命周期短、培养基成本低、相对容易扩展¹⁹而导致蛋白质表达的首选。然而, 对于大小超过 60 kDa 的大真核蛋白的表达, 使用大肠杆菌系统往往导致不溶性蛋白在包涵体或聚集^20<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator shaker	VWR	Model Excella E25	27 oC
Incubator	VWR	Model 2005	27 oC
Centrifuge	BECKMAN	Model J-6	with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600677-51	For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler	BIO-RAD	Model C1000 Touch	For PCR amplification of DNA
Incubator shaker	New Brunswick Scientific	Model I 24	For growing baceria culture
Customer DNA synthesis	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Restriction Endonuclease
BglII	New England Biolabs	R0144S	Restriction Endonuclease
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restriction Endonuclease
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T	DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose	Thermo Fisher Scientific	15510-019	For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell	Invitrogen	18-258-012	For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibiotics
Tetracycline	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibiotics
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells	Thermo Fisher Scientific	10361-012	For making bacmid DNA
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362-101	Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System	Thermo Fisher Scientific	10359-016	Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Baculorirus expression vector
Sf9 cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 monolayer cells
Hi5 cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
FBS Certified	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
6-well plates	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	Flat-bottom
150 mm plates	Thermo Fisher Scientific	353025	100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1475-0511	25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1500-1211	25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA resin
pH-indicator strips	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14