Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base

Résumé

Une plaque d’imagerie basée sur HMCA est présentée pour la performance de série invasion. Cette plaque facilite la formation des sphéroïdes en trois dimensions (3D) tumeur et la mesure de l’invasion des cellules du cancer dans la matrice extracellulaire (ECM). La quantification de dosage d’invasion est obtenue par analyse semi-automatique.

Résumé

Métastases du cancer est connu pour causer des 90 % de létalité du cancer. Métastase est un processus à plusieurs étapes qui initie avec la pénétration/invasion des cellules tumorales dans les tissus voisins. Ainsi, l’invasion est une étape cruciale à la métastase, rendant l’invasion processus recherche et le développement de médicaments anti-métastatiques, hautement significative. Pour répondre à cette demande, il est nécessaire de développer des modèles 3D dans vitro qui imitent l’architecture des tumeurs solides et leur microenvironnement plus étroitement à l’état in vivo d’une part, mais en même temps être reproductible, robuste et adapté aux haut rendement et hautes teneur Mensurations. Actuellement, la plupart analyses d’invasion se pencher sur technologies microfluidiques sophistiqués qui sont adéquates pour la recherche, mais pas pour le dépistage des drogues un volume élevé. Autres dosages utilisant des dispositifs à base de plaque avec des sphéroïdes individuels isolés dans chaque puits sont matériel consommant et ont la taille de l’échantillon faible par l’État. L’objectif du protocole actuel est de fournir un système de base de cellules 3D biomimétique simple et reproductible pour l’analyse de la capacité d’invasion dans les grandes populations des sphéroïdes de tumeur. Nous avons développé un modèle 3D pour invasion analyse basée sur la plaque d’imagerie HMCA de recherche sur l’invasion tumorale et la découverte de médicaments anti-métastatique. Ce dispositif permet la production de nombreux sphéroïdes uniformes par puits (taille de l’échantillon élevé par État) entouré de composantes d’ECM, tout en permanence et simultanément observer et mesurer les sphéroïdes à élément simple résolution pour les moyennes criblage de médicaments anti-métastatiques. Cette plateforme est présentée ici par la production des sphéroïdes HeLa et MCF7 pour illustrant la cellule individuelle et collective invasion. Nous comparons l’influence de l’ECM composant l’acide hyaluronique (HA) sur les capacités invasives de collagène qui entourent les sphéroïdes HeLa. Enfin, nous ne présentons fisétine (inhibiteur de l’invasion) HeLa sphéroïdes et l’oxyde nitrique () (activateur d’invasion) à MCF7 sphéroïdes. Les résultats sont analysés par un logiciel interne qui permet l’analyse semi-automatique, simple et rapide qui facilite l’examen des paramètre multiples.

Introduction

Décès par cancer est attribuée principalement à la diffusion des cellules métastatiques à des endroits éloignés. Beaucoup d’efforts dans le traitement du cancer se consacrée sur le ciblage ou de prévenir la formation de colonies métastatiques et la progression de la maladie métastatique systémique¹. Migration des cellules du cancer est une étape cruciale dans le processus de métastase tumorale, ainsi, la recherche de la cascade d’invasion du cancer est très important et une condition préalable à la recherche de thérapies anti-métastatique.

L’utilisation de modèles animaux comme outils pour l’étude de la maladie métastatique s’est avérée pour être très coûteux et pas toujours représentatifs de la tumeur chez les humains. En outre, la topologie du microenvironnement extracellulaire, la mécanique et la composition fortement affectent cancer cell comportement². Car en vivo modèles intrinsèquement n’ont pas la capacité de séparer et de contrôler ces paramètres spécifiques qui contribuent à l’invasion du cancer et des métastases, on a besoin pour biomimétique contrôlables en vitro modèles.

Pour métastaser dans des organes éloignés, cellules cancéreuses doivent présenter des caractéristiques phénotypiques migrateurs et envahissantes qui peuvent être ciblés pour la thérapie. Toutefois, étant donné que la plupart des modèles in vitro du cancer ne pas imiter les caractéristiques réelles des tumeurs solides³, c’est très difficile de détecter des phénotypes physiologiquement pertinents. En outre, l’hétérogénéité phénotypique qui existe au sein de la tumeur, dicte la nécessité pour l’analyse des migrations de la tumeur à élément simple résolution afin de découvrir les thérapies axées sur le phénotype, par exemple, en ciblant les cellules déclenchant les métastases population au sein de tumeurs hétérogènes⁴.

L’étude de la motilité cellulaire et migration collective est menée principalement dans des cultures monocouches de cellules épithéliales sur des surfaces planes homogènes. Ces modèles cellulaires classiques pour la migration des cellules du cancer sont basées sur l’analyse de populations de cellules individuelles envahir à travers les membranes et les ECM composants⁵, mais dans ces systèmes, les différences intrinsèques entre les cellules individuelles ne peuvent pas être a étudié. Générer des sphéroïdes 3D par échafaudages ou en microstructures exempte d’échafaudage est considéré comme un supérieur moyen étudier la tumeur de cellules croissance et cancer invasion^6,7,8. Cependant, la plupart des systèmes 3D ne sont pas adaptés aux formats à haut débit, et interaction entre sphéroïde habituellement ne peut être atteints depuis sphéroïdes individuels isolés sont générés à chaque micro puits⁹. Des études récentes portant sur la migration du cancer reposent sur des dispositifs microfluidiques^3,10,11,12, cependant, ces complexes microfluidique outils sont difficiles à produire et ne peut pas servir à haut débit (HTS) de dépistage des drogues anti-invasives.

Deux principaux phénotypes, migration des cellules individuelles et collectives, qui jouent un rôle dans les cellules tumorales, surmonter l’obstacle de l’ECM et envahissent les tissus voisins, ont été démontrées^13,14, chaque affichage distinct morphologiques caractéristiques, les mécanismes biochimiques, moléculaires et génétiques. En outre, les deux formes de migration des cellules tumorales, fibroblastes-like et amiboïdes, sont observées dans chaque phénotype. Depuis les deux phénotypes de l’invasion et les modes de migration, sont principalement définies par les propriétés morphologiques, il y a un besoin pour cellulaires modèles qu’activer la détection basée sur l’imagerie et l’examen de toutes les formes de l’invasion tumorale et la migration des cellules.

L’objectif global de la méthode actuelle doit fournir un système de biomimétique simple et reproductible 3D in vitro sur les cellules pour l’analyse de la capacité d’invasion dans les grandes populations des sphéroïdes de tumeur. Ici, nous introduisons la plaque d’imagerie basée sur HMCA 6 puits de recherche sur l’invasion tumorale et de la thérapie anti-métastatique. Cette technologie permet la formation d’un grand nombre des sphéroïdes de tumeur 3D uniforme (450 / puits) dans une structure de micro-chambres (MC) d’hydrogel. Divers composants de l’ECM sont ajoutés au tableau sphéroïde pour permettre l’invasion des cellules dans le milieu environnant. Processus d’invasion est surveillée de façon continue par l’observation des cellules individuelles sphéroïdes/envahir même court et long terme et facilite la caractérisation morphologique, coloration fluorescente et récupération des sphéroïdes spécifiques à tout moment. Puisque les sphéroïdes nombreux partagent l’espace et médium, interaction par l’intermédiaire de molécules solubles sphéroïdes individuels et leur impact sur l’autre est possible. Analyse d’images semi-automatique est effectué au moyen de code interne de MATLAB qui permet une collecte plus rapide et plus efficace de grandes quantités de données. La plateforme facilite la mesure précise et simultanée de nombreuses cellules sphéroïdes/envahir temps-efficacement, permettant le criblage de débit moyen des médicaments anti-invasion.

Protocole

1. HMCA plaque de gaufrage

Remarque : Le processus complet pour la conception et la fabrication du timbre de polydiméthylsiloxane (PDMS) et plaque d’imagerie HMCA utilisé dans le présent protocole est décrit en détail dans notre précédent article^15,16. Le timbre PDMS (forme négative) sert à gaufrer le HMCA (forme positive) qui se compose d’environ 450 MCs / puits (Figure 1 a). Comme le montre la Figure 1 b, chacune des MCs a une forme d’une pyramide tronquée de forme carrée à l’envers (hauteur : 190 µm, petite surface de base : 90 µm x 90 µm et grande surface de base : 370 µm x 370 µm). La plaque HMCA est utilisée pour la préparation et la mise en culture des sphéroïdes 3D tumeur et par la suite, pour l’analyse de l’invasion. Par ailleurs, un timbre commercial pourrait servir pour la production de HMCA.

1. Préparer une solution de 6 % d’agarose fusion faible (CGL). Insérez la poudre LMA salin stérile tamponnée au phosphate (PBS) (0,6 g de CGL pour 10 mL de PBS) dans une bouteille en verre avec un agitateur magnétique. Placer la bouteille sur une plaque chauffante et agiter la solution tout en chauffage à 80 ° C pendant quelques heures jusqu'à l’obtention d’une solution uniforme. Conserver la solution à 70 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. Pré-chauffer le timbre PDMS à 70 ° C dans le four. Garder au chaud jusqu'à l’utilisation. Vous pouvez également utiliser un timbre commercial et suivez les instructions.
3. Placez les plaques de fond en verre 6 puits commercial sur un bain sec préchauffé à 75 ° C. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que la plaque est totalement chaude.
4. Versez une goutte (400 µL) de LMA préchauffé sur le fond de verre de chacun des puits de la plaque. Placez délicatement le timbre PDMS préchauffé sur la goutte de gel d’agarose. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 – 10 min pour la gélification et refroidissement préalable. Incuber à 4 ° C pendant 20 min atteindre la pleine d’agarose gélification. Ensuite, décollez délicatement le PDMS, laissant le gel d’agarose à motifs avec MCs.
   Remarque : Cette étape se faite simultanément dans tous les puits.
5. Placer la plaque en relief dans un système équipé de lampe ultraviolette (UV) à lumière et incuber pendant 3 min.
   Remarque : La plaque HMCA est maintenant UV stérilisé.
6. Remplir les puits-macro avec du PBS stérile pour s’assurer qu’ils sont maintenus humides, puis la plaque de recouvrement, l’envelopper avec du parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
7. Avant utilisation, vider les résidus de PBS de la plaque HMCA. Placez-le dans la hotte biologique.

2. chargement de cellules et la Formation sphéroïde

1. Recueillir les cellules comme suit : supprimer tout moyen d’une monocouche de cellules de plaque de culture 10 cm, laver deux fois avec 10 mL de PBS, afin de disposer des résidus de sérum, ajouter 5 mL de trypsine (préalablement chauffée à 37 ° C) et incuber pendant 3 min dans l’incubateur à 37 ° C. Ensuite, secouez la plaque doucement pour s’assurer que le détachement de la monocouche, ajouter 10 mL de milieu complet (préalablement chauffé à 37 ° C) et la pipette de haut en bas jusqu'à ce que la suspension cellulaire homogène est obtenue. Centrifuger et laver la suspension cellulaire avec 15 mL de milieu frais, puis, suspendre à des concentrations appropriées dans un milieu frais complet.
2. Charger doucement la suspension cellulaire (50 µL, 150-360 x 10³ cellules/mL dans le milieu, ~ 16 – 40 cellules par MC) sur le dessus de la HMCA et laisser les cellules à régler par gravité pendant 15 min.
3. Doucement, ajoutez 6 à 8 portions de 500 µL de milieu frais (total 3 à 4 mL) jusqu’au bord du puits de macro en plastique fond en dehors du ring et hydrogel tableau.
4. Incuber les cellules HeLa pendant 72 h et cellules MCF7 pendant 48 h à 37 ° C et 5 % de CO_2, dans une atmosphère humidifiée pour la formation des sphéroïdes.

3. viabilité détection par l’iodure de Propidium (PI) coloration

1. Préparer une solution de PI (500 µg de PI par 1 mL de PBS). Conserver à 4 ° C pour environ 6 mois. Fraîchement, préparer une dilution de 1:2,000 (0,25 µg/mL), par l’addition de 6 µL de stock à 12 mL de milieu complet sans rouge de phénol, de la plaque HMCA de 6 puits (2 mL / puits).
2. Transférer la plaque HMCA avec sphéroïdes de 48 à 72 heures, de l’incubateur à la hotte biologique. Supprimer tous les moyen du HMCA en vous penchant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique à côté de la baie d’hydrogel, laissant le réservoir tableau rempli de milieu.
3. Doucement ajouter 2 mL de la dilution de la PI d’étape 3.1 dans chaque puits, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique. Incuber la plaque HMCA pendant 1 h à 37 ° C et 5 % CO₂, dans une atmosphère humidifiée. Passez à l’étape 7.
   Remarque : Autres colorants peuvent être utilisés ici même, par exemple, Hoechst pour noyau la souillure, tétraméthylrhodamine méthylester (TMRM) pour le potentiel de membrane mitochondrial coloration, fluorescéine diacétate (FDA) pour la détection des cellules vivantes, Annexin V pour l’apoptose détection et autres.

4. préparation de mélange collagène

1. Préparez l’eau bidistillée stérile (DDW) en autoclave et un stock de 100 mL d’une solution stérilisée par filtration de NaOH 1 M. Maintenir les matériaux RT, et les conseils pour la préparation de mélange collagène congelée à-20 ° C, jusqu'à l’utilisation.
2. 10 – 20 min avant utilisation, placer tous les intermédiaires dont : stérile DDW, solution stérile de 1 M de NaOH, stérile 10 x PBS, du collagène type I de queue de rat (conservés à 4 ° C pendant 3-mois) et un tube stérile dans le bac à glaçons jusqu'à ce que totalement refroidi. Placez le bac à glaçons à l’intérieur de la hotte biologique.
3. Préparer 1 800 µL du mélange de collagène à une concentration finale de 3 mg/mL, plaque 6 puits HMCA invasion assay (300 µL / puits) comme suit. Ajouter les intermédiaires dans le tube de refroidissement dans l’ordre suivant : 515 µL de DDW, 24,8 µL de 1 NaOH M et 180 µL de PBS 10 x. Mélangez bien en vortex et place dans la glace. Enfin, ajouter 1080 µL de collagène dans le mélange, vortex à nouveau et remettre dans la glace.

5. HA et préparation de mélange collagène

1. Dissoudre 10 mg de HA dans 2 mL de DDW stérile. Incuber le mélange à ta pendant quelques minutes et vortex doucement jusqu'à ce que la poudre se dissout totalement. Stocker la solution-mère à 4 ° C jusqu'à deux ans.
2. Juste avant utilisation, placer la solution HA dans le bac à glaçons à l’intérieur de la hotte biologique.
3. Préparer un 3 mg/mL de mélange collagène tel que décrit à l’étape 4. Ajouter 36 µg (7,2 µL) d’HA dans 1 800 μL de prêt à l’emploi de mélange de collagène, pour une concentration finale de 20 µg/mL. Puis, vortex à nouveau brièvement et mettre de nouveau dans la glace.

6. ECM mélange ajout

1. La plaque HMCA, à sphéroïde de 48 à 72 h, de transfert de l’incubateur dans la hotte biologique et placez-le sur la glace. Incuber pendant 10 min jusqu'à ce que la plaque est refroidie. Préchauffer une solution de 1 % CGL à 37 ° C dans un bain d’eau.
2. Supprimer tous les moyen d’autour de la HMCA, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique à côté de la baie d’hydrogel. Puis, très soigneusement, enlever toutes les moyennes du réservoir tableau avec un fin pointe/gel chargement astuce, en s’appuyant l’extrémité sur le bord du tableau, lentement et doucement sucer tous support sur.
   Remarque : Après avoir enlevé tous les moyen d’autour de la baie d’hydrogel, le réservoir tableau est toujours rempli de moyen. Ce support doit être retirée très doucement afin d’éviter la destruction de l’hydrogel MC et dislocation des sphéroïdes.
3. Prenez 150 µL du mélange collagène ou HA et le collagène (mélange de ECM) avec la pointe fine surgelée et ajouter dans le réservoir de tableau en joignant la pointe vers le bord du tableau. Communiqué le mélange lentement pour éviter la dislocation de l’ellipsoïde. Répétez cette étape avec une autre partie aliquote de 150 µL, pour un total de 300 µL / puits. Suivez la même procédure pour chaque puits jusqu'à ce que tous les puits sont remplis. Puis placer la plaque dans l’étuve pendant 1 h pour la gélification complet de l’ECM.
4. Après la gélification pleine d’ECM est parvenue, distribuer 400 µL de préchauffé 1 % LMA surface du gel de l’ECM. Couvrir la plaque avec son couvercle, incuber la plaque à RT pour 5 à 7 min, puis pendant 2 min à 4 ° C, pour la gélification de l’agarose. Enfin, doucement ajouter 2 mL de milieu complet en vous penchant l’extrémité sur le bord du fond du puits de macro en plastique.
   Remarque : La couche de gel d’agarose empêche le détachement de la matrice de collagène-gel de la HMCA.

7. analyse et Acquisition de dosage invasion

1. Charge la plaque de HMCA sur un moteur inversé des microscopes équipés d’un incubateur, réglé à 37 ° C, 5 % de CO₂ et atmosphère humidifiée.
2. Déterminez avant les positions pour l’acquisition d’images dans chaque bien afin de couvrir la zone de l’intégralité du tableau et utilisent 10 X ou 4 X objectifs (cette étape est requise pour le logiciel d’acquisition image utilisé ici, consultez la Table des matières ci-dessous pour plus de détails). Également utiliser n’importe quel logiciel d’acquisition image pour faciliter le balayage automatique de toute la zone requise, en choisissant la « Stich » option.
3. Acquérir des images de champ lumineux (BF) toutes les 2 à 4 h pour une durée totale de 24 à 72 h pour suivre l’invasion des cellules de l’organisme de sphéroïde dans l’ECM environnante.
4. Acquisition d’images fluorescentes pour la détection de PI en utilisant un cube fluorescent dédié (excitation filtre 530 – 550 nm, miroir dichroïque 565 nm long col et émission filtre 600-660 nm).
5. Exporter des images BF/fluorescent Time-lapse de logiciel d’acquisition de l’image et enregistrer au format de fichier étiqueté d’image (TIFF) dans un dossier dédié à l’aide de l’onglet « Base » dans la barre d’outils, puis sur le bouton « Exporter les fichiers d’enregistrement » .
   NOTE : Nous avons développé un code spécial analyse interne dans le logiciel MATLAB qui inclut une interface utilisateur graphique conçue (GUI) dans lequel invasion analyse pourrait être exécuté plus rapidement et plus facilement. Dans cette analyse de code, la segmentation des sphéroïdes et zone d’invasion se faite semi-automatique à l’aide de filtre de Sobel suivie par les opérateurs morphologiques, l’érosion et dilatation. Après la segmentation automatique des zones, corrections manuelles ont été faites au besoin pour une meilleure précision. Après l’achèvement de la segmentation, un ensemble de paramètres ont été automatiquement calculé par le logiciel et exporté vers un fichier excel pour autre manipulation. La liste des paramètres sont : aire de la section base de sphéroïde au moment = 0, zone d’invasion des cellules reliée au corps du sphéroïde = invasion principale, quartier des cellules séparées de la zone principale d’invasion, nombre de cellules séparée de la zone principale d’invasion, la distance moyenne de invasion de la base sphéroïde Centre de masse à la circonférence de la zone principale d’invasion, les cellules séparées et les paramètre de distance collective invasion = d (d = √ ((X₂ - X₁)² + (Y₂ - Y₁)²) de la Des coordonnées X et Y sphéroïde Centre de masse, avant (X₁, Y₁) et après (X₂, Y₂) processus d’invasion collective). Alternativement, analyse d’image pourrait être fait avec n’importe quel autre logiciel spécialisé.
6. Ouvrez l’interface utilisateur et appuyez sur le bouton « Load BF » . Une fois l’image ouverte, ajustez les paramètres de segmentation (taille minimale : > 1 et rayon à proximité : > 1) pour réaliser une segmentation précise de sphéroïde et sa zone d’invasion, puis, appuyez sur « Région de segmentation d’intérêt (ROI) » pour l’exécution et une bordure apparaît autour de chaque sphéroïde. Si la segmentation automatique est incorrecte, appuyez sur le bouton « Supprimer » ou « Ajouter » et apporter les correctifs requis manuellement. Répétez les mêmes étapes pour les images suivantes.
7. Appuyez sur le bouton « Tracking » de numéroter les sphéroïdes et le logiciel va attribuer le même numéro pour chaque ellipsoïde dans chacune des images de laps de temps. Puis, appuyez sur le bouton « Mesure » qui va générer une feuille de calcul avec tous les paramètres. Sauvegarder cette feuille de calcul dans un fichier excel pour une utilisation dans le traitement des résultats et statistiques dans excel logiciel.

Résultats

L’unique HMCA plaque d’imagerie est utilisée pour le dosage de l’invasion des sphéroïdes tumeur 3D. L’analyse entière, commençant par la formation sphéroïde et finissant avec le processus d’invasion et les manipulations supplémentaires, est réalisée au sein de la même plaque. Pour la formation sphéroïde, cellules HeLa sont chargés dans le bassin de la baie et s’installer dans l’hydrogel MCs par gravité. L’hydrogel MCs, qui présentent des caractéristiques n...

Discussion

Il est bien documenté que les organismes vivants, caractérisés par leur organisme multicellulaire 3D complexe sont tout à fait distinctes des cellules utilisées monocouche 2D cultivée, en insistant sur la nécessité cruciale d’utiliser des modèles cellulaires qui mieux imitent les fonctions et les processus de l’organisme vivant pour médicament dépistage. Récemment, les sphéroïdes multicellulaires, culture organotypique, organoïdes et organes-on-a-chip ont été introduites⁸ pour...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37°C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37°C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics