Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

Resumo

Uma placa de imagem baseada em HMCA é apresentada para o desempenho do ensaio de invasão. Este prato facilita a formação de esferoides tridimensional (3D) tumor e a medição da invasão de células de câncer na matriz extracelular (ECM). A quantificação de ensaio de invasão é conseguida análise semiautomático.

Resumo

Metástase do cancro é conhecido por causar a 90% de letalidade do câncer. Metástase é um processo de várias fases que se inicia com a penetração/invasão de células tumorais no tecido vizinho. Assim, a invasão é um passo crucial na metástase, tornando a invasão processo de pesquisa e desenvolvimento de drogas antimetastáticos, altamente significativo. Para atender a essa demanda, há uma necessidade de desenvolver modelos 3D em vitro que imitam a arquitetura de tumores sólidos e seu microambiente mais estreitamente para o vivo estado por um lado, mas ao mesmo tempo ser reprodutível, robusto e apropriado para alto rendimento e altas conteúdas medições. Atualmente, a maioria dos ensaios de invasão inclinar-se em tecnologias sofisticadas microfluidic adequados para pesquisa, mas não para triagem de drogas de alto volume. Outros ensaios usando dispositivos baseados em placa com esferoides individuais isolados em cada poço estão consumindo material e tem o tamanho de amostra baixa por condição. O objetivo do protocolo atual é fornecer um sistema simples e reprodutível biomimetic 3D baseados em células para a análise da capacidade de invasão em grandes populações de esferoides de tumor. Desenvolvemos um modelo 3D para ensaio de invasão com base na placa da imagem latente de HMCA para a pesquisa de invasão do tumor e descoberta de drogas antimetastático. Este dispositivo permite a produção de numerosos esferoides uniformes por alvéolo (tamanho da amostra alta por condição) rodeado por componentes de ECM, enquanto continuamente e simultaneamente observar e medir os esferoides em resolução de elemento único para o meio seleção da produção de drogas antimetastáticas. Esta plataforma é aqui apresentada pela produção de esferoides HeLa e MCF7 para exemplificando unicelulares e invasão coletiva. Comparamos a influência do ácido hialurônico componente ECM (HA) sobre a capacidade invasiva de colágeno ao redor HeLa esferoides. Finalmente, não apresentamos Fisetin (inibidor de invasão) para HeLa esferoides e óxido nítrico () (ativador de invasão) para MCF7 esferoides. Os resultados são analisados pelo software interno que permite a análise semiautomático, simples e rápido, que facilita a análise multiparâmetro.

Introdução

Morte por cancro é atribuído principalmente à divulgação de células metastáticas para locais distantes. Muitos esforços no tratamento do câncer enfocam segmentação ou impedindo a formação de colônias metastáticas e progressão da doença metastática sistêmica¹. Migração de células de câncer é um passo crucial no processo de metástase de tumor, assim, a pesquisa de cascata de invasão de câncer é muito importante e um pré-requisito para encontrar terapêutica antimetastática.

O uso de modelos animais como ferramentas para estudar doença metastática foi encontrado para ser muito caro e não sempre representativa do tumor em seres humanos. Além disso, a topologia do microambiente extracelular, a mecânica e a composição afetam fortemente câncer célula comportamento². Desde que na vivo modelos inerentemente faltam de capacidade para separar e controlar tais parâmetros específicos que contribuem para a invasão do câncer e metástase, há uma necessidade de biomimetic controlável em vitro modelos.

Fim de metástase para órgãos distantes, as células cancerosas devem apresentar traços fenotípicos migratórios e invasivos que podem ser direcionados para a terapia. No entanto, desde que a maioria em vitro câncer de modelos não imitar as características reais de tumores sólidos³, é muito difícil de detectar fenótipos fisiologicamente relevantes. Além disso, a heterogeneidade fenotípica que existe dentro do tumor, dita a necessidade de analisar a migração do tumor em resolução de elemento único para descobrir terapias fenótipo-dirigido, por exemplo, pela segmentação da célula de metástase-iniciando população no tumores heterogêneos⁴.

O estudo da motilidade celular e migração coletiva é realizado principalmente em culturas de monocamadas de células epiteliais em superfícies planas homogêneas. Estes modelos de celulares convencionais para a migração de células de câncer são baseados sobre a análise da população de células individuais, invadindo através das membranas e ECM componentes⁵, mas em tais sistemas, as diferenças intrínsecas entre células individuais não podem ser estudou. Geração 3D esferoides através de andaimes ou em microestruturas de andaime-livre é considerado como um superior significa estudar o tumor de células crescimento e câncer invasão^6,7,8. No entanto, mais sistemas 3D não são adequados para formatos de alta produtividade e interação inter esferoide geralmente não pode ser alcançada desde esferoides individuais isolados são gerados em cada micropoço de⁹. Estudos recentes, envolvendo a migração de câncer são baseados em microfluidic dispositivos^3,10,11,12, no entanto, estas sofisticadas microfluidic ferramentas são difíceis de produzir e não pode ser usado para alto throughput screening (HTS) de drogas anti-invasivas.

Dois principais fenótipos, migração de células individuais e coletivas, que desempenham um papel nas células tumorais, superar a barreira de ECM e invadir tecidos vizinhos, tem sido demonstrada^13,14, cada exibindo distintas morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares e genéticos. Além disso, duas formas de migração células tumorais, como fibroblasto e ameboides, são observadas em cada fenótipo. Desde ambos, invasão fenótipos e modos de migração, principalmente são definidos pelas propriedades morfológicas, há uma necessidade para celular modelos essa detecção baseada em imagem de habilitar e exame de todas as formas de invasão do tumor e a migração de células.

O objectivo geral do método atual é fornecer um sistema simples e reprodutível biomimetic 3D em vitro baseados em células para a análise da capacidade de invasão em grandes populações de esferoides de tumor. Aqui, apresentamos a baseado no HMCA 6 imagem placa para a investigação de invasão do tumor e terapia antimetastática. A tecnologia permite a formação de um grande número de esferoides uniforme tumor 3D (450 por alvéolo) em uma estrutura de microcâmaras (MC) de hidrogel. Vários componentes de ECM são adicionados para a matriz de esferoide para permitir a invasão das células para o meio ambiente. Processo de invasão é continuamente monitorado pela observação de curto e longo prazo das células individuais de esferoides/invadir mesmo e facilita a caracterização morfológica, coloração fluorescente e recuperação de esferoides específicos em qualquer ponto. Desde numerosos esferoides compartilham o espaço e meio, interação através de moléculas solúveis esferoides individuais e seu impacto na outra é possível. Análise de imagem semiautomática é executada usando in-house código MATLAB que possibilita mais rápida e eficiente coleta de grande quantidade de dados. A plataforma facilita a medição exata, simultânea de numerosas células esferoides/invadindo de forma tempo-eficiente, permitindo o rastreio com throughput médio de drogas anti-invasão.

Protocolo

1. HMCA placa de gravação

Nota: O processo completo para a concepção e fabricação de polidimetilsiloxano (PDMS) carimbo e placa de imagem HMCA, utilizados neste protocolo é descrito em detalhes em nossos artigos anteriores de^15,16. O carimbo PDMS (forma negativa) é usado para imprimir o HMCA (forma positiva), que consiste de cerca de 450 MCs por alvéolo (figura 1A). Conforme demonstrado na figura 1B, cada um dos MCs tem uma forma de uma pirâmide truncada de quadrada de cabeça para baixo (altura: 190 µm, pequena área de base: 90 µm x 90 µm e grande área de base: 370 µm x 370 µm). A placa do HMCA é usada para a preparação e cultivo de esferoides tumor 3D e, posteriormente, para o ensaio da invasão. Alternativamente, um selo comercial poderia ser usado para a produção de HMCA.

1. Prepare uma solução de 6% de agarose de derretimento baixo (LMA). Inserir a LMA pó e soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS) (0,6 g de LMA por 10 mL de PBS) em um frasco de vidro com um agitador magnético. Coloque a garrafa em um prato de aquecimento e agitar a solução durante o aquecimento a 80º C por algumas horas até que seja alcançada uma solução uniforme. Manter a solução a 70 ° C até o uso.
2. Pré-aquece o carimbo PDMS para 70 ° C no forno. Mantê-lo aquecido até o uso. Como alternativa, usar um carimbo comercial e siga as instruções.
3. Colocar as placas de comercial baixo vidro 6-poços em um banho seco, pre-aquecido a 75 ° C. Aguarde alguns minutos até que a placa esteja totalmente quente.
4. Despeje uma gota (400 µ l) de LMA pré-aquecido no fundo de cada um dos poços da placa de vidro. Coloque delicadamente o carimbo PDMS pré-aquecido durante a queda de agarose. Incube a temperatura ambiente (RT) por 5-10 min para pre-coagulação e pré-resfriamento. Incube a 4 ° C por 20 min alcançar a gelificação de agarose completo. Em seguida, delicadamente Retire o PDMS, deixando o gel de agarose estampado com MCs.
   Nota: Este passo é feito simultaneamente em todos os poços.
5. Colocar a placa em alto-relevo em um sistema equipado com lâmpada de ultravioleta (UV) de fotopolimerização e incube por 3 min.
   Nota: Agora a placa HMCA é UV esterilizado.
6. Preencha os macropoços com PBS estéril para garantir que eles são mantidos úmidos, em seguida, cobrem a placa, envolvê-la com parafilm e armazená-lo em 4 ° C até o uso.
7. Antes da utilização, vazios residuais de PBS da placa HMCA. Coloque a capota biológica.

2. carregar células e formação de esferoide

1. Coletar as células da seguinte forma: remover todas as médias de uma monocamada de células 10 cm placa de cultura, duas lavagens com 10 mL de PBS para descarte de resíduos de soro, adicionar 5 mL de tripsina (pré aquecida a 37 ° C) e incube por 3 min em incubação a 37 ° C. Em seguida, agite a placa suavemente para garantir destacamento monocamada, adicionar 10 mL de meio completo (pré aquecido a 37 ° C) e pipeta acima e para baixo até alcançar a suspensão homogênea de células. Centrifugar e lavar a suspensão de células com 15 mL de meio fresco, então, suspender em concentrações adequadas no meio fresco completa.
2. Delicadamente, carregar a suspensão de eritrócitos (50 µ l, 150 – 360 x 10³ células/mL, em média, 40 – ~ 16 células por MC) em cima do HMCA e permitir que as células a se contentar com 15 min pela gravidade.
3. Delicadamente adicione 6 – 8 alíquotas de meio fresco 500 µ l (total 3 – 4 mL) até a borda do plástico macropoço fundo fora do anel e hidrogel array.
4. Incube as células HeLa por 72 h e as células MCF7 por 48 h a 37 ° C e 5% CO_2, em um ambiente umidificado para a formação de esferoides.

3. viabilidade deteção pelo iodeto de Propidium (PI) de coloração

1. Prepare uma solução stock de PI (500 µ g de PI por 1 mL de PBS). Mantê-lo em 4 ° C por cerca de 6 meses. Recentemente, prepare uma diluição de 1:2,000 (0,25 µ g/mL), pela adição de 6 µ l de estoque para 12 mL de meio completo sem vermelho de fenol, para placa HMCA o 6 (2 mL por bem).
2. Transfira a placa HMCA com esferoides de 48-72 h, da incubadora biológica capota. Remova o HMCA médio todos apoiando a ponta na borda do fundo plástico macrobem ao lado da matriz de hidrogel, deixar o tanque de matriz repleta de médio.
3. Delicadamente adicione 2 mL de diluição de PI de passo 3.1 para cada poço, apoiando a ponta na borda do plástico macrobem fundo. Incube a placa HMCA para 1 h a 37 ° C e 5% CO₂, em um ambiente umidificado. Vá para a etapa 7.
   Nota: Outros corantes poderiam ser usados aqui, bem como, por exemplo, Hoechst para coloração do núcleo, diversos éster metílico (TMRM) para o potencial de membrana mitocondrial, coloração, diacetato de fluoresceína (FDA) para a deteção de células vivas, anexina V para apoptose detecção e outros.

4. preparação de mistura de colágeno

1. Prepare água bidestilada estéril (DDW), autoclave e um estoque de 100 mL de solução de filtro-esterilizados de NaOH 1 M. Manter os materiais em RT e as pontas, usadas para a preparação de mistura de colágeno congelada a-20 ° C, até o uso.
2. 10 – 20 min antes do uso, coloque qual todos incluindo: DDW estéril, 1 M NaOH solução estéril, estéril 10 x PBS, colágeno tipo I de rabo de rato (armazenadas a 4 ° C, por 3-meses) e um tubo estéril para o balde de gelo até totalmente refrigerado. Coloque o balde de gelo dentro do capô biológico.
3. Prepare-se 1.800 µ l da mistura de colágeno em uma concentração final de 3 mg/mL, para 6 HMCA invasão ensaio placa (300 µ l por alvéolo) como se segue. Adicionar o qual o tubo de refrigeração na seguinte ordem: 515 µ l de DDW, 24,8 µ l de 1 M de NaOH e 180 µ l de PBS 10x. Mistura bem pelo vórtice e lugar para o gelo. Finalmente, adicione 1080 µ l de colágeno à mistura, vórtice novamente e volte a colocar no gelo.

5. HA e preparação de mistura de colágeno

1. Dissolva 10 mg de HA em 2 mL de DDW estéril. Incube a mistura a RT por alguns minutos e vórtice suavemente até que o pó é totalmente dissolvido. Armazene a solução a 4 ° C por até dois anos.
2. Bem antes de usar, coloca a solução estoque HA no balde de gelo dentro do capô biológico.
3. Prepare um 3 mg/mL de mistura de colágeno conforme descrito na etapa 4. Adicione 36 µ g (7.2 µ l) de HA em 1.800 μL de pronto a usar mistura de colágeno, para uma concentração final de 20 µ g/mL. Então, vórtice novamente brevemente e colocar de volta no gelo.

6. ECM mistura adição

1. Transferir a placa do HMCA, com esferoides de 48-72 h, da incubadora ao subúrbio biológica e colocá-lo no gelo. Incube durante 10 minutos até que a placa é resfriada. Pré-aquecer uma solução de 1% LMA a 37 ° C em banho-maria.
2. Remova todos os meio ao redor do HMCA, apoiando a ponta na borda do fundo plástico macrobem ao lado da matriz de hidrogel. Então, cuidadosamente, remova todos os meio do tanque de matriz com um ponta bem/gel carregando ponta, apoiando a ponta na borda da matriz, suavemente e lentamente sugando tudo meio fora.
   Nota: Depois de remover todos os meio ao redor da matriz de hidrogel, o tanque de matriz ainda está cheio de médio. Este meio tem que ser removido muito suavemente para evitar a destruição do hidrogel MC e luxação de esferoides.
3. Leve 150 µ l da mistura de colágeno ou mistura HA e de colágeno (mistura de ECM) com a ponta fina pre-congelada e adicionar no tanque de matriz, anexando a ponta para a borda da matriz. Libere a mistura lentamente para evitar luxação esferoide. Repita este passo com outra alíquota de 150 µ l, para um total de 300 µ-l por bem. Siga o mesmo procedimento para cada poço, até que todos os poços estão cheios. Em seguida coloque a placa na incubadora para 1 h para a gelificação completa de ECM.
4. Depois de alcançada a gelificação completa de ECM, pipete 400 µ l de pré-aquecido 1% LMA em cima do gel de ECM. Cubra o prato com a sua tampa, incube a placa na RT por 5 – 7 min e depois por 2 min a 4 ° C, para gelificação de agarose. Finalmente, suavemente adicione 2 mL de meio completo apoiando a ponta na borda do plástico macrobem fundo.
   Nota: A camada de agarose impede o desprendimento da matriz do colágeno-gel do HMCA.

7. invasão ensaio aquisição e análise

1. Carga a placa HMCA sobre uma motorizada invertido palco microscópio equipado com uma incubadora, pré-ajustada para 37 ° C, 5% de CO₂ e atmosfera umidificada.
2. Pré-determinar as posições para aquisição de imagem em cada bem a fim de cobrir a área de matriz inteira e usam 10. X ou 4 X de objectivos (esta etapa é necessária para o software de aquisição de imagem usado aqui, consulte a Tabela de materiais abaixo para detalhes). Como alternativa, usar qualquer software de aquisição de imagem para facilitar a varredura automática de toda a área necessária, escolhendo o "Stich" opção.
3. Adquirir imagens de campo brilhante (BF) cada 2-4 h por um período total de 24-72 h para seguir a invasão das células do corpo esferoide em ECM circundante.
4. Adquira imagens fluorescentes para a deteção de PI, usando um cubo fluorescente dedicado (excitação filtro 530 – 550 nm, espelho dicroico 565 nm longa passagem e emissão de filtro 600-660 nm).
5. Exportar imagens BF/fluorescente lapso de tempo a partir do software de aquisição de imagem e salvá-los no formato de arquivo tagged-image (TIFF) para uma pasta usando a guia de "Banco de dados" na barra de ferramentas e, em seguida, no botão "Exportar arquivos de registro" .
   Nota: Nós desenvolvemos um código especial análise interna no software MATLAB que inclui uma interface de usuário gráfica projetada (GUI), no qual invasão análise poderia ser executado mais rápido e mais fácil. Neste código de análise, a segmentação da área de invasão e esferoides é feita semi-automaticamente usando filtro Sobel, seguido pelos operadores morfológicos erosão e dilatação. Após a segmentação automática das áreas, manuais correções foram feitas quando necessário para melhor precisão. Após a conclusão de segmentação, um conjunto de parâmetros foram automaticamente calculada pelo software e exportados para um arquivo do excel para manipulação adicional. A lista de parâmetros são: área seccional esferoide básica no tempo = 0, área de invasão de células conectadas ao corpo de esferoide = invasão principal, área de células separado da área de invasão principal, número de células separado da área de invasão principal, distância média de invasão do centro de massa do esferoide básica para a circunferência da área de invasão principal e células separadas e parâmetro de distância de invasão coletiva = d (d = √ ((X₂ -_X1)² + (Y₂ Y₁)²) do Coordenadas X e Y esferoide centro de massa, antes (X₁, Y₁) e depois (X₂, Y₂) processo de invasão coletiva). Alternativamente, a análise de imagem poderia ser feito com qualquer outro software especializado.
6. Abra o GUI e aperte o botão "Load BF" . Depois que a imagem é aberta, ajustar os parâmetros de segmentação (tamanho mínimo: > 1 e raio perto: > 1) para alcançar uma segmentação precisa do esferoide e sua área de invasão, em seguida, pressione o botão "Região de segmentação de interesse (ROI)" para execução e uma borda aparecerá ao redor de cada esferoide. Se a segmentação automática estiver incorreta, pressione o botão "Excluir" ou "Adicionar" e faça as correções solicitadas manualmente. Repita os mesmos passos para as imagens subsequentes.
7. Pressione o botão "Rastreamento" para o número de esferoides e o software irá atribuir o mesmo número para cada spheroid em cada uma das imagens de lapso de tempo. Em seguida, pressione o botão "Medição" , que irá gerar uma planilha com todos os parâmetros. Salve esta planilha como um arquivo do excel para uso no processamento de resultados e estatísticas no software excel.

Resultados

O único HMCA placa de imagem é usado para o ensaio de invasão de esferoides tumor 3D. O ensaio inteiro, começando com a formação de esferoide e terminando com o processo de invasão e manipulações adicionais, é realizado dentro do mesmo prato. Para a formação de esferoide, as células HeLa são carregadas para a bacia de matriz e ambientar o hidrogel MCs pela gravidade. O hidrogel de MCs, que têm características de fixação não-aderente/low, facilitar a interação célula-...

Discussão

Está bem documentado que os organismos vivos, caracterizados por sua complexa organização multicelular 3D são bastante distintos das células comumente usados monocamada 2D cultivada, enfatizando a necessidade crucial de usar modelos de celulares que melhor imitam as funções e triagem de processos do organismo vivo para drogas. Recentemente, multicelulares esferoides, culturas de organotypic, organoids e órgãos-em-um-microplaqueta foram introduzidos⁸ para o uso na descoberta de medicamento...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37°C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37°C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics