Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Özet

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Özet

Rekombinant salgı ökaryotik proteinler yapısal ve biyokimyasal araştırmalar ifade etmek bilim adamları için bir mücadele vardı. Böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem rekombinant ökaryotik salgı proteinler bazı translasyonel modifikasyonlar ile ifade etmek için kullanılan sistemlerinden biridir. Salgı proteinler için protein glikozilasyon, disülfür bağları oluşumu ve diğer translasyonel modifikasyonlar salgı yollar aracılığıyla yönlendirilmesi gerekir. Varolan böcek hücre ifade salgı bitki proteinlerin artırmak için bir baculovirus ifade vektör ya bir GP67 eklenmesi ya da bir hemolin sinyal peptid sırası organizatörü ve çoklu klonlama siteleri arasında tarafından değiştirilir. Bu yeni tasarlanmış değiştirilmiş vektör sistemi başarıyla Arabidopsis thalianaçözünür rekombinant salgılanan bitki reseptör proteinler yüksek bir verim üretti. İki ifade bitki proteinleri, Arabidopsis TDR ve PRK3 plazma membran reseptörleri, ekstrasellüler etki x-ışını crystallographic çalışmalar için kristalize. Değiştirilmiş vektör sistemi salgı rekombinant proteinler de hayvan krallığının bir ifade için kullanılabilir gelişmiş bir araçtır.

Giriş

X-ışını crystallographic çalışmalar için özellikle Biyokimya ve biyofizik karakterizasyonu için homojen rekombinant proteinlerin büyük miktarlarda üretme yeteneğine sahip olması bir araştırma laboratuvarı için zorunludur. Escherichia coli, mantar, böcek hücreleri, memeli hücreleri, bitki hücreleri, vb aralarında gibi birçok tanınmış Contegra ifade sistemleri vardır, böcek hücre baculovirus-aracılı ifade sistem en çoğunlukla teknikleri yapısal olarak katlanmış büyük ölçekli rekombinant ökaryotik proteinler protein kristalizasyon¹için büyük miktarlarda üretmek için kullanılır.

İfade vektörel çizimler baculovirus ifade sisteminin güçlü polyhedrin veya yüksek bir verim rekombinant proteinler hücre içi^2,3üretmek için P10 organizatörü içerecek şekilde tasarlanmıştır. Rekombinant baculovirus yapmak için faiz gen Autographa californica multi-nucleopolyhedroviral genom polyhedrin (polh) odağı içeren bir böcek vektörü klonlanmış. Elde edilen yapı sonra sıralı ve onun doğru açık okuma çerçevesi (ORF) doğrulanır. Doğru yapı sonra transfection sürecinde ana bilgisayar böcek hücresine tanıttı. Gen ilgi viral Genom tarafından Homolog rekombinasyon eklenir. Bu olay rekombinant üretmek için hangi sonra çoğaltır virüs parçacıkları¹budded rekombinant viral genom üretiminde sonuçlanır.

İfade sisteminde en sık kullanılan böcek hücreleri Sf9 ve yüksek beş (Hi5) hücrelerdir. Spodoptera frugiperda, pupa yumurtalık hücrelerinden elde edilen Sf21, klonal bir izole Sf9 hücrelerdir ve ebeveyn Trichoplusia ni yumurtalık hücre satırı TN-368^4,5dan türetilmiş bir klonal izole Hi5 hücrelerdir. Hi5 hücreleri genellikle rekombinant proteinler⁶daha yüksek miktarlarda üretmek için seçili iken eş transfections, virüs amplifikasyon ve plak deneyleri Sf9 hücreleri üzerinde yapılmaktadır. Hi5 hücreleri mutasyona uğramış virüs üretmek için onların eğilimi nedeniyle üretimi ve virüs ettiklerinizden amplifikasyon için uygun değildir fazlalaştı. Geleneksel olarak, 25-30 ° C sıcaklık aralığı böcek hücreleri ekimi için iyi olarak kabul edilir. Ancak, 27-28 ° C en uygun sıcaklık böcek hücre büyüme ve enfeksiyon^7,için⁸olduğu bildirilmiştir.

Giriş Gen önceki bir güçlü sinyal sırasında salgılanan proteinler yüksek ifade için gereklidir. Sinyal sıra verimli bir şekilde çevrilmiş Rekombinant protein endoplazmik retikulum protein salgılanması ve translasyonel modifikasyonlar uygun katlama ve sabitleme³için gerekli için deliklere. Protein GP64/67, bal arısı melittin ve diğerleri, baculovirus örtmek gibi sinyal peptid dizileri, baculovirus-aracılı ifade sistemleri³salgı rekombinant proteinlerin ifadesi kolaylaştırmak için seçildi. GP67 sinyal peptid getirilmesi ile karşılaştırıldığında içsel sinyal peptid hedef gen⁹kullanarak salgılanan bir Rekombinant protein, ifade verimini artırmak için gösterilmiştir. Hemolin bir bakteri enfeksiyonu¹⁰indüklenen dev ipek güve Hyalophora cecropia, hemolymph proteindir. İndüklenen ifade nispeten yüksek seviyede nedeniyle, gen sinyal peptid dizisi rekombinant proteinlerin salgılanmasını ifade baculovirus-böcek hücre sisteminde arabuluculuk için kullanılabilir.

A. thaliana Tracheary öğesi farklılaşma inhibitör faktör reseptör (TDR) ve polen reseptör kinaz her ikisi de proteinler^{11,12 bitki lösin yönünden zengin tekrar reseptör benzeri kinaz (LRR-RLK) ailesine ait 3 (PRK3)} . Yapısı ve fonksiyonu, bu ailenin diğer bitki salgılanan proteinler yapısal ve biyokimyasal karakterizasyonu kolaylaştırmak için bitki reseptör protein, de eğitim için baculovirus-böcek hücre ifade sistem için değiştirildi protein verim kalitesi ve üretim geliştirmek. Ekstrasellüler etki alanları TDR ve PRK3 başarıyla baculovirus-böcek hücre ifade sisteminde iki değiştirilmiş ifade vektörel çizimler kullanarak ifade edilmiştir. Her iki ekstrasellüler etki alanı TDR ve PRK3 proteinlerin kristalize. Ya bir GP67 ya da hemolin sinyal dizisi düzenleyici ve birden çok klonlama arasında dahil ederek ifade ve arıtma rekombinant salgılanan bitki proteinleri iki değiştirilmiş baculovirus ifade vektörel çizimler ile büyük miktarda Bu makale raporları siteleri.

Protokol

Not: Bir böcek cep/baculovirus sistemi ile değiştirilmiş ifade vektörel çizimler salgı bitki protein ifade ve kristalizasyon için kullanılır.

1. bir Baculovirus ifade vektör GP67 sinyal peptid bitki Protein salgılanması ifade ile modifikasyonu

1. Bir 5' BglII kesme makinası¹³, GP67 salgılanması sinyal sıra ve NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI ve XhoI (Şekil 1A) ile bir çok klonlama site içeren bir DNA parçası sentez.
   Not: BglII ve BamHI sindirilmiş beri DNA aynı yapışkanlı sona sonuçlandı, tavlanmış ligasyonu sırayla BglII ve BamHI siteleri tarafından yarilabilir değil bir sıra mutasyona iken Doğrusallaştırılmış vektör sindirilir DNA parçası ligate ya BglII ya da BamHI¹⁴.
2. BglII ve XhoI ile DNA'ın Özeti 4 µg ve¹⁴BamHI ve XhoI ile bir ifade vektör DNA 4 µg. 1 x konsantrasyon tepki arabellek (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat ve 100 µg/mL BSA, pH 7,9 25 ° c) DNA'daki ile her Restriksiyon enzimi ile 10 birim mix ve 4 h için 37 ° C'de karışımı kuluçkaya.
   1. Eksize DNA parçası ve bir DNA jel ekstraksiyon kiti¹⁵tarafından Doğrusallaştırılmış vektör DNA arındırmak.
3. Yöneyin Doğrusallaştırılmış DNA 400 ile mix 100 ng ng sindirilir DNA parçası 1 x T4 DNA ligaz tepki arabellek (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP ve 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° c) ve 5 adet T4 DNA içeren bir 10 µL ligasyonu tepki karışımı ligaz. 16 ° C 16 h için tepki karisimin kuluçkaya.
4. 5 µL ligasyonu karışımı DH5α yetkili hücre bir standart dönüştürme protokol sonrası 100 µL dönüştürmek ve bir ampisilin-LB agar plaka¹⁶üzerinde elde edilen kolonileri seçin. 5-10 kolonileri kadar almak ve her koloni 220 devir/dakika ve 37 ° C 16 h için titreyen bir kuluçka 100 µg/mL ampisilin içeren LB Orta 2 ml büyür.
5. Her plazmid DNA ile DNA miniprep kit¹⁷ ayıklamak ve klonlar tarafından DNA sıralama bir astar AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG ile onaylayın.
6. PCR yükseltmek A. thaliana TDR gen parçası kodlama artıkları sentetik bir TDR gen üzerinden 30-642 oluşturmak (ileri astar: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, geriye doğru astar: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). 0,5 mM dNTP mix, 0.2 µM astar, şablonun DNA 0.1 µg, 0.4 mM MgCl₂ve 1 tepki adet DNA polimeraz içeren DNA polimeraz tepki arabellekte 30 döngüleri için DNA yükseltmek.
   1. 30 95 ° C'de ilk denatürasyon PCR döngüsü adımlar için küme s ve sonra 30 döngüleri denatürasyon 95 ° C'de 30 s, 30 s ve uzantısına sahip bir son 5 min için 72 ° C'de 72 ° c için 1 dakika, uzantısı için 55 ° C'de tavlama.
7. PCR parçası ve yazmamalı ve BamHI kısıtlama endonükleaz enzimleri ile değiştirilmiş vektör sindirmek. Gen parça Doğrusallaştırılmış vektör ile ligate. Yöneyin Doğrusallaştırılmış DNA 400 ile mix 100 ng ng sindirilir DNA parçası T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu ve 5 adet T4 DNA ligaz içeren bir 10 µL ligasyonu tepki karışımı. 16 ° C 16 h için tepki karisimin kuluçkaya.
8. 5 µL ligasyonu karışımı DH5α yetkili hücre bir standart dönüştürme protokol sonrası 100 µL dönüştürmek ve bir ampisilin-LB agar plaka¹⁶üzerinde elde edilen kolonileri seçin. Doğru klon DNA sıralama tarafından onaylayın.

2. bir Baculovirus ifade vektör böcek Hemolin sinyal peptid bitki Protein salgılanması ifade ile modifikasyonu

1. Bir 5' BglII kesme makinası¹³, böcek hemolin salgılanması sinyal sıra ve NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI ve XhoI (Şekil 1B) ile bir çok klonlama site içeren bir DNA parçası sentez.
2. BglII ve XhoI ile DNA'ın Özeti 4 µg ve¹⁴BamHI ve XhoI ile bir ifade vektör DNA 4 µg. 1 x konsantrasyon tepki arabellek (50 mM potasyum asetat, 20 mM Tris-asetat, 10 mM magnezyum asetat ve 100 µg/mL BSA, pH 7,9 25 ° c) DNA'daki ile her Restriksiyon enzimi ile 10 birim mix ve 4 h için 37 ° C'de karışımı kuluçkaya.
   1. Eksize DNA parçası ve bir DNA jel ekstraksiyon kiti¹⁵tarafından Doğrusallaştırılmış vektör DNA arındırmak.
3. Yöneyin Doğrusallaştırılmış DNA 400 ile mix 100 ng ng sindirilir DNA parçası 1 x T4 DNA ligaz tepki arabellek (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP ve 10 mM DTT, pH 7.5 25 ° c) ve 5 adet T4 DNA içeren bir 10 µL ligasyonu tepki karışımı ligaz. 16 ° C 16 h için tepki karisimin kuluçkaya.
4. 5 µL ligasyonu karışımı DH5α yetkili hücre 100 µL dönüştürmek ve koloniler ampisilin-LB agar plaka üzerinde seçin. 5-10 kolonileri kadar almak ve 2 mL LB ortamda 100 µg/mL 220 devir/dakika ve 37 ° C 16 h için titreyen bir kuluçka ampisilin içeren her koloni büyür.
5. Plazmid DNA ile DNA miniprep kit¹⁷ ayıklamak ve klonlar tarafından DNA sıralama bir astar AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG ile onaylayın.
6. A. thaliana polen reseptör kinaz 3 (PRK3) gen parça PCR yükseltmek artıkları 20-237 sentetik bir PRK3 gen yapısı üzerinden kodlama (ileri astar: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, geriye doğru astar: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). 0,5 mM dNTP mix, 0.2 µM astar, şablonun DNA 0.1 µg, 0.4 mM MgCl₂ve 1 tepki adet DNA polimeraz içeren DNA polimeraz tepki arabellekte 30 döngüleri için DNA yükseltmek.
   1. 30 95 ° C'de ilk denatürasyon PCR döngüsü adımlar için küme s ve sonra 30 döngüleri denatürasyon 95 ° C'de 30 s, 30 s ve uzantısı için 30 72 ° C'de 55 ° C'de tavlama her döngüsü ve 5 min için 72 ° C'de son uzantısı içinde s.
7. PCR parçası ve yazmamalı ve BamHI kısıtlama endonükleaz enzimleri ile değiştirilmiş vektör sindirmek. Gen parça Doğrusallaştırılmış vektör ile ligate. Yöneyin Doğrusallaştırılmış DNA 400 ile mix 100 ng ng sindirilir DNA parçası T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu ve 5 adet T4 DNA ligaz içeren bir 10 µL ligasyonu tepki karışımı. 16 ° C 16 h için tepki karisimin kuluçkaya.
8. 5 µL ligasyonu karışımı DH5α yetkili hücre bir standart dönüştürme protokol sonrası 100 µL dönüştürmek ve bir ampisilin-LB agar plaka¹⁶üzerinde elde edilen kolonileri seçin. Doğru klon DNA sıralama tarafından onaylayın.

3. üretim ve Baculovirus amplifikasyon oluşturur rekombinant Protein ifade kaset yataklık

1. DH10Bac yetkili hücre baculovirus ifade sistem¹protokol sonrası 40 µL dönüştürmek için yapı plazmid kullanım 100 ng. 48 h 37 ° C'de dönüştürme plakaları kuluçkaya.
2. İki beyaz kolonileri her dönüştürme plaka almak, her koloni 2 mL 50 µg/mL sefaloridin, 7 µg/mL gentamisin ve 10 µg/mL tetrasiklin içeren LB orta aşılamak. Ayıklamak ve DNA bacmid doğrulamak için baculovirus ifade sistem¹ Protokolü izleyin. Aliquot her DNA 20 µL her, ile iki tüpler ve borular-20 ° C'de depolayın
   Not: Aşağıdaki adımları aseptik ameliyat gerektirir.
3. Bir monolayer Kültür medya % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 100 µg/mL (veya 100 I.U./mL) ile penisilin-streptomisin antibiyotik 27 ° C'de Sf9 hücrelerinin % 80 izdiham bir 6-şey plaka için büyür. Doku kültürü plaka üzerinde kapalı alan yüzdesini temel izdiham yüzdesini tahmin ediyoruz.
4. İki steril 1.5 mL santrifüj tüpleri aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
   1. Tüp 1: her transfection için bacmid DNA unsupplemented Sf9 hücre kültür orta antibiyotikler olmadan 100 µL içine 20 µL oranında seyreltin. Seyreltme karışımı yavaşça tüp tarafında flicking tarafından.
   2. Tüp 2: her transfection için unsupplemented Sf9 hücre kültür orta antibiyotikler olmadan 100 µL içine lipid transfection reaktif 8 µL oranında seyreltin. Seyreltme yukarı ve aşağı 6 x için pipetting tarafından iyice karıştırın.
5. İki çözüm birleştirmek, onları karışımı yavaşça yavaşça yukarı ve aşağı 3 x için pipetting tarafından ve onları 20-40 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
6. Sf9 monolayer her şey hücreleri 2 x 3 mL unsupplemented Sf9 hücre kültür orta olmadan antibiyotik ile yıkayın. Her transfection için unsupplemented Sf9 hücre kültür orta antibiyotikler olmadan 0.8 mL lipid-DNA karışımı içeren her tüpün ekleyin. Tüpler içeriğini karışımı yavaşça yavaşça yukarı ve aşağı 3 x için pipetting tarafından. Tabak yıkama medyadan Aspire edin ve transfection karışımı ile örnekleri yerleşimi.
7. Transfection karışımı eklenmesinden sonra 27 ° C'de 5 h transfected plaka kuluçkaya Tam Sf9 hücre kültür veya % 10 FBS ve 100 µg/mL (100 I.U./mL) içeren orta ile transfection ortamı değiştirin penisilin-streptomisin antibiyotik. 4 d için 27 ° C'de transfected plaka kuluçkaya.
8. Hasat ve rekombinant baculovirus yükseltmek.
   1. Süpernatant steril 15 mL konik tüp içinde virüslü plaka, kuluçka sonra 4 d toplayın. Süpernatant vasıl 1010 x g hücre artıkları kaldırmak 5 min için spin. Pelet atmak ve süpernatant temiz bir tüp için dikkatle boşaltmak ve 4 ° C ilâ 1 yıl için saklayın.
      Not: Bu P0 virüs olduğunu. Bu uzun bir süre için bölünmemeli ve-80 ° C'de depolanmış olabilir.
   2. Rekombinant her virüs yükseltmek için % 80 izdiham monolayer 150 mm tabakta Sf9 hücrelerin büyümek. Plaka medyadan Aspire edin, 2 mL P0 virüs hücreleri yapışık plaka ekleyin ve 1 h 27 ° C kuluçka plaka kuluçkaya. Orta hücre ile karıştırmak için plaka her 15dk rock.
      1. 25 mL % 10 FBS ve 100 µg/mL (veya 100 I.U./mL) içeren tam Grace'in medya ekleyin penisilin-streptomisin antibiyotik. P1 geçit virüs almak için 27 ° C kuluçka 3 d plaka kuluçkaya.
   3. Steril 50 mL konik tüp ve 1010 x g hücre artıkları kaldırmak 5 min için spin virüslü plaka süpernatant toplamak. Süpernatant temiz bir tüp için dikkatle boşaltmak ve 4 ° C ilâ 1 yıl için saklayın.
      Not: P1 virüs bölünmemeli ve saklı-80 ° C'de daha uzun bir süre için olabilir.
   4. Virüs--dan P1 P2 geçiş için yükseltmek için bir monolayer 150 mm tabakta Sf9 hücrelerinin % 90 izdiham için büyümek, medya plaka Aspire edin, P1 virüs 2 mL plaka ekleyin ve 1 h 27 ° C kuluçka için kuluçkaya.
   5. 3.8.2 ve 3.8.3 virüslerin P2 ve P3 pasajlar edinmek için adımları yineleyin. P3 virüs 2 aydan fazla tutmayın.

4. protein ifade, NiNTA ve kristalizasyon ile arıtma

1. 2 x 10⁶ 100 devirde bir 27 ° C kuluçka Shaker yoğunluğu kültür medya 100 µg/mL (veya 100 I.U./mL) ile penisilin-streptomisin antibiyotiklere Hi5 böcek hücrelerinin 1 L kültür. Spin aşağı hücreleri 570 x g 5 min için de, süpernatant dikkatle boşaltmak, 20 mL taze üretilen P3 şunun hücrelerde resuspend ve 1 h. yavaşça sarsmak için her 15 dk x 1 hücreleri resuspend için spin şişe oda sıcaklığında saklayın.
2. Hücreleri 1 litre 100 µg/mL (veya 100 I.U./mL) ile Kültür medya penisilin-streptomisin antibiyotikler, transfer 100 devirde bir 27 ° C kuluçka Shaker 72 h. Spin 1.010 x g 5 min için de hücreleri aşağı için hücre kültür ve süpernatant toplamak.
3. Kullanım pH göstergesi süpernatant 8,0 pH 0,1 M HCl veya 0.1 M NaOH ekleyerek ayarlayın ve 20 mM Tris tampon pH 8.0, 100 mM NaCl ve 5 mM imidazole içeren bir son konsantrasyonu, bağlama arabellek eklemek için şeritler. Üzerinde ifade O'nun öğesini Rekombinant protein verim tahmini göre belirli bir miktar NiNTA reçine (10-40 mL) ekleyin.
   1. Çözüm manyetik heyecan üzerinde 1 h. Yıkama için 4 ° C'de düşük hız ile reçine mix ve standart NiNTA arıtma Protokolü¹⁸takip ilişkili protein elute.
4. Saf protein iyon değiştirme için konu ve filtrasyon Kromatografi yanı sıra homojen bir örnek vermeye diğer protein saflaştırma yöntemleri jel.
   Not: TDR ectodomain için 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl kullanılan jel filtrasyon arabellek. PRK3 ectodomain için 20 mM BIS-Tris, pH 6, 100 mM NaCl tercih edilen jel filtrasyon arabellek kullanılmıştır.

Sonuçlar

Şekil 1' de gösterildiği gibi iki değiştirilmiş pFastBac1 baculovirus ifade vektörel çizimler salgılanan proteinler ile GP67 ya da hemolin sinyal sıra hedef gen içsel sinyal sırasını değiştirmek için ifade etmek için kullanılmıştır. Viral GP67 ve böcek hemolin genler hücrelerde yüksek salgı ifade düzeyleri olmasını gösterdi. Füzyon protein ile ikisinden biri bu iki sinyal sıralarının salgı ifade düzeyleri büyük ölçüde ...

Tartışmalar

Çeşitlilik içinde büyüklük ve istikrar proteinlerin biyolojik sistemlerde mevcut binlerce göz önüne alındığında, bu kez bir araştırma için ampirik laboratuvar hangi Contegra ifade sistem karar vardır belirli bir protein ifade için seçilecek. E. coli ifade sistem kez up¹⁹ölçeklemek için ilk kısa yaşam döngüsü nedeniyle protein ifade bakterilerin düşük maliyetli Kültür Medya ve göreceli kolaylığı için seçimdir. Ancak, E. coli kullanarak 60 kDa ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator shaker	VWR	Model Excella E25	27 oC
Incubator	VWR	Model 2005	27 oC
Centrifuge	BECKMAN	Model J-6	with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600677-51	For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler	BIO-RAD	Model C1000 Touch	For PCR amplification of DNA
Incubator shaker	New Brunswick Scientific	Model I 24	For growing baceria culture
Customer DNA synthesis	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Restriction Endonuclease
BglII	New England Biolabs	R0144S	Restriction Endonuclease
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restriction Endonuclease
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T	DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose	Thermo Fisher Scientific	15510-019	For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell	Invitrogen	18-258-012	For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibiotics
Tetracycline	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibiotics
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells	Thermo Fisher Scientific	10361-012	For making bacmid DNA
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362-101	Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System	Thermo Fisher Scientific	10359-016	Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Baculorirus expression vector
Sf9 cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 monolayer cells
Hi5 cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
FBS Certified	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
6-well plates	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	Flat-bottom
150 mm plates	Thermo Fisher Scientific	353025	100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1475-0511	25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1500-1211	25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA resin
pH-indicator strips	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14