Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

Resumen

Una placa de imagen basado en el HMCA se presenta para el funcionamiento de ensayo de invasión. Esta placa facilita la formación de esferoides tumorales (3D) tridimensional y la medición de la invasión de células de cáncer en la matriz extracelular (ECM). La cuantificación del ensayo de invasión se logra por análisis semiautomático.

Resumen

Metástasis del cáncer se sabe que causan el 90% de mortalidad de cáncer. La metástasis es un proceso gradual que inicia con la penetración/invasión de células tumorales en el tejido vecino. Así, la invasión es un paso crucial en metástasis, haciendo la investigación del proceso de invasión y desarrollo de fármacos anti-metastásicos, altamente significativo. Para hacer frente a esta demanda, es necesario desarrollar modelos 3D en vitro que imitan la arquitectura de tumores sólidos y su microambiente más cerca a estado en vivo en una mano, pero al mismo tiempo ser reproducibles, robusta y conveniente para alto rendimiento y alto contenidas mediciones. Actualmente, la mayoría ensayos de invasión apoyan en tecnologías de microfluidos sofisticados que son adecuadas para la investigación pero no para la detección de drogas de alto volumen. Otros ensayos utilizando dispositivos basados en placa con esferoides individuales aisladas en cada pozo son material consumo y tamaño de la muestra baja por condición. El objetivo del protocolo actual es proporcionar un sistema de celulares 3D de biomiméticos simples y reproducibles para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Se desarrolló un modelo 3D para análisis de invasión basado en la placa de proyección de imagen de HMCA para la investigación de invasión del tumor y descubrimiento de fármacos anti-metastásico. Este dispositivo permite la producción de numerosos esferoides uniforme por pocillo (tamaño de la muestra alta por condición) rodeada por los componentes del ECM, mientras continuamente y al mismo tiempo observando y midiendo los esferoides en el solo elemento de resolución por medio proyección de producción de drogas anti-metastásicas. Esta plataforma se presenta aquí por la producción de HeLa y MCF7 esferoides para ejemplificar unicelular y la invasión colectiva. Comparar la influencia de la ECM componente el ácido hialurónico (HA) en la capacidad invasiva de colágeno que rodean esferoides de HeLa. Por último, no presentamos Fisetin (inhibidor de la invasión) HeLa esferoides y óxido nítrico () (activador de invasión) a MCF7 esferoides. Los resultados son analizados por el software interno que permite el análisis semi-automático, simple y rápido que facilita el examen de múltiples parámetro.

Introducción

Muerte por cáncer se atribuye principalmente a la difusión de las células metastásicas a lugares distantes. Muchos esfuerzos en el tratamiento del cáncer se centran en objetivos o impedir la formación de colonias metastásicas y progresión de la enfermedad metastásica sistémica¹. Migración de la célula de cáncer es un paso crucial en el proceso de metástasis de tumor, por lo tanto, la investigación de la cascada de invasión del cáncer es muy importante y un requisito previo a la búsqueda de terapias anti-metastásico.

El uso de modelos animales como herramientas para el estudio de enfermedad metastásica se ha encontrado para ser muy costoso y no siempre representativa del tumor en los seres humanos. Por otra parte, la topología de microambiente extracelular, mecánica y composición afectan fuertemente cáncer célula comportamiento². En vivo modelos intrínsecamente carecen de la habilidad de separar y controlar estos parámetros específicos que contribuyen a la invasión del cáncer y la metástasis, es necesario para biomiméticos controlable en vitro modelos.

Para metastatizar a órganos distantes, las células cancerosas deben exhibir rasgos fenotípicos invasivos y migratorios que pueden ser destinados a la terapia. Sin embargo, puesto que la mayoría en vitro modelos de cáncer no imitar las reales características de tumores sólidos³, es muy difícil detectar fenotipos fisiológicamente relevantes. Además, la heterogeneidad fenotípica que existe dentro del tumor, dicta la necesidad de analizar la migración del tumor en el solo elemento de resolución para descubrir terapias dirigidas por fenotipo, por ejemplo, apuntando a la celda de inicio de la metástasis población dentro de los tumores heterogéneos⁴.

El estudio de la motilidad celular y la migración colectiva se lleva a cabo principalmente en cultivos monocapa de células epiteliales en las superficies planas homogéneas. Estos modelos celulares convencionales de migración de la célula de cáncer se basan en el análisis de la población de células invasoras a través de las membranas y componentes de ECM⁵, pero en estos sistemas, las diferencias intrínsecas entre las células individuales no pueden ser estudió. Generación 3D esferoides mediante andamios o en micro-estructuras de andamio-libre se considera como un superior significa estudiar el tumor de la célula crecimiento y cáncer invasión^6,7,8. Sin embargo, la mayoría de los sistemas 3D no son adecuados a los formatos de alto rendimiento y esferoide entre interacción generalmente no puede lograrse desde esferoides individuales aisladas se generan en cada micro pozo⁹. Estudios recientes que involucran la migración del cáncer se basan en dispositivos microfluídicos^3,10,11,12, sin embargo, estos sofisticación microfluídicos herramientas son difíciles de producir y no puede ser utilizado para alto rendimiento (HTS) de detección de drogas anti-invasivas.

Dos fenotipos principales, migración de la célula individual y colectiva, que juegan un papel en las células del tumor superando la barrera de ECM e invadiendo tejidos vecinos, han demostrado^13,14, cada uno mostrando distintos morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares y genéticos. Además, dos formas de migración de las células de tumor, fibroblasto-como y ameboides, se observan en cada fenotipo. Desde ambos, fenotipos de invasión y modos de la migración, principalmente se definen por las características morfológicas, hay una necesidad para celulares modelos que permiten basado en proyección de imagen de detección y examen de todas las formas de invasión tumoral y la migración de las células.

El objetivo general del método actual es proporcionar un simple y reproducible biomiméticos 3D en vitro sistema basadas en células para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Aquí, presentamos la base de HMCA 6 imagen placa de pozos para la investigación de invasión del tumor y terapia anti-metastásica. La tecnología permite la formación de un gran número de esferoides tumorales 3D uniforme (450 por pozo) en una estructura de micro-cámaras (MC) de hidrogel. Varios componentes de la ECM se añaden a la matriz de esferoide para permitir la invasión de las células en el entorno. Proceso de invasión es continuamente supervisado por observación de corto y largo plazo de las mismas células esferoides individuales/invadiendo y facilita la caracterización morfológica, tinción fluorescente y recuperación de esferoides específicos en cualquier momento. Puesto que numerosos esferoides comparten espacio y medio, interacción a través de moléculas solubles entre esferoides individuales y su impacto el uno del otro es posible. Análisis de semi-automática de la imagen se realizan utilizando interno código MATLAB que permite la más rápida y eficaz recopilación de gran cantidad de datos. La plataforma facilita la medición precisa y simultánea de numerosas células esferoides/invadiendo de manera eficiente, permitiendo la proyección del rendimiento medio de los medicamentos de lucha contra la invasión.

Protocolo

1. HMCA placa repujado

Nota: El proceso completo para el diseño y fabricación de sello de polidimetilsiloxano (PDMS) y HMCA imagen usada en este protocolo se describe en detalle en nuestros anteriores artículos^15,16. El sello PDMS (forma negativa) se utiliza para realzar el HMCA (forma positiva) que consiste en aproximadamente 450 MCs por pozo (figura 1A). Como se muestra en la figura 1B, cada uno de los MCs tiene forma de una pirámide truncada de forma cuadrada boca abajo (altura: 190 μm, pequeña base: 90 μm μm x 90 y gran área de la base: 370 μm μm x 370). La placa HMCA se utiliza para la preparación y cultivo de esferoides 3D del tumor y después de eso, para ensayo de invasión. Por otra parte, un sello comercial podría utilizarse para la producción de HMCA.

1. Preparar una solución de agarosa de fusión baja 6% (LMA). Introduzca el polvo de la LMA y el tampón de fosfato estéril salino (PBS) (0,6 g de LMA por 10 mL de PBS) en un frasco de vidrio con un agitador magnético. Coloque la botella en una placa de calentamiento y agitar la solución durante el calentamiento a 80 ° C por unas horas hasta que se logre una solución uniforme. No la solución a 70 ° C hasta su uso.
2. Calentar previamente el sello PDMS para 70 ° C en el horno. Mantener caliente hasta su utilización. Alternativamente, utilice una marca comercial y siga las instrucciones.
3. Coloque las placas de comercial pozo 6-fondo de cristal en un baño seco precalentado a 75 ° C. Espere unos minutos hasta que la placa esté totalmente caliente.
4. Vierta una gota (400 μL) de la LMA precalentado en la parte inferior del cristal de cada uno de los pozos de la placa. Coloque suavemente el sello PDMS precalentado sobre la caída de la agarosa. Incubar a temperatura ambiente (RT) por 5-10 min para la gelificación y la prerefrigeración. Incubar a 4 ° C por 20 min lograr la gelificación de agarosa completo. Luego, suavemente Retire el PDMS, dejando el gel de agarosa estampado con MCs.
   Nota: Este paso se realiza simultáneamente en todos los pozos.
5. Colocar la placa realzada en una sistema equipado con lámpara ultravioleta (UV) de polimerización e incubar durante 3 minutos.
   Nota: Ahora la placa HMCA es esterilizado UV.
6. Llenar los pozos de macro con PBS estéril para asegurar que se mantienen húmedos, luego cubra la placa, envuélvalo con parafilm y almacenar a 4 ° C hasta su uso.
7. Antes de usar, vaciar residuos de PBS de la placa HMCA. Lugar en la capilla biológica.

2. carga de células y formación esferoide

1. Recoger las células como sigue: Retire Media todos de una monocapa de células de la placa 10 cm cultura, lavar dos veces con 10 mL de PBS para eliminar residuos de suero, añadir 5 mL de tripsina (previamente calentado a 37 ° C) e incube durante 3 min en la incubadora a 37 ° C. Luego, agitar la placa suavemente para asegurar el desprendimiento de la monocapa, añadir 10 mL de medio completo (previamente calentado a 37 ° C) y la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta logra una suspensión homogénea. Centrifugar y lavar la suspensión con 15 mL de medio fresco, entonces, suspender en concentraciones apropiadas en el medio completo fresco.
2. Suavemente la suspensión de células de carga (50 μL, 150-360 x 10³ células/mL en medio, ~ 16 – 40 células por MC) en el HMCA y permitir a las células a asentarse por gravedad durante 15 minutos.
3. Suavemente agregar 6-8 alícuotas de 500 μl de medio fresco (total 3-4 mL) en el borde de la parte inferior plástico macro-bien fuera de la matriz de anillo y de hidrogel.
4. Incubar las células HeLa por 72 h y células MCF7 durante 48 h a 37 ° C y 5% CO_2, en un ambiente humidificado para la formación de esferoides.

3. viabilidad detección por yoduro de propidio (PI) tinción

1. Preparar una solución stock de PI (500 μg de PI por cada 1 mL de PBS). Mantener a 4 ° C durante aproximadamente 6 meses. Recién preparar una dilución de 1:2,000 (0.25 μg/mL), mediante la adición de 6 μl de caldo a 12 mL de medio completo sin rojo de fenol, la placa de la pozo 6 HMCA (2 mL por pozo).
2. Transferencia de la placa HMCA con esferoides de 48-72 h, de la incubadora a la campana biológica. Retire todo medio del HMCA por la punta, apoyado en el borde inferior plástico macro-bien al lado de la matriz de hidrogel, dejando el depósito de la matriz llena de medio.
3. Suavemente agregar 2 mL de dilución de PI de paso 3.1 a cada pocillo, la punta, apoyado en el borde de la parte inferior de plástico macro-bien. Incube la placa HMCA por 1 h a 37 ° C y 5% CO₂, en un ambiente humidificado. Continúe con el paso 7.
   Nota: Otros tintes podrían utilizarse aquí, así, por ejemplo, Hoechst para tinción del núcleo, tetramethylrhodamine metil éster (TMRM) para el potencial de membrana mitocondrial tinción fluoresceína diacetato (FDA) para la detección de células vivas, anexina V de apoptosis detección y otros.

4. preparación de la mezcla colágeno

1. Preparar agua bidestilada estéril (DDW) por autoclave y un stock de 100 mL de solución de 1 M NaOH filtro esterilizado. Mantener los materiales en el RT y las puntas utilizadas para la preparación de la mezcla de colágeno congelado a-20 ° C, hasta su uso.
2. 10 – 20 minutos antes de usar, coloque todos los intergrades incluyendo: DDW estéril, solución estéril de 1 M NaOH, estéril 10 x PBS, colágeno de cola de rata (almacenado a 4 ° C durante 3 – meses) y un tubo estéril de tipo I en el cubo de hielo hasta que enfríe totalmente. Coloque el cubo de hielo dentro de la campana biológica.
3. Preparar 1.800 μl de mezcla de colágeno a una concentración final de 3 mg/mL, 6 bien placa de ensayo de invasión de HMCA (300 μL por pozo) como sigue. Añadir los intergrades en el tubo de enfriado en el siguiente orden: 515 μl de DDW, 24,8 μl de 1 M NaOH y 180 μl de PBS 10 x. Homogeneizar bien vortex y en el hielo. Por último, añadir μl de 1080 de colágeno a la mezcla, vortex nuevo y coloque en hielo.

5. HA y preparación de la mezcla de colágeno

1. Disolver 10 mg de HA en 2 mL de DDW estéril. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante unos minutos y agitar suavemente hasta que el polvo se disuelva totalmente. Almacenar la solución a 4 ° C hasta por dos años.
2. Justo antes del uso, coloque la solución HA en el cubo de hielo dentro de la campana biológica.
3. Preparar un 3 mg/mL de mezcla de colágeno como se describe en el paso 4. Añadir 36 μg (7.2 μL) de la HA en 1.800 μL de listo para usar mezcla de colágeno, para una concentración final de 20 μg/mL. Luego, mezclar otra vez brevemente y puesto en hielo.

6. Además de la mezcla ECM

1. La placa HMCA, con esferoides de 48 – 72 h, la transferencia de la incubadora en la campana biológica y coloque en el hielo. Incubar por 10 min hasta que la placa se enfría. Caliente previamente una solución de 1% LMA a 37 ° C en un baño de agua.
2. Quitar todo medio de alrededor de HMCA, inclinándose la punta en el borde inferior plástico macro-bien al lado de la matriz de hidrogel. Entonces, con mucho cuidado, saque medio todos el depósito de matriz con un fino gel punta carga punta, por la punta, apoyado en el borde de la matriz, lenta y suavemente chupar medio todo hacia fuera.
   Nota: Después de quitar todo medio de alrededor de la matriz de hidrogel, el depósito de matriz está lleno todavía de medio. Este medio tiene que ser eliminado muy suavemente para evitar destrucción de hidrogel MC y dislocación de esferoides.
3. 150 μL de la mezcla de colágeno o colágeno y HA mezcla (mezcla de ECM) con la punta fina precongelada y añadir en el depósito de matriz colocando la punta en el borde de la matriz. Lanzamiento de la mezcla lentamente para evitar la dislocación del esferoide. Repita este paso con otra alícuota de 150 μL, para un total de 300 μL por pocillo. Siga el mismo procedimiento para cada bien hasta que todos los pozos están llenos. Luego coloque la placa en la incubadora durante 1 h para la completa gelificación del ECM.
4. Después de que se ha logrado la completa gelificación del ECM, pipetee 400 μL de precalentado 1% LMA en la parte superior del gel de la ECM. Cubra la placa con su tapa, incubar la placa a temperatura ambiente durante 5-7 min y 2 min a 4 ° C, para la gelificación de agarosa. Finalmente, agregar 2 mL de medio completo suavemente por la punta, apoyado en el borde de la parte inferior de plástico macro-bien.
   Nota: La capa de agarosa previene el desprendimiento de la matriz de gel de colágeno de la HMCA.

7. Análisis y adquisición de ensayo invasión

1. Carga de la placa HMCA sobre un motor invertido platina del microscopio equipado con una incubadora, previamente ajustada a 37 ° C, 5% CO₂ y ambiente humidificado.
2. Averiguar las posiciones para la adquisición de la imagen en cada uno así para cubrir la zona de toda serie y utilizan 10 X y objetivos de X 4 (este paso es necesario para el software de adquisición de imagen usado aquí, vea la Tabla de materiales abajo para más detalles). Como alternativa, utilice cualquier software de adquisición de imagen para facilitar la exploración automática de toda la zona requerida, seleccionando la opción"Stich" .
3. Adquirir imágenes de campo claro (BF) cada 2-4 h durante un período total de 24-72 h para la invasión de las células del cuerpo esferoide en el ECM circundante.
4. Adquisición de imágenes fluorescentes para la detección de PI utilizando un cubo fluorescente dedicado (filtro 530 – 550 nm de excitación, espejo dicroico 565 nm largo pase y emisión filtro 600-660 nm).
5. Exportar imágenes BF/fluorescente Time-lapse desde el software de adquisición de imagen y guardarlos en formato de archivo de imagen etiquetado (TIFF) en una carpeta dedicada mediante la ficha "Base de datos" en la barra de herramientas y luego en el botón "Exportar archivos de registro" .
   Nota: Hemos desarrollado un código de análisis interno especial en el software MATLAB que incluye una interfaz de diseño gráfica de usuario (GUI) en que la invasión análisis podrían ejecutarse más rápido y más fácil. En este código de análisis, se realiza la segmentación de la zona de invasión y esferoides semiautomática utilizando filtro de Sobel, seguido de los operadores morfológicos de erosión y dilatación. Después de segmentación automática de las zonas, se hicieron correcciones manuales donde sea necesario para mejor precisión. Después de la terminación de la segmentación, un conjunto de parámetros fueron calculados por el software y automáticamente exportado a un archivo de excel para su manipulación posterior. La lista de parámetros son: área seccional esferoide básica en tiempo = 0, zona de invasión de las células conectado al cuerpo esferoide = zona de invasión principal, área de células separadas del área de invasión principal, número de células separadas del área de invasión principal, distancia media de invasión de esferoide básica centro de masa a la circunferencia de la zona de invasión principal y separado de las células y parámetro de distancia de invasión colectiva = d (d = √ ((X₂ - X₁)² + (Y₂ - Y₁)²) de la Coordenadas X e Y esferoide centro de masa, antes (X₁, Y₁) y después (X₂, Y₂) proceso de invasión colectiva). Por otra parte, análisis de imagen podrían hacerse con cualquier otro software especializado.
6. Abrir la interfaz gráfica y pulse el botón "carga BF" . Después de abierta la imagen, ajustar los parámetros de segmentación (tamaño mínimo: > 1 y radio cierran: > 1) para lograr una segmentación precisa de esferoide y su área de invasión, a continuación, pulsa el botón de "Región de segmentación de interés (ROI)" para la ejecución y aparece un borde alrededor de cada esferoide. Si la segmentación automática es incorrecta, pulse el botón "Borrar" o "Agregar" y hacer las correcciones solicitadas manualmente. Repita los mismos pasos para las siguientes imágenes.
7. Presione el botón "Seguimiento" a los esferoides y el software asignará al mismo número para cada esferoide en cada una de las imágenes de lapso de tiempo. Luego, presione el botón de "Medición" , que generará una hoja de cálculo con todos los parámetros. Guarde esta hoja de cálculo como un archivo de excel para uso posterior en los resultados de procesamiento y estadísticas en excel software.

Resultados

El único HMCA placa de la proyección de imagen se utiliza para el ensayo de invasión de esferoides tumorales 3D. El ensayo completo, comenzando con la formación esferoide y terminando con el proceso de invasión y manipulación adicional, se realiza en el mismo plato. Para la formación esferoide, células HeLa se cargan en la cuenca de la matriz y se instalan en el hidrogel MCs por gravedad. El hidrogel MCs, que tienen características de adherente/bajo sujeción, facilitar la intera...

Discusión

Está bien documentado que los organismos vivos, caracterizados por su compleja organización multicelular 3D son muy distintos de las células de la monocapa 2D utilizados cultivada, haciendo hincapié en la crucial necesidad de utilizar modelos celulares que mejor imitan las funciones y procesos de un organismo vivo para drogas. Recientemente, esferoides multicelulares, culturas organotypic, organoides y órganos-en-un-chip han sido introducidas⁸ para el uso en el descubrimiento de fármacos est...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37°C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37°C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics