Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten

Zusammenfassung

Eine HMCA-basierte Speicherfolie wird für Invasion Testleistung vorgestellt. Diese Platte erleichtert die Bildung von dreidimensionalen (3D) Tumor Sphäroide und die Messung der Krebs Zelle eindringen in die extrazelluläre Matrix (ECM). Die Invasion-Assay-Quantifizierung wird durch halbautomatische Analyse erreicht.

Zusammenfassung

Krebsmetastasen ist bekannt, 90 % der Letalität Krebs verursachen. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, der mit der Durchdringung/Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe initiiert. Somit ist Invasion ein entscheidender Schritt in Metastasen, machen die Invasion Prozessforschung und Entwicklung von Anti-metastatischen Drogen hochsignifikant. Um diese Nachfrage zu begegnen, besteht die Notwendigkeit, 3D in-vitro- Modelle zu entwickeln, die die Architektur von soliden Tumoren zu imitieren und ihrer Mikroumgebung am ehesten zu in Vivo Staat auf der einen Seite, aber zur gleichen Zeit werden reproduzierbar, robust und geeignet für hohe Ergiebigkeit und hohe Content Messungen. Derzeit, lehnen die meisten Invasion Assays auf anspruchsvolle mikrofluidischen Technologien, die ausreichend sind für die Forschung aber nicht für hochvolumige Drogen-Screening. Andere Tests mit Platte-basierten Geräten mit isolierten einzelnen Sphäroide in jede Vertiefung sind Material verbrauchen und geringen Stichprobengröße pro Zustand haben. Das aktuelle Protokoll soll eine einfache und reproduzierbare biomimetische zellbasierte 3D-System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide schaffen. Wir entwickelten ein 3D-Modell für Invasion Assay anhand HMCA Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Wirkstoffforschung. Dieses Gerät ermöglicht die Produktion von zahlreichen einheitliche Sphäroide pro Bohrloch (hohe Stichprobengröße pro Zustand) umgeben von ECM-Komponenten, während gleichzeitig und kontinuierlich beobachten und messen die Sphäroide bei einem Element Auflösung für mittlere Durchsatz-Screening von Anti-metastatischen Drogen. Diese Plattform wird hier durch die Produktion von HeLa und MCF7 Sphäroide zur Veranschaulichung einzelne Zelle und kollektive Invasion vorgestellt. Wir vergleichen den Einfluss der ECM-Komponente-Hyaluronsäure (HA) auf die invasive Kapazität von Kollagen um HeLa Sphäroide. Schließlich stellen wir Fisetin (Invasion Hemmer) HeLa Sphäroide und Stickstoffmonoxid (NO) (Invasion Aktivator), MCF7 Sphäroide. Die Ergebnisse werden von Inhouse-Software analysiert die halbautomatische, einfache und schnelle Analyse ermöglicht die Multi-Parameter-Prüfung erleichtert.

Einleitung

Krebstod ist vor allem auf die Verbreitung von metastasierenden Zellen an weit entfernten Orten zurückzuführen. Viele Bemühungen in der Krebsbehandlung auf targeting oder verhindern die Bildung von Metastasen Kolonien und das Fortschreiten der systemische Metastasen¹konzentrieren. Krebs Zelle Migration ist ein entscheidender Schritt in der Tumor-Metastasen-Prozess, also die Erforschung von Krebs Invasion Kaskade ist sehr wichtig und eine Voraussetzung zur Suche nach Anti-metastatischen Therapeutika.

Die Verwendung von Tiermodellen als Hilfsmittel für das Studium metastasierten Erkrankung wurde sehr teuer und nicht immer repräsentativ für den Tumor beim Menschen festgestellt. Darüber hinaus beeinflussen die extrazelluläre Mikroumgebung Topologie, die Mechanik und die Zusammensetzung stark Krebs Zelle Verhalten². Da in Vivo Modellen von Natur aus nicht in der Lage zu trennen und so spezifische Parameter, die zu Krebs Invasion und Metastasierung beitragen zu kontrollieren, gibt es eine Notwendigkeit für steuerbare biomimetische in-vitro- Modelle.

Um auf entfernte Organe metastasieren, müssen Krebszellen wandernden und invasive phänotypische Merkmale aufweisen, die für die Therapie ausgerichtet werden können. Da die meisten in-vitro- Krebs Modelle nicht die tatsächlichen Eigenschaften von soliden Tumoren³imitieren, ist es jedoch sehr schwierig, physiologisch relevante Phänotypen erkennen. Darüber hinaus bestimmt die phänotypische Heterogenität, die in den Tumor, besteht die Notwendigkeit für die Analyse von Tumor-Migration bei einem Element Auflösung um Phänotyp gerichtete Therapien, zum Beispiel zu entdecken, indem Sie auf die Metastasen initiieren Zelle Bevölkerung in heterogenen Tumoren⁴.

Die Studie der Zelle Motilität und kollektiven Migration ist in erster Linie in Monolayer-Kulturen der Epithelzellen auf homogene planaren Flächen. Diese konventionellen Zellmodellen für Krebs Zellwanderung basieren auf die Bevölkerung Analyse einzelner Zellen eindringen durch die Membranen und ECM Komponenten⁵, aber in einem solchen System können nicht die Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen werden studierte. Erzeugung von 3D Sphäroide oder über Gerüste Gerüst-freie Mikrostrukturen gilt als eine überlegene bedeutet, den Tumor zu studieren Zelle Wachstum und Krebs Invasion^6,7,8. Jedoch die meisten 3D-Systeme eignen sich nicht zur Hochdurchsatz-Formate und Inter Sphäroid Interaktion kann nicht in der Regel erreicht werden, da in jedes Mikro-gut⁹isoliert einzelne Sphäroide erzeugt werden. Jüngste Studien mit der Krebs-Migration basieren auf mikrofluidischen Geräten^3,10,11,12, jedoch diese anspruchsvolle mikrofluidischen Werkzeuge sind schwer zu produzieren und kann nicht Hochdurchsatz-screening (HTS) von Anti-invasive Drogen verwendet werden.

Zwei wichtigsten Phänotypen, kollektive und individuelle Zellwanderung, die eine Rolle in Tumorzellen die ECM-Barriere zu überwinden und benachbarte Gewebe eindringen wurden nachgewiesene^13,14, jede Anzeige unterschiedliche morphologische Eigenschaften, biochemischen, molekularen und genetischen Mechanismen. Darüber hinaus werden zwei Formen der Migration von Tumorzellen, Fibroblasten-Like und amöboiden, in jeder Phänotyp beobachtet. Da beide Invasion Phänotypen und Migration-Modi, zeichnen sich vor allem durch morphologische Eigenschaften, gibt es eine Notwendigkeit für zelluläre Modelle dieser aktivieren Imaging-basierte Erkennung und Untersuchung aller Formen von Tumorinvasion und Migration-Zellen.

Das übergeordnete Ziel der aktuellen Methode ist eine einfache und reproduzierbare biomimetische 3D in-vitro- Zelle-basiertes System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide zur Verfügung zu stellen. Hier stellen wir die HMCA-basierte 6-Well Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Therapie. Die Technologie ermöglicht die Bildung einer großen Zahl von einheitlichen 3D Tumor Sphäroide (450 pro Well) in einem Hydrogel Mikro-Kammern (MC) Struktur. Die Sphäroid Array ermöglichen das Eindringen der Zellen in der Umgebung sind verschiedene ECM-Komponenten hinzugefügt. Invasion-Prozess wird kontinuierlich überwacht, durch kurz- und langfristige Beobachtung der gleichen Sphäroide/Invasion der einzelnen Zellen und erleichtert Morphologische Charakterisierung, fluoreszierende Färbung und Abruf von spezifischen Sphäroide an jedem beliebigen Punkt. Da zahlreiche Sphäroide Raum und Medium teilen, ist die Interaktion über lösliche Moleküle zwischen einzelnen Sphäroide und deren Auswirkungen auf den anderen möglich. Semi-automatische Bildanalyse erfolgt über hauseigene MATLAB-Code schneller und effizienter Sammlung von großen Datenmengen ermöglicht. Die Plattform ermöglicht präzise, gleichzeitige Messung von zahlreichen Sphäroide/eindringenden Zellen Zeit effizient zu nutzen, so dass mittleren Durchsatz Screening von Anti-Invasion Drogen.

Protokoll

(1) HMCA Platte Prägung

Hinweis: Der komplette Prozess für die Konstruktion und Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempel und HMCA Speicherfolie verwendet in diesem Protokoll wird im Detail in unserem vorherigen Artikel^15,16beschrieben. PDMS-Stempel (Negativform) wird verwendet, um die HMCA (positive Form) prägen besteht aus rund 450 MCs pro Bohrloch (Abbildung 1A). Wie in Abbildung 1 bgezeigt, die MCs jeweils eine Form einer abgeschnittenen Kopf quadratische Pyramide (Höhe: 190 µm, kleine Grundfläche: 90 µm X 90 µm und große Grundfläche: 370 µm X 370 µm). Die HMCA-Platte ist für die Vorbereitung und Kultivierung von 3D Tumor Sphäroide und danach für Invasion Assay verwendet. Alternativ könnte ein kommerzielle Stempel für HMCA Produktion verwendet werden.

1. Bereiten Sie eine Lösung von 6 % niedrig schmelzende Agarose (LMA). Legen Sie die LMA Pulver und sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (0,6 g LMA pro 10 mL PBS) in einer Glasflasche mit einem Magnetrührer. Stellen Sie die Flasche auf eine Heizplatte und rühren Sie die Lösung beim Erwärmen auf 80 ° C für ein paar Stunden, bis eine einheitliche Lösung erreicht wird. Halten Sie die Lösung bei 70 ° C bis zur Verwendung.
2. Vorheizen des PDMS-Stempels auf 70 ° C in den Ofen. Halten Sie warm bis zur Verwendung. Alternativ verwenden Sie einen kommerziellen Stempel und folgen Sie den Anweisungen.
3. Legen Sie die kommerzielle Glasboden 6-Well-Platten auf ein trockenes Bad auf 75 ° c vorgewärmt Warten Sie einige Minuten, bis die Platte ganz warm ist.
4. Geben Sie einen Tropfen (400 µL) des vorgewärmten LMA auf den Glasboden eines jeden von den Brunnen in der Platte. Sanft lege den vorgewärmten PDMS-Stempel über die Agarose-Tropfen. Inkubation bei Raumtemperatur (RT) für 5 – 10 min für Pre-Gelier- und Vorkühlen. Inkubieren Sie bei 4 ° C für 20 min, volle Agarose Gelierung zu erreichen. Dann ziehen Sie vorsichtig die PDMS, verlassen das Agarosegel mit MCs gemustert ab.
   Hinweis: Dieser Schritt erfolgt gleichzeitig in den Brunnen.
5. Die geprägte Platte in eine lichthärtende System mit ultravioletten (UV) Lampe, und 3 min inkubieren.
   Hinweis: Jetzt ist die HMCA Platte UV-sterilisiert.
6. Füllen Sie die Makro-Brunnen mit sterilen PBS um sicherzustellen, dass sie feucht gehalten werden dann die Abdeckplatte, wickeln Sie es mit Parafilm und bis zur Verwendung bei 4 ° C lagern.
7. Vor dem Gebrauch leeren Sie PBS Residuen aus der HMCA-Platte. Legen Sie es in der biologischen Haube.

2. Laden Zellen und Sphäroid Bildung

1. Sammeln die Zellen wie folgt vor: Entfernen Sie alle Mittel aus einer 10 cm Kultur Platte Zelle Monolage, waschen zweimal mit 10 mL PBS Serum Residuen entsorgen, 5 mL Trypsin (vorgewärmt auf 37 ° C) hinzufügen und 3 min. im Inkubator bei 37 ° c inkubieren Dann schütteln Sie die Platte vorsichtig Monolage Loslösung zu gewährleisten, fügen Sie 10 mL des kompletten Medium (vorgewärmt auf 37 ° C) und Pipette rauf und runter, bis homogene Zellsuspension erreicht wird. Zentrifugieren Sie und waschen Sie die Zellsuspension mit 15 mL frisches Medium, dann in entsprechenden Konzentrationen in frischen kompletten Medium aussetzen.
2. Laden Sie sanft die Zellsuspension (50 µL, 150 – 360 x 10³ Zellen/mL in Medium ~ 16 – 40 Zellen pro MC) auf die HMCA und lassen die Zellen durch die Schwerkraft für 15 min zu begleichen.
3. Fügen Sie sanft 6 – 8 Aliquote von 500 µL frisches Medium (insgesamt 3 – 4 mL) bis zum Rand des Makro-Brunnen Kunststoffboden außerhalb der Ring und Hydrogel-Array.
4. Inkubieren Sie HeLa-Zellen für 72 h und Zellen MCF7 für 48 h bei 37 ° C und 5 % CO_2, in eine feuchte Atmosphäre für die Bildung der Sphäroide.

(3) Lebensfähigkeit Erkennung durch Propidium Jodid (PI) Färbung

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von PI (500 µg PI pro 1 mL PBS). Halten Sie es bei 4 ° C für ca. 6 Monate. Frisch zubereiten einer Verwässerung des 1:2,000 (0,25 µg/mL), durch die Zugabe von 6 µL von Material, das komplette Medium ohne Phenol rot, 12 mL für 6-Well-HMCA-Platte (2 mL pro Well).
2. Die HMCA Platte mit 48-72 h Sphäroide aus dem Inkubator, der biologische Haube zu übertragen. Entfernen Sie alle Mittel aus der HMCA durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoff unten neben das Hydrogel-Array, verlassen die Array-Tank mit Medium gefüllt.
3. Fügen Sie sanft 2 mL PI Verdünnung aus Schritt 3.1 in jede Vertiefung durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoffboden. Inkubieren Sie die HMCA-Platte für 1 h bei 37 ° C und 5 % CO₂, in eine feuchte Atmosphäre. Fahren Sie mit Schritt 7.
   Hinweis: Andere Farbstoffe genutzt werden hier auch, z. B. Hoechst zum Kern Beizen, Tetramethylrhodamine Methylester (TMRM) für Mitochondrien-Membran-Potential Färbung, Fluorescein Diacetat (FDA) für die lebenden Zellen Erkennung von Annexin V für die Apoptose Erkennung und andere.

(4) Kollagen Gemischbildung

1. Steriles doppeltes destilliertes Wasser (DDW) von Autoklaven und einen Bestand von 100 mL 1 M NaOH Filter sterilisiert Lösung vorbereiten. Pflegen Sie die Materialien bei RT und die Tipps zur Gemischaufbereitung Kollagen bis zur Verwendung bei-20 ° C eingefroren.
2. 10 – 20 Minuten vor dem Gebrauch legen Sie alle Mischtypen einschließlich: sterile DDW, 1 M NaOH sterile Lösung, steril 10 x PBS, Typ I Kollagen aus Rattenschwanz (bei 4 ° C für 3-Monate gelagert) und ein steriles Röhrchen in den Eiskübel bis völlig abgekühlt. Legen Sie den Eiskübel in der biologischen Kapuze.
3. 6-Well HMCA Invasion Assay Platte (300 µL pro Well) 1.800 µL Kollagen Mischung an eine Endkonzentration von 3 mg/mL, wie folgt vorbereiten. Hinzufügen der Mischtypen in den gekühlten Rohr in folgender Reihenfolge: 515 µL DDW, 24,8 µL 1 M NaOH und 180 µL 10 X PBS. Mischung gut durch Strudel und Platz zurück ins Eis. Zu guter Letzt fügen Sie 1080 µL des Kollagens in der Mischung, Wirbel wieder und wieder in Eis.

(5) HA und Kollagen Gemischbildung

1. 10 mg in 2 mL sterile DDW HA auflösen. Inkubieren Sie die Mischung bei RT für ein paar Minuten und Wirbel sanft, bis das Pulver vollständig aufgelöst ist. Speichern Sie die Stammlösung bei 4 ° C für bis zu zwei Jahren.
2. Legen Sie direkt vor dem Gebrauch HA-Stammlösung in den Eiskübel in der biologischen Kapuze.
3. Bereiten Sie eine 3 mg/mL Kollagen Mischung wie in Schritt 4 beschrieben. Fügen Sie 36 µg (7.2 µL) ha in 1.800 μL der Kollagen-Mischung für eine Endkonzentration von 20 µg/mL gebrauchsfertig. Dann, Wirbel wieder kurz und zurück ins Eis.

(6) ECM Mischung zusätzlich

1. Übertragen Sie die HMCA Platte mit 48 – 72 h Sphäroide aus dem Inkubator in die biologische Haube zu und legen Sie es auf dem Eis. 10 min inkubieren Sie, bis die Platte abgekühlt ist. Eine Lösung von 1 % vorheizen LMA auf 37 ° C in einem Wasserbad.
2. Entfernen Sie alle Mittel aus rund um die HMCA indem Sie lehnen das Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoff unten neben das Hydrogel-Array. Dann entfernen Sie sehr sorgfältig alle Mittel aus dem Array-Tank mit einem feinen Spitze/Gel laden Spitze, indem Sie das Spitze Ende am Rande Array, langsam und vorsichtig saugen alle Medium heraus lehnen.
   Hinweis: Nach dem entfernen alle Mittel aus um das Hydrogel-Array, Array-Tank noch mit Medium gefüllt. Dieses Medium hat sehr sanft entfernt werden, um Zerstörung von Hydrogel MC und Dislokation der Sphäroide zu vermeiden.
3. Die Pre-gefrorene feine Spitze 150 µL des Kollagen-Mischung oder HA-Kollagen-Gemisch (ECM-Gemisch) mitnehmen und in den Array-Tank durch das Anbringen der Spitze an den Rand des Array hinzufügen. Lassen Sie die Mischung langsam um Sphäroid Luxation zu vermeiden. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einem anderen aliquoten von 150 µL für eine insgesamt 300 µL pro Bohrloch. Folgen Sie den gleichen Vorgang für jedes gut, bis alle Vertiefungen gefüllt sind. Dann legen Sie die Platte in den Brutkasten für 1 h für den vollständigen Gelierung des ECM.
4. Nachdem die vollständigen Gelierung der ECM erzielt worden ist, pipette 400 µL vorgewärmten 1 % LMA auf dem ECM-Gel. Die Platte mit dem Deckel abdecken, die Platte bei RT für 5 – 7 min. und dann für 2 min bei 4 ° C für Agarose Gelierung inkubieren. Schließlich fügen Sie sanft 2 mL des kompletten Medium durch schiefe Spitze Ende am Rande des Makro-Brunnen Kunststoffboden.
   Hinweis: Die Agarose-Schicht verhindert das Ablösen der Kollagen-Gel-Matrix aus der HMCA.

7. Invasion Assay Erfassung und Analyse

1. Last die HMCA Platte auf einem motorisierten invertiert Mikroskoptisch mit Brutkasten, voreingestellt auf 37 ° C, 5 % CO₂ und feuchte Atmosphäre ausgestattet.
2. Bestimmen der Positionen für die Bildaufnahme in jedem gut um den ganzen Array-Bereich abdecken und 10 X oder 4 X Objektive verwenden (dieser Schritt ist erforderlich für die Bild-Datenerfassungs-Software hier verwendet, siehe Materialtabelle unten für Details). Alternativ können Sie alle Bild-Datenerfassungs-Software um automatische Scan des gesamten Gebietes erforderlich, durch die Wahl zu erleichtern die "Stich" Option.
3. Erwerben Sie, Hellfeld (BF) Bilder alle 2 – 4 Std. für einen Zeitraum von 24-72 h insgesamt um die Invasion von Zellen aus dem Körper Sphäroid in die umliegenden ECM folgen.
4. Fluoreszierende Bilder für PI-Erkennung mithilfe eines dedizierten fluoreszierenden Cubes (Erregung Filter 530-550 nm, dichroitischen Spiegel 565 nm langen Pass und Emission Filter 600-660 nm) zu erwerben.
5. Exportieren Sie Time-Lapse BF/fluoreszierend-Bilder aus der Bild-Datenerfassungs-Software und speichern Sie sie im tagged Image Format (TIFF) in einen speziellen Ordner mithilfe der Registerkarte "Datenbank" in der Symbolleiste und dann die Schaltfläche "Export Dateien eintragen" .
   Hinweis: Wir entwickelten eine spezielle Inhouse Analysecode in MATLAB Software, die eine gestaltete grafische Benutzeroberfläche (GUI) enthält die Invasion Analyse schneller und einfacher ausgeführt werden konnte. In diesem Analysecode erfolgt halbautomatisch mit Sobel Filter, gefolgt von den morphologischen Operatoren Erosion und Dilatation der Segmentierung der Sphäroide und Invasion. Nach automatische Segmentierung der Bereiche wurden manuelle Korrekturen vorgenommen, gegebenenfalls für eine höhere Genauigkeit. Nach der Fertigstellung der Segmentierung waren eine Reihe von Parametern automatisch von der Software berechnet und in eine Excel-Datei zur weiteren Bearbeitung exportiert. Die Liste der Parameter sind: grundlegende Sphäroid Querschnittsfläche zur Zeit = 0, Invasion Bereich von Zellen mit Sphäroid Körper verbunden = Haupt Invasion Bereich von Zellen, die vom Haupt-Invasion, getrennt vom wichtigsten Invasion, durchschnittliche Entfernung von Anzahl der Zellen getrennt Invasion von der grundlegenden Sphäroid Mitte der Masse an den Umfang der wichtigsten Invasion Bereich und getrennten Zellen und kollektive Invasion Parameter "Entfernung" = d (d = √ ((X₂ - X₁₎² + (Y₂ - Y₁)²) von der X und Y Sphäroid Massenmittelpunkt koordiniert vor (X₁, Y-₁) und nach (X₂, Y₂) kollektive Invasion Prozess). Alternativ könnte Bildanalyse mit anderen spezialisierten Software erfolgen.
6. Öffnen Sie die GUI und drücken Sie die Taste "Last BF" . Nachdem das Bild geöffnet ist, passen Sie die Segmentierung Parameter (Mindestgröße: > 1 und Radius schließen: > 1) um eine genaue Segmentierung der Sphäroid und seine Invasion Fläche zu erreichen, dann drücken Sie "Region of Interest (ROI) Segmentierung" für die Ausführung und eine Grenze wird um jedes Sphäroid angezeigt. Wenn die automatische Segmentierung nicht korrekt ist, drücken Sie die Taste "Löschen" oder "Hinzufügen" und führen Sie die gewünschten Korrekturen manuell. Wiederholen Sie die gleichen Schritte für die nachfolgenden Bilder.
7. Drücken Sie die "Tracking" -Taste, um die Sphäroide Nummer und die Software wird die gleiche Anzahl für jeden Sphäroid in jedem der Zeit verfallen Bilder zuweisen. Drücken Sie die "Messung" -Schaltfläche, die eine Tabelle mit allen Parametern generieren wird. Speichern Sie diese Tabelle als Excel-Datei zur weiteren Verwendung in Ergebnisse Verarbeitung und Statistiken in Excel Software.

Ergebnisse

Die einzigartige HMCA imaging-Platte wird für die Invasion-Assay von 3D Tumor Sphäroide verwendet. Der gesamte Test, mit der Sphäroid Bildung beginnend und endend mit der Invasion und zusätzliche Manipulationen erfolgt innerhalb der gleichen Platte. Für die Bildung der Sphäroid HeLa-Zellen werden in das Array Becken geladen und siedeln in der Hydrogel MCs durch die Schwerkraft. Das Hydrogel MCs, die Anhänger/niedrige Anlage Eigenschaften haben, erleichtern die Zell-Zell-Interaktion...

Diskussion

Es ist gut dokumentiert, dass lebende Organismen, zeichnet sich durch ihre komplexe 3D mehrzelligen Organisation ziemlich eindeutig aus den gängigen 2D Monolage kultivierten Zellen sind, entscheidende betonend, zelluläre Modelle verwenden die Funktionen besser imitieren und Prozesse des lebenden Organismus für Drug screening. Vor kurzem wurden mehrzelligen Sphäroide, organotypischen Kulturen, Organellen und Organe-on-a-Chip eingeführt⁸ für den Einsatz in standardisierten Wirkstoffforschung. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37°C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37°C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics