用水凝胶微室阵列 (HMCA) 板进行肿瘤细胞侵袭和抗转移药物筛选的分析

摘要

针对入侵检测的性能, 提出了一种基于 HMCA 的成像板。该板块有助于形成三维 (3D) 肿瘤旋转椭球体和测量癌细胞侵入细胞外基质 (ECM)。通过半自动分析实现了入侵检测的定量化。

摘要

癌症转移是已知的导致90% 的癌症致死率。转移是一个多级过程, 启动与渗透/侵入肿瘤细胞到邻近组织。因此, 入侵是转移的关键一步, 使入侵过程的研究和开发的抗转移药物, 具有非常重要的意义。为了满足这一需求, 需要开发 3D的体外模型, 以模拟实体肿瘤及其微环境的结构, 一方面最接近体内状态, 但同时具有可重现性、鲁棒性和适用于高产量和高含量测量。目前, 大多数入侵检测都依赖于成熟的微流控技术, 它们足够用于研究, 但不能用于高通量药物筛选。在每个井中使用具有独立单独旋转椭球体的板型设备的其他检测是材料消耗, 每个条件的样品尺寸都很低。目前的协议的目标是提供一个简单的和可重现的仿生3D 细胞系统, 以分析大种群肿瘤旋转椭球体的侵袭能力。我们开发了一种基于 HMCA 成像板的3D 入侵检测模型, 用于肿瘤侵袭和抗转移药物发现的研究。该器件可生产多种均匀的旋转椭球体 (每个条件下的高样本大小), 同时在单元素分辨率下连续、同时观察和测量旋转椭球体的介质抗转移药物的高通量筛选。这个平台是在这里提供的 HeLa 和 MCF7 旋转椭球体的例证单细胞和集体入侵的生产。比较了 ECM 成分透明质酸 (HA) 对旋转椭球体周围胶原的侵袭能力的影响。最后, 我们引入漆黄素 (入侵抑制剂) 对 HeLa 旋转椭球体和一氧化氮 (NO) (入侵激活剂) MCF7 旋转椭球体。通过内部软件对结果进行分析, 实现半自动、简单、快速的分析, 便于多参数检测。

引言

癌症死亡主要归因于转移细胞传播到遥远的地方。许多癌症治疗的努力重点是瞄准或预防转移性菌落的形成和系统性转移性疾病¹的进展。癌细胞迁移是肿瘤转移过程中的重要一步, 因此, 对肿瘤侵袭性叶栅的研究是非常重要的, 也是寻找抗转移治疗的前提条件。

动物模型作为研究转移性疾病的工具被发现是非常昂贵的, 并不总是代表在人类的肿瘤。此外, 细胞外微环境的拓扑结构、力学和成分对癌细胞的行为有强烈的影响²。由于体内模型本身缺乏分离和控制导致癌症侵袭和转移的特定参数的能力, 因此需要对体外模型进行可控仿生。

为了转移到遥远的器官, 癌细胞必须表现出迁徙和侵入性表型特征, 这些性状可以被治疗。然而, 由于大多数体外肿瘤模型不模仿实体肿瘤³的实际特征, 因此检测生理相关表型非常具有挑战性。此外, 在肿瘤内存在的表型异质性, 决定了在单元素分辨率下分析肿瘤迁移的必要性, 以发现表现性定向疗法, 例如, 通过靶向转移起始细胞异质肿瘤中的人口⁴。

细胞运动和集体迁移的研究主要在同质平面表面上皮细胞的单层培养中进行。这些用于癌症细胞迁移的常规细胞模型是基于通过细胞膜和 ECM 组件⁵侵入的单个细胞的种群分析, 但在这种系统中, 单个细胞之间的内在差异不能研究。通过支架或无支架微结构生成3D 旋转椭球体被认为是研究肿瘤细胞生长和肿瘤侵袭^6、7、8的一种优越手段。但是, 大多数3D 系统不适合高吞吐量格式, 并且在每个微井⁹中生成独立的单个旋转椭球体时, 通常无法实现椭球体之间的交互。最近涉及癌症迁移的研究基于微流控设备^3,10,11,12, 然而, 这些复杂的微流控工具很难生产, 不能用于抗侵入性药物的高通量筛选 (HTS)。

两种主要表型, 集体和个体细胞迁移, 在肿瘤细胞中发挥作用, 克服 ECM 屏障和入侵邻近组织, 已证明^13,14, 每个显示不同的形态学特征、生化、分子和遗传机制。此外, 在每个表型中观察到两种形式的迁移肿瘤细胞, 成纤维细胞样和变形虫。由于入侵表型和迁移模式, 主要是由形态学属性定义的, 因此需要对细胞模型进行基于成像的检测和检查所有形式的肿瘤侵袭和迁移细胞。

目前的方法的总体目标是提供一个简单和可重现的仿生 3D体外细胞系统, 以分析肿瘤旋转椭球体大种群的侵袭能力。在这里, 我们介绍了基于 HMCA 的6孔成像板用于肿瘤侵袭和抗转移治疗的研究。该技术能够在水凝胶微室 (MC) 结构中形成大量均匀的3D 肿瘤旋转椭球体 (450)。将各种 ECM 组件添加到椭球体阵列中, 以使细胞侵入周围环境。通过对同一个体旋转椭球体/入侵细胞的短期和长期观察, 对入侵过程进行持续监测, 并在任何时候促进形态学表征、荧光染色和特定旋转椭球体的检索。由于许多旋转椭球体共享空间和媒介, 通过个体旋转椭球体之间的可溶性分子相互作用及其对彼此的影响是可能的。使用内部 MATLAB 代码进行半自动图像分析, 从而能够更快、更高效地收集大量数据。该平台能够以高效的方式对众多旋转椭球体/入侵细胞进行准确、同时的测量, 从而实现对抗入侵药物的中等吞吐量筛选。

研究方案

1. HMCA 板压花

注: 本协议中使用的硅油 (PDMS) 图章和 HMCA 成像板的设计和制造的完整过程在我们前面的文章^15,16中详细介绍。PDMS 图章 (负形状) 用于浮雕 HMCA (正形), 由大约450个 MCs (图 1A) 组成。如图 1B所示, 每个 MCs 都有一个被截断的倒置方形金字塔的形状 (高度: 190 µm, 小底座面积:90 µm x 90 µm, 大底座面积: 370 µm x 370 µm)。HMCA 板用于3D 肿瘤旋转椭球体的制备和培养, 并随后用于入侵检测。或者, 商业印章可用于 HMCA 生产。

1. 准备6% 低熔点琼脂糖 (罩) 的溶液。将这一粉末和无菌磷酸盐缓冲盐水 (pbs) (0.6 g 每10毫升 pbs) 放入带磁力搅拌器的玻璃瓶中。将瓶子放在加热板上, 搅拌溶液, 加热至80摄氏度, 直到达到统一的解决方案。将解决方案保持在70摄氏度, 直到使用。
2. 将 PDMS 图章预加热到烤箱中的70摄氏度。保持温暖, 直到使用。或者, 使用商业印章并按照说明操作。
3. 将商用6孔玻璃底板放置在预热至75摄氏度的干式浴缸中。等待几分钟, 直到盘子完全暖和。
4. 倒入一滴 (400 µL) 预加热的罩在每一个孔的玻璃底部的板块。轻轻地将预加热的 PDMS 图章放在琼脂糖滴上。在室温 (RT) 下孵育, 用于预凝胶和预冷却5–10分钟。在4摄氏度孵育20分钟, 实现全琼脂糖凝胶。然后, 轻轻剥离 PDMS, 留下琼脂糖凝胶图案。
   注意: 此步骤在所有井中同时完成。
5. 将浮雕板放在配备紫外线 (UV) 灯的光固化系统中, 孵育3分钟。
   注意: 现在 HMCA 板是 UV 灭菌。
6. 用无菌 PBS 填充宏井, 确保它们保持湿润, 然后盖上盘子, 用石蜡膜包裹, 并将其储存在4摄氏度, 直到使用。
7. 使用前, 从 HMCA 板中清空 PBS 残余物。把它放在生物罩里

2. 加载单元格和椭球体形成

1. 收集细胞, 如下所示: 从10厘米培养板细胞单层中取出所有培养基, 用10毫升 PBS 洗涤两次以处理血清残差, 加入5毫升胰蛋白酶 (预热至37摄氏度), 在3摄氏度孵育孵化器37分钟。然后, 轻轻摇动板, 以确保单层剥离, 增加10毫升的完整培养基 (预热至37摄氏度) 和移液器向上和向下直到均匀细胞悬浮液达到。用15毫升新鲜培养基离心和洗涤细胞悬浮液, 然后在适当浓度下悬浮在新鲜的完整培养基中。
2. 轻轻地加载细胞悬浮液 (50 µL, 150–360 x 10³细胞/毫升在中等, ~ 16–40细胞每 MC) 在 HMCA 的顶部, 并允许细胞通过重力沉降15分钟。
3. 轻轻添加6–8等份500µL 新鲜培养基 (总3–4毫升) 到边缘的宏井塑料底部环和水凝胶阵列。
4. 在37摄氏度和 5% CO 2 中孵育 72 h 和 MCF7 细胞的 HeLa 细胞_,在旋转椭球体形成的湿润气氛中。

3. 丙啶碘化物 (PI) 染色的活性检测

1. 准备一个 pi 的股票解决方案 (每1毫升 PBS 的 pi 500 µg)。保持在4摄氏度约6月。新鲜准备稀释 1:2, 000 (0.25 µg/毫升), 通过增加6µL 的库存到12毫升的完整培养基没有苯酚红, 为6孔 HMCA 板 (2 毫升每孔)。
2. 将 HMCA 板与 48-72 h 旋转椭球体, 从孵化器到生物罩。从 HMCA 中移除所有介质, 方法是将尖端末端靠在水凝胶阵列旁边的宏井塑料底部边缘, 使阵列水箱充满介质。
3. 轻轻地添加2毫升的 PI 稀释从步骤3.1 到每个井, 通过倾斜尖端末端的边缘的宏井塑料底部。在潮湿的气氛中孵育 HMCA 板1小时, 37 摄氏度和 5% CO₂。继续执行步骤7。
   注意: 其他染料也可以在这里使用, 例如, Hoechst 核染色, 四甲基罗丹明甲酯 (TMRM) 线粒体膜电位染色, 荧光素二乙酸 (FDA) 的活细胞检测, 膜联蛋白 V 为凋亡检测和其他。

4. 胶原蛋白混合物制备

1. 用高压灭菌器制备无菌双蒸馏水 (DDW) 和100毫升1米氢氧化钠过滤灭菌溶液的库存。保持在 RT 的材料, 和用于胶原混合物制备的小贴士冷冻在-20 摄氏度, 直到使用。
2. 10–20在使用前, 放置所有 intergrades 包括: 无菌 DDW, 1 米氢氧化钠无菌溶液, 无菌 10x PBS, i 型胶原蛋白从大鼠尾巴 (储存在4°c 3–月) 和一个无菌管进入冰桶, 直到完全冷却。把冰桶放在生物罩里。
3. 准备1800µL 胶原混合物在最终浓度为3毫克/毫升, 6 孔 HMCA 侵入试验板 (300 µL 每孔) 如下。按以下顺序将 intergrades 添加到冷却管中: 515 µL DDW, 24.8 µL 1 米氢氧化钠和180µL 10x PBS。用涡流混合好, 放回冰中。最后, 将1080µL 的胶原蛋白添加到混合物中, 再次涡旋并放回冰中。

5. HA 和胶原蛋白混合物的制备

1. 溶解10毫克 HA 在2毫升的无菌 DDW。在室温下孵育混合物几分钟, 轻轻涡旋, 直到粉末完全溶解。将库存解决方案存储在4摄氏度, 长达两年。
2. 在使用前, 将 HA 库存解决方案放入生物罩内的冰桶中。
3. 如步骤4所述, 制备3毫克/毫升胶原蛋白混合物。添加36µg (7.2 µL) HA 成1800微升的准备使用胶原蛋白混合物, 最终浓度为20µg/毫升。然后, 漩涡再次短暂地放回冰。

6. ECM 混合物添加

1. 将 HMCA 板, 与 48–72 h 旋转椭球体, 从孵化器进入生物罩, 并把它放在冰上。孵育10分钟, 直到钢板冷却。在水浴中预加热1% 罩至37摄氏度的溶液。
2. 移除 HMCA 周围的所有介质, 方法是将尖端末端靠在水凝胶阵列旁边的宏井塑料底部边缘。然后, 非常小心, 从阵列罐中取出所有介质, 并带有细尖/凝胶加载尖端, 通过倾斜末端在阵列边缘, 轻轻和缓慢吸吮所有中出。
   注: 除去水凝胶阵列周围的所有介质后, 阵列罐仍充满介质。为了避免破坏水凝胶 MC 和旋转椭球体脱位, 必须轻轻移除该培养基。
3. 将150µL 胶原蛋白混合物或 HA 和胶原混合物 (ECM 混合物) 与预冷冻的细尖, 并添加到阵列罐通过附加尖端到阵列边缘。缓慢释放混合物以避免椭球体脱位。重复此步骤与另一个等分150µL, 总共300µL 每井。按照相同的步骤为每个井, 直到所有水井被填满。然后将盘子放入孵化器中, 1 小时用于 ECM 的全凝胶。
4. 完成 ecm 的全凝胶后, 移液器在 ecm 凝胶上的400µL 预热1%。用盖子盖住盘子, 然后在 RT 上孵育2分钟, 4 摄氏度, 用于琼脂糖凝胶。最后, 轻轻地添加2毫升完整的培养基通过倾斜尖端末端在宏观井塑料底部的边缘。
   注: 琼脂糖层防止胶原凝胶基质从 HMCA 分离。

7. 入侵检测的采集和分析

1. 将 HMCA 板装入带孵化器的电动倒置显微镜台上, 预调整至37摄氏度、5% CO₂和加湿气氛。
2. 预先确定每个井中图像采集的位置, 以覆盖整个阵列区域, 并使用10X 或4X 目标 (此处使用的图像采集软件需要此步骤, 请参阅下面的材料表了解详细信息)。或者, 通过选择 "施蒂希"选项, 使用任何图像采集软件来促进整个所需区域的自动扫描。
3. 获取明亮场 (BF) 图像每 2–4 h 为 24–72 h 的总周期, 以遵循入侵的细胞从椭球体进入周围的 ECM。
4. 使用专用荧光立方体 (励磁滤波器 530–550 nm、分色镜 565 nm 长通和发射滤波器 600–660 nm) 获取用于 PI 检测的荧光图像。
5. 通过使用工具栏中的"数据库"选项卡, 然后在"导出记录文件"按钮, 从图像采集软件导出延时高炉/荧光图像, 并将其保存在带标签的图像文件格式 (TIFF) 到专用文件夹中。
   注意: 我们在 MATLAB 软件中开发了一个特殊的内部分析代码, 其中包括一个设计的图形用户界面 (GUI), 入侵分析可以更快、更容易地执行。在该分析代码中, 旋转椭球体和入侵区的分割是用贝尔索过滤器半自动完成的, 其次是形态学算子的侵蚀和膨胀。在自动分割区域后, 在需要时进行手动校正以提高准确度。分段完成后, 软件自动计算一组参数, 并导出到 excel 文件以进行进一步操作。参数列表如下: 基本椭球截面面积在时间 = 0, 与椭球体相连的细胞侵入区域 = 主侵区, 与主侵区分离的细胞面积, 与主侵区分离的细胞数, 平均距离从基本的椭球体中心到主侵区和分离细胞的周长和集体入侵距离参数 = d (d = √ ((X₂ -X₁)² + (Y₂ -Y₁)²) 出x 和 y 椭球体质心坐标, 之前 (x₁, y₁) 和之后 (x₂, y₂) 集体入侵过程)。或者, 可以使用任何其他专用软件来进行图像分析。
6. 打开 GUI 并按下"加载 BF"按钮。图像打开后, 调整分割参数 (最小尺寸: > 1 和半径闭合: > 1) 以实现椭球体及其入侵区域的精确分割, 然后按"感兴趣区域 (ROI)"按钮执行和每个椭球体周围都会出现一个边框。如果自动分段不正确, 请按"删除"或"添加"按钮, 然后手动进行请求的更正。对后续图像重复相同的步骤。
7. 按"跟踪"按钮对旋转椭球体进行编号, 软件将为每个时间间隔图像中的每个椭球体分配相同的编号。然后, 按下"测量"按钮, 将生成包含所有参数的电子表格。将此电子表格保存为 excel 文件, 以便在 excel 软件的结果处理和统计中进一步使用。

结果

独特的 HMCA 成像板用于3D 肿瘤旋转椭球体的侵袭性测定。整个测试, 开始与椭球体形成和结束与入侵过程和额外的操作, 在同一板块内执行。对于椭球体的形成, HeLa 细胞被加载到阵列盆地中, 并通过重力沉降到水凝胶 MCs 中。水凝胶 MCs 具有非附着性/低附着特性, 促进细胞细胞相互作用和3D 肿瘤旋转椭球体的形成。图 2A说明了在 MCs 中解决的单元格, 使?...

讨论

据记载, 活生物体的特点是其复杂的3D 多细胞组织与常用的2D 单层培养细胞截然不同, 强调使用细胞模型更好地模仿功能的关键需要和生物药物筛选的过程。最近, 多细胞旋转椭球体、器官型文化、organoids 和片上器官已被引入⁸用于标准化药物发现。然而, 3D 多细胞模型的复杂性极大地危及了其鲁棒性、并行性和数据分析, 这对检测效率至关重要。

入侵能力的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37°C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37°C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics