Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.

Zusammenfassung

Es war eine Herausforderung für die Wissenschaftler rekombinante sekretorischen eukaryotic Proteine für strukturelle und biochemische Studien zum Ausdruck bringen. Das Baculovirus-vermittelten Insekt Ausdruck Zellsystem ist eines der Systeme verwendet, um rekombinante eukaryotic sekretorische Proteine mit einigen Post-translationalen Modifikationen auszudrücken. Die sekretorischen Proteine müssen durch die sekretorischen Wege für Protein Glycosylation, Disulfid-Bindungen-Bildung und andere Post-translationalen Modifikationen weitergeleitet werden. Um die vorhandenen Insekten Zelle Ausdruck von sekretorischen Pflanzeneiweiß zu verbessern, wird ein Baculovirus Expressionsvektor durch die Zugabe von entweder ein GP67 oder ein Hemolin Signal Peptidsequenz zwischen dem Veranstalter und Klonen von mehreren Seiten geändert. Dieses neu gestaltete modifizierte vektorsystem produziert erfolgreich eine hohe Ausbeute an löslichen recombinant sekretierten Pflanze Rezeptorproteine von Arabidopsis Thaliana. Zwei der zum Ausdruck gebrachten pflanzlichen Proteinen, die extrazellulären Domänen von Arabidopsis TDR und PRK3 Plasma Membranrezeptoren, wurden für x-ray kristallographische Untersuchungen kristallisiert. Das modifizierte vektorsystem ist ein verbessertes Werkzeug, das potentiell für die Expression rekombinanter sekretorische Proteine im Tierreich als auch verwendet werden kann.

Einleitung

Es ist unerlässlich für ein Forschungslabor in der Lage, große Mengen an homogene rekombinante Proteine für Biochemische und biophysikalische Charakterisierungen, speziell für x-ray kristallographischen Studien sein. Es gibt viele etablierte heterologen Expressionssysteme wie Escherichia coli, Hefe, Insektenzellen, Säugerzellen, Pflanzenzellen, etc. unter ihnen, das Baculovirus-vermittelten Insekt Ausdruck Zellsystem ist eines der wichtigsten häufig verwendeten Techniken, große Mengen von strukturell gefalteten großformatigen rekombinante eukaryotic Proteine für Protein Kristallisation¹produzieren.

Expressionsvektoren des Expressionssystems Baculovirus wurden entwickelt, um eine starke Polyhedrin oder P10-Promoter zu produzieren eine hohe Ausbeute an rekombinanten intrazelluläre Proteine^2,3enthalten. Um eine rekombinante Baculovirus zu machen, ist das Gen des Interesses in ein Insekt Vektor mit den Polyhedrin (Polh) Locus des Genoms Autographa Californica Multi-Nucleopolyhedroviral geklont. Das entstehende Konstrukt dann sequenziert und seine korrekte offenen Leserahmen (ORF) überprüft. Das richtige Konstrukt wird dann in die Wirtszelle Insekt durch den Prozess der Transfektion eingeführt. Das Gen des Interesses wird durch homologe Rekombination in das virale Genom eingefügt. Dieses Ereignis führt zu die Produktion von das rekombinante virale Genom, welche dann repliziert, rekombinante produzieren Virus Partikel¹treibt.

Die Insekten, die am häufigsten in Expressionssystems dienen Sf9 und hoch fünf (Hi5) Zellen sind. Sf9 Zellen eine klonale Isolat Sf21, abgeleitet aus den pupal Eierstockkrebs Zellen von Spodoptera Frugiperda, und Hi5 Zellen eine klonale isolieren die elterliche Trichoplusia ni Eierstock Zelle Zeile TN-368^4,5abgeleitet. Co Transfektionen, Virus-Verstärkung und Plaque-Assays sind auf Sf9 Zellen durchgeführt, während Hi5 Zellen in der Regel ausgewählt werden, um größere Mengen von rekombinanten Proteinen⁶zu produzieren. Es ist erwähnenswert, dass die Hi5-Zellen nicht geeignet für die Erzeugung und Verstärkung des Virus Stammarten wegen ihrer Tendenz, mutierte Viren zu produzieren. Traditionell gilt ein Temperaturbereich von 25-30 ° C gut für den Anbau von Insektenzellen. Allerdings wurde berichtet, dass 27-28 ° C die optimale Temperatur für die Insekten Zelle Wachstum und Infektion^{7,8 ist}.

Die Einführung einer starken Signal-Sequenz vor das Gen ist für die hohe Expression von die sekretierten Proteine erforderlich. Die Signalsequenz würde effizient übersetzten rekombinanten Proteins in das endoplasmatische Retikulum für Protein Sekretion und Post-translationalen Modifikationen notwendig für die korrekte Faltung und Stabilisierung³führen. Signal-Peptid-Sequenzen, wurden wie z. B. das Baculovirus Protein GP64/67, Honigbiene Melittin, und andere, umhüllen ausgewählt, um den Ausdruck des sekretorischen rekombinante Proteine in das Baculovirus-vermittelten Expression Systeme³zu erleichtern. Die Einführung der Signalpeptid des GP67 hat sich gezeigt, um den Ausdruck Ertrag eines sekretierten rekombinanten Proteins, im Vergleich mit der intrinsischen Signalpeptid des Ziel-gen⁹zu verbessern. Hemolin ist ein Hämolymphe Protein der riesigen Seide Motte Hyalophora Cecropia, Bakterien-Infektion¹⁰induziert. Die Signal-Peptid-Sequenz des Gens ist aufgrund der relativ hohen induzierten Ausdruck lässt sich Sekretion Expression rekombinanter Proteine in das Baculovirus-Insekt Zellsystem zu vermitteln.

Die A. Thaliana Tracheary Elements Differenzierung hemmenden Faktor-Rezeptor (TDR) und Pollen Rezeptor-Kinase 3 (PRK3) beide zu der Leucin-reiche Wiederholung Rezeptor-wie Kinase (LRR-RLK) Pflanzenfamilie der Proteine^{11,12 gehören} . Um die Struktur und Funktion dieser Familie der Pflanze die Rezeptor-Proteine, sowie die strukturelle und biochemische Charakterisierung von anderen abgesondert Pflanzeneiweiß zu erleichtern zu studieren, hat das Baculovirus-Insekt Zelle Ausdruck System, modifiziert Protein-Qualität und Ertrag zu verbessern. Die extrazellulären Domänen der TDR und PRK3 wurden erfolgreich mit zwei modifizierte Expressionsvektoren in dem Ausdruck Baculovirus-Insekt Zellsystem geäußert. Sowohl die extrazellulären Domänen der TDR und PRK3 Proteine haben kristallisiert. Dieser Artikel berichtet der Ausdruck und die Reinigung von großen Mengen von rekombinanten sekretierten Pflanzeneiweiß mit zwei modifizierte Baculovirus Expressionsvektoren durch den Einbau eines GP67 oder einer Hemolin Signalsequenz zwischen dem Projektträger und mehreren Klonen Seiten.

Protokoll

Hinweis: Eine Insekt Zelle/Baculovirus-System mit veränderten Expressionsvektoren sekretorischen Pflanze Proteinexpression und Kristallisation wird verwendet.

1. Änderung eines Baculovirus Ausdruck Vektors mit der GP67-Signalpeptid für Pflanze Proteinexpression Sekretion

1. Ein DNA-Fragment mit einer 5' BglII schneiden Seite¹³, die GP67 Sekretion Signalsequenz und eine Multi-Klonen Website mit NotI, BamHI EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI und XhoI (Abbildung 1A) zu synthetisieren.
   Hinweis: Da BglII und BamHI verdaut DNA führte in den gleichen Klebstoffen enden, der linearisierte Vektor kann auf das verdaute DNA-Fragment verbinden, während die BglII und BamHI Seiten nacheinander geglühten Ligatur zu einer Sequenz mutiert werden werden, die nicht von spaltbaren entweder BglII oder BamHI¹⁴.
2. Digest 4 µg DNA mit BglII und XhoI und 4 µg ein Ausdruck Vektor-DNA mit BamHI und XhoI¹⁴. Mischen Sie 10 Einheiten jedes Restriktionsenzym mit der DNA in einem 1 x Konzentration Reaktion Puffer (50 mM Kalium Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesium-Acetat und 100 µg/mL BSA, pH 7,9 bei 25 ° C) und inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 4 h.
   1. Reinigen Sie die ausgeschnittenen DNA-Fragment und den linearisierten Vektor-DNA durch eine DNA-Gel Extraction Kit¹⁵.
3. Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit 1 x T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, und 10 mM DTT, pH 7,5 bei 25 ° C) und 5 Einheiten der T4-DNA Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.
4. Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-¹⁶. Nehmen Sie 5-10 Kolonien und wachsen Sie jede Kolonie in 2 mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin bei 220 u/min und 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 16 h.
5. Extrahieren Sie jedes Plasmid DNA mit einem DNA-Miniprep Kit¹⁷ und bestätigen Sie die Klone durch DNA-Sequenzierung mit einem Primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
6. PCR-verstärken das A. Thaliana TDR gen fragment Codierung Rückstände 30-642 von einem synthetischen TDR-gen zu konstruieren (Grundierung weiterleiten: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, rückwärts-Primer: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Verstärken Sie die DNA für 30 Zyklen in einem DNA-Polymerase-Reaktion-Puffer mit einem 0,5 mM dNTP-Mix, 0,2 µM Primer, 0,1 µg der Schablone DNA, 0,4 mM MgCl₂und 1 Reaktionseinheit der DNA-Polymerase.
   1. Für die PCR-Zyklus-Schritte festlegen der anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 30 s und dann 30 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, bei 55 ° C für 30 s und Erweiterung bei 72 ° C für 1 min, mit der letzten Erweiterung bei 72 ° C für 5 min glühen.
7. Die PCR-Fragment und den modifizierten Vektor mit NotI und BamHI Einschränkung Endonuklease Enzyme zu verdauen. Verbinden Sie das Gen-Fragment mit der linearisierten Vektor. Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer und 5 Einheiten des T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.
8. Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-¹⁶. Bestätigen Sie die korrekte Klone durch DNA-Sequenzierung.

(2) Änderung des Baculovirus Ausdruck Vektor mit der Insekten Hemolin Signalpeptid für Pflanze Proteinexpression Sekretion

1. Ein DNA-Fragment mit einer 5' BglII schneiden Seite¹³, das Insekt Hemolin Sekretion Signalsequenz und eine Multi-Klonen Website mit NotI, BamHI EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI und XhoI (Abbildung 1 b) zu synthetisieren.
2. Digest 4 µg DNA mit BglII und XhoI und 4 µg ein Ausdruck Vektor-DNA mit BamHI und XhoI¹⁴. Mischen Sie 10 Einheiten jedes Restriktionsenzym mit der DNA in einem 1 x Konzentration Reaktion Puffer (50 mM Kalium Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesium-Acetat und 100 µg/mL BSA, pH 7,9 bei 25 ° C) und inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 4 h.
   1. Reinigen Sie die ausgeschnittenen DNA-Fragment und den linearisierten Vektor-DNA durch eine DNA-Gel Extraction Kit¹⁵.
3. Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit 1 x T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, und 10 mM DTT, pH 7,5 bei 25 ° C) und 5 Einheiten der T4-DNA Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.
4. Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL kompetente Zellen DH5α, und wählen Sie die Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte. Nehmen Sie 5-10 Kolonien und wachsen Sie jede Kolonie in einem 2-mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin bei 220 u/min und 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 16 h.
5. Plasmid-DNA mit einem DNA-Miniprep Kit¹⁷ extrahieren und die Klone durch DNA-Sequenzierung mit einem Primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG bestätigen.
6. PCR-verstärken A. Thaliana Pollen Rezeptor-Kinase 3 (PRK3) Gen Fragment Codierung Rückstände 20-237 aus einem synthetischen PRK3 genkonstrukt (Grundierung weiterleiten: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, rückwärts-Primer: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Verstärken Sie die DNA für 30 Zyklen in einem DNA-Polymerase-Reaktion-Puffer mit einem 0,5 mM dNTP-Mix, 0,2 µM Primer, 0,1 µg der Schablone DNA, 0,4 mM MgCl₂und 1 Reaktionseinheit der DNA-Polymerase.
   1. Für die PCR-Zyklus-Schritte festlegen der anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 30 s und dann 30 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Glühen bei 55 ° C für 30 s und Erweiterung bei 72 ° C für 30 s in jedem Zyklus, und die letzte Erweiterung bei 72 ° C für 5 Minuten.
7. Die PCR-Fragment und den modifizierten Vektor mit NotI und BamHI Einschränkung Endonuklease Enzyme zu verdauen. Verbinden Sie das Gen-Fragment mit der linearisierten Vektor. Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer und 5 Einheiten des T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.
8. Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-¹⁶. Bestätigen Sie die korrekte Klone durch DNA-Sequenzierung.

3. Produktion und Verstärkung des Baculovirus baut das rekombinante Protein Expressionskassette beherbergen

1. Einsatz 100 ng des Plasmids Konstrukt, 40 µL kompetente Zellen DH10Bac nach dem Protokoll des Baculovirus Ausdruck System¹zu verwandeln. Inkubieren Sie die Verwandlung-Platten bei 37 ° C für 48 h.
2. Zwei weiße Kolonien von jeder Transformation Platte abholen, jede Kolonie in 2 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin, 7 µg/mL Gentamicin und 10 µg/mL Tetracyclin zu impfen. Folgen Sie das Protokoll des Baculovirus Ausdruck System¹ zu extrahieren und die Bacmid DNA zu überprüfen. Aliquoten jedes DNA in zwei Röhren mit jeweils 20 µL und speichern Sie die Rohre bei-20 ° C.
   Hinweis: Die folgenden Schritte erfordern eine aseptische Operation.
3. Wachsen einer Monoschicht Sf9 Zellen in der Kultur Medien mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika bei 27 ° C bis 80 % Zusammenfluss in einem 6-Well-Platte. Schätzen Sie den Prozentsatz der Mündung ausgehend vom prozentualen Anteil der überdachte Fläche auf der Gewebekultur-Platte.
4. Bereiten Sie die folgenden Lösungen in zwei sterile 1,5 mL Zentrifuge Röhren.
   1. Röhre 1: Für jede Transfektion verdünnen Sie 20 µL Bacmid DNA in 100 µL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Mischen Sie die Verdünnung von flicking die Seite des Röhrchens vorsichtig.
   2. Rohr 2: Für jede Transfektion verdünnen Sie 8 µL Lipid Transfection Reagens in 100 µL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Mischen Sie die Verdünnung von oben und unten für 6 X pipettieren gründlich.
5. Kombinieren Sie die beiden Lösungen, mischen Sie sie sanft durch pipettieren langsam rauf und runter für 3 X und inkubieren sie 20-40 min bei Raumtemperatur.
6. Waschen jede Vertiefung der Monolage Sf9 Zellen 2 X mit 3 mL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Fügen Sie für jede Transfektion 0,8 mL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika zu jedes Röhrchen enthält die Lipid-DNA-Mischung hinzu. Mischen Sie der Inhalt der Röhren durch pipettieren langsam rauf und runter für 3 X vorsichtig. Aspirieren Sie waschen Medien von den Platten und überlagern Sie die Proben mit der Transfektion Mischung zu.
7. Nach der Zugabe der Transfektion Mischung inkubieren der transfizierten Platte für 5 h bei 27 ° C. Ersetzen Sie die Transfektion Medien mit der kompletten Sf9 Zellkulturmedium mit 10 % FBS und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika. Inkubieren Sie die transfizierte Platte bei 27 ° C für 4D.
8. Ernte und verstärken die rekombinante Baculovirus.
   1. Den überstand der infizierten Platte in ein steriles 15 mL konische Röhrchen nach 4D Inkubation abholen. Drehen Sie den Überstand bei 1010 X g für 5 min, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Verwerfen Sie das Pellet zu und Dekantieren Sie den überstand in ein sauberes Röhrchen und bewahren sie bei 4 ° C für bis zu 1 Jahr.
      Hinweis: Dies ist der P0-Virus. Es kann für einen längeren Zeitraum hinweg regelmäñig und bei-80 ° C gelagert werden.
   2. Um jede rekombinanten Virus zu verstärken, wird eine Monolage Sf9 Zellen auf eine 150-mm-Platte 80 % Zusammenfluss. Aspirieren Sie die Medien von der Platte, der Zellen-Anhänger auf die Platte 2 mL des P0 Virus hinzu und inkubieren Sie die Platte für 1 h in einem Inkubator 27 ° C. Rocken Sie die Platte alle 15 min um das Medium mit den Zellen zu mischen.
      1. Fügen Sie 25 mL des kompletten Graces Medium mit 10 % FBS und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika. Inkubieren Sie die Platte für 3-d in einem Inkubator 27 ° C, die P1-Passage-Virus zu erhalten.
   3. Sammeln des Überstands der infizierten Platte in ein steriles 50 mL konische Röhrchen und Spin 1010 X g für 5 min, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Den überstand in ein sauberes Röhrchen dekantieren und bis zu 1 Jahr bei 4 ° C lagern.
      Hinweis: Das P1-Virus kann regelmäñig und bei-80 ° C gelagert für einen längeren Zeitraum hinweg sein.
   4. Um den Virus von P1 auf P2 Passage zu verstärken, wachsen Sie einem monomolekularen Film Sf9 Zellen auf eine 150-mm-Platte zu 90 % Zusammenfluss, Aspirieren Sie die Medien der Platte, Platte 2 mL des P1-Virus hinzu, und 1 h in einem Inkubator 27 ° C inkubieren.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 3.8.2 und 3.8.3, P2 und P3 Passagen der Viren zu erhalten. Lagern Sie die P3-Virus nicht mehr als 2 Monate.

(4) Protein-Expression, Reinigung mit NiNTA und Kristallisation

1. Kultur 1 L Hi5 Insektenzellen in der Nährmedien mit 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika zu einer Dichte von 2 x 10⁶ bei 100 u/min in einem Inkubator Shaker 27 ° C. Spin-down der Zellen bei 570 X g für 5 min, Dekantieren des Überstandes, Aufschwemmen der Zellen in 20 mL des frisch hergestellten P3-Virus und bei Zimmertemperatur aufbewahren, denn 1 h. sanft schütteln Spin auf die Zellen 1 x alle 15 min aufzuwirbeln.
2. Übertragen Sie die Zellen auf 1 L von Nährmedien mit 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika, Kulturzellen bei 100 u/min in einem 27 ° C Inkubator Shaker für 72 h Spin die Zellen bei 1.010 X g für 5 min und den überstand zu sammeln.
3. Einsatz-pH-Indikator Streifen passen den pH-Wert des Überstands bis 8,0 durch Zugabe von 0,1 M HCl oder 0,1 M NaOH und Bindung Puffer auf eine Endkonzentration, mit 20 mM Tris-Puffer bei pH 8.0, 100 mM NaCl, und 5 mM Imidazol hinzufügen. Fügen Sie ein gewisses Maß an NiNTA Harz (10-40 mL) basierend auf den geschätzten Ertrag des His-Tags rekombinanten Proteins ausgedrückt.
   1. Mischen Sie die Lösung auf eine magnetische rühren bei niedriger Drehzahl bei 4 ° C für 1 h waschen das Harz und eluieren Sie gebundenen Proteins nach dem standard NiNTA Reinigung Protokoll¹⁸.
4. Vorbehaltlich der gereinigten Proteins Ionenaustausch und gel Filtration Chromatographie sowie andere Protein Reinigungsmethoden, um eine homogene Probe zu erzielen.
   Hinweis: Für die TDR ektodomäne, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl dienten als Gel Filtration Puffer. Für die PRK3 ektodomäne, 20 mM Bis-Tris, pH 6, 100 mM NaCl dienten als bevorzugte Gel Filtration Puffer.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden zwei modifizierte pFastBac1 Baculovirus Expressionsvektoren verwendet, um auszudrücken die sekretierten Proteine mit der GP67 oder der Hemolin Signalsequenz, die intrinsische Signalsequenz des Zielgens zu ersetzen. Die virale GP67 haben Insekt Hemolin Gene nachgewiesen und zu hohen Sekretion Ausdruck Niveaus in den Zellen haben. Fusionsproteine mit einem dieser beiden Signalsequenzen sollen Sekretion Ausdruck Ebenen verb...

Diskussion

Angesichts der Vielfalt in Größe und Stabilität von den Tausenden der Proteine in den biologischen Systemen vorhanden, ist es oft für eine Forschung empirische Labor zu entscheiden, welche heterologen Expressionssystem muss für den Ausdruck eines spezifischen Proteins gewählt werden. E. Coli Expressionssystems ist oft die erste Wahl für Protein-Expression durch die kurze Lebensdauer der Bakterien, low-cost der Nährmedien und relativer Leichtigkeit Scale-up¹⁹. Für den Ausdruck der...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator shaker	VWR	Model Excella E25	27 oC
Incubator	VWR	Model 2005	27 oC
Centrifuge	BECKMAN	Model J-6	with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600677-51	For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler	BIO-RAD	Model C1000 Touch	For PCR amplification of DNA
Incubator shaker	New Brunswick Scientific	Model I 24	For growing baceria culture
Customer DNA synthesis	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Restriction Endonuclease
BglII	New England Biolabs	R0144S	Restriction Endonuclease
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restriction Endonuclease
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T	DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose	Thermo Fisher Scientific	15510-019	For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell	Invitrogen	18-258-012	For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibiotics
Tetracycline	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibiotics
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells	Thermo Fisher Scientific	10361-012	For making bacmid DNA
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362-101	Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System	Thermo Fisher Scientific	10359-016	Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Baculorirus expression vector
Sf9 cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 monolayer cells
Hi5 cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
FBS Certified	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
6-well plates	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	Flat-bottom
150 mm plates	Thermo Fisher Scientific	353025	100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1475-0511	25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1500-1211	25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA resin
pH-indicator strips	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14