がん細胞の浸潤と転移防止薬剤のスクリーニングのハイドロゲル マイクロチャンバー アレイを用いた (HMCA) の解析-ベース プレート

要約

HMCA ベースのイメージング プレートは、浸潤アッセイ パフォーマンスが提示されます。このプレートは、三次元 (3 D) 腫瘍スフェロイドの形成と細胞外マトリックス (ECM) に癌細胞の測定を促進します。浸潤アッセイの定量化は、半自動解析によって実現されます。

要約

がんの転移がん致死率の 90% を引き起こす知られています。転移は、周辺の組織に腫瘍細胞の浸透・浸潤を開始する多段プロセスです。したがって、侵略は侵略プロセス研究と抗転移治療薬の開発の非常に重要なを作る転移の重要なステップです。この需要に対処するため固形腫瘍のアーキテクチャを模倣する 3 Dの in vitroモデルを開発する必要性があるし、1 つの手が同時に生体内の状態に最も密接に彼らの微小環境が再現性の高い、堅牢な適した高収量と高糖度を計測。現在、ほとんどの浸潤アッセイは頼る十分ですが洗練されたマイクロ流体技術研究ではなく、大量の薬剤のスクリーニング。他のアッセイ プレート ベースのデバイスを用いた各ウェルに分離個々 スフェロイド材料消費と条件ごとの低いサンプル サイズを持っています。現在のプロトコルの目的は、腫瘍回転楕円体の大規模な集団で侵攻能力の分析のためシンプルで再現性のある生物模倣型 3 D セル ベースのシステムを提供することです。HMCA イメージング プレート腫瘍浸潤性および抗転移性薬剤の発見の研究に基づく侵略の試金のための 3 D モデルを作成しました。このデバイスにより、連続と同時に観察し、媒体の単一要素の解像度で回転楕円体を測定しながら ECM コンポーネントに囲まれた多数の制服スフェロイド (条件あたりの高いサンプル サイズ) ウェルあたりの生産抗転移薬のスクリーニング。このプラットフォームは、単一セルおよび集団の侵入を実証の hela 細胞と MCF7 回転楕円体の生産によってここで紹介です。Hela 細胞スフェロイドを取り巻くコラーゲンの侵襲的な能力で ECM 成分ヒアルロン酸 (HA) の影響を比較します。最後に、紹介 Fisetin (侵入阻害剤) hela 細胞スフェロイドと一酸化窒素 (NO) (侵略アクティベーター) MCF7 回転楕円体に。結果は、マルチパラ メーター検査を容易にする半自動、シンプルで高速な解析を可能にする社内のソフトウェアによって分析されます。

概要

癌死は遠い場所に転移細胞の普及に主に起因します。がんの治療で多くの努力をターゲットまたは転移性コロニーの形成と全身の転移性疾患¹の進行予防に焦点を当てます。がん細胞の遊走は腫瘍転移プロセスの重要なステップ、したがって、がん浸潤翼列の研究は非常に重要な抗転移治療を見つけることへの前提条件。

転移性疾患を研究するためのツールとして動物モデルの使用は、非常に高価で、常に人間の腫瘍の代表ではないに発見されています。さらに、細胞外微小環境のトポロジー、力学や構成強く癌細胞の動作²を影響します。体内モデルは本質的に分離し、癌の浸潤・転移に貢献するような特定のパラメーターを制御する能力を欠いている、制御可能な模倣の in vitroモデルの必要性があります。

遠隔臓器に転移するためにがん細胞は治療の対象にすることができます渡り鳥や侵襲性の分化形質を表わさなければなりません。しかし、ほとんどのがんの in vitroモデルが固体腫瘍³の実際の機能を模倣しないので、生理学的に関連する表現型を検出する非常にやりがいのあります。さらに、表現型の多様性は、腫瘍内に存在する指示転移開始細胞によって表現型指示療法、例えばを発見するために要素が 1 つの解像度での腫瘍移行の分析の必要性異種腫瘍⁴内人口。

細胞の運動性と集団移動の調査は均一な平面の表面で上皮細胞の単層培養に主にです。がん細胞遊走のこれらの従来の携帯電話モデルは、個々 の細胞膜と ECM コンポーネント⁵、侵入の人口分析に基づいているが、このようなシステムで個々 の細胞の本質的な違いをすることはできません。勉強しました。優れた腫瘍を研究する手段として足場を経由またはスキャフォールド フリー マイクロ構造のいずれかと見なされます生成 3 D 回転楕円体セル成長および癌浸潤^6,7,8。しかし、ほとんどの 3 D システム、高スループットの形式には適していません、分離個々 の回転楕円体、各マイクロも⁹で生成されますので通常回転楕円体間相互作用を達成することはできません。癌の移行を含む最近の研究は、マイクロ流体デバイス^3,10、11,12に基づきます、しかし、これらはマイクロ ツールを生成しにくい、できない洗練されました。ハイスループットス クリーニング (HTS) 反侵襲的な薬の使用。

2 つの主な表現、集団と個々 の細胞遊走と ECM バリアを克服する腫瘍細胞の役割を担い、周辺の組織に侵入されている実証^13,14、それぞれ明確な表示を形態学的、生化学的な分子および遺伝のメカニズム、特徴。さらに、移行する腫瘍細胞、線維芽細胞のようなアメーバの 2 つの形式は、それぞれの表現型の観察されます。両方以来侵略の表現型と移行モードは主に形態学的性質によって定義されます、携帯の必要性モデル イメージング ベースの検出を有効にして、細胞の浸潤と移行のすべての形態の検討があります。

現在のメソッドの全体的な目標は、腫瘍回転楕円体の大規模な集団で侵攻能力の分析のセルベースのシステム 3 D体外シンプルで再現性のある生体模倣を提供することです。腫瘍浸潤性および抗転移療法の研究 HMCA ベース 6 ウェル イメージング プレートを紹介します。ハイドロゲル マイクロ室 (MC) 構造における制服 3 D 腫瘍スフェロイド (ウェルあたり 450) の多数の形成を実現します。ECM のさまざまなコンポーネントは、周囲の環境への細胞の侵入を有効にするスフェロイド アレイに追加されます。浸潤過程同じ個々 に回転楕円体/侵入細胞の短期および長期観察によって常時監視し、形態的特性、蛍光染色、任意の時点で特定の回転楕円体の検索が容易になります。多数の回転楕円体は、空間とメディアを共有するので水溶性の分子を介して個々 の回転楕円体と互いへの影響の相互作用が可能です。半自動画像解析は、大量のデータの高速かつ効率的コレクションを可能にする社内の MATLAB のコードを使用して行われます。プラットフォーム反侵略薬の中のスクリーニングを許可する、時間効率の良い方法で多数の回転楕円体/浸潤細胞の正確な同時測定が容易になります。

プロトコル

1. HMCA プレート エンボス

注: デザインとポリジメチルシロキサン (PDMS) スタンプとこのプロトコルで使われる HMCA イメージング プレートの製造のための完全なプロセスは、私たちの以前の記事^15,16でくわしく説明します。PDMS スタンプ (否定形) を使用して、よく (図 1 a) あたり約 450 MCs から成っている HMCA (肯定的な形状) をエンボスします。各 MCs に切り捨てられた逆さまに正方形ピラミッドの形は図 1 bに示されるように (高さ: 190 μ m、小さな基本領域: 90 μ x 90 μ m と大規模な基本エリア: 370 μ x 370 μ m)。HMCA プレートは、準備をし、腫瘍を 3 D 回転楕円体の培養とその後、浸潤能の測定のために使用されます。また、商業スタンプ HMCA 生産される可能性があります。

1. 6% 低融点アガロース (LMA) のソリューションを準備します。磁性攪拌器でガラス瓶に LMA 粉と滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (10 ml の PBS の LMA の 0.6 g) を挿入します。加熱板にボトルを配置し、均一解決が達成されるまで、数時間の 80 ° C に加熱しながらソリューションをかき混ぜます。70 ° C でのソリューションを使用するまで保持します。
2. 予熱オーブンで 70 ° C に PDMS スタンプ。それは使用するまで暖かいを保ちます。また、商業のスタンプを使用し、指示に従ってください。
3. 75 ° C に予熱乾燥浴上商業 6 よくガラス底プレートを配置します。プレートが完全に暖かくなるまで、数分を待ってください。
4. プレートの井戸の各 1 つのガラスの下に事前に加熱された LMA のドロップ (400 μ L) を注ぐ。予熱した PDMS スタンプをアガロース ドロップにそっとかぶせます。(RT) 常温ゲル化前の予冷 5-10 分間インキュベートします。4 ° c における agarose のゲル化を達成するために 20 分間インキュベートします。その後、MCs と模様の agarose のゲルを残して、PDMS をそっとはがします。
   注: この手順は、すべての井戸で同時に行われます。
5. 光重合型紫外線 (UV) ランプを搭載したシステムでエンボス プレートを置き、3 分間インキュベートします。
   注: 今 HMCA プレート、UV 殺菌します。
6. 確認彼ら湿気の保持し、プレート カバー、パラフィルムで包んで使用するまで 4 ° C で保存する滅菌 PBS でマクロ井戸を埋めます。
7. 使用前に空の HMCA プレートから PBS 残差を実行します。生物のフードにそれを配置します。

2. 読み込み細胞スフェロイドの形成

1. 次のようにセルを収集: 10 mL の血清の残余の処分、トリプシン (37 ° C に加温) 5 mL を追加し、37 ° C の定温器で 3 分間インキュベートする PBS で 2 回洗い、単層細胞 10 cm 文化の板からすべての媒体を削除その後、単分子膜剥離を確実に均質な細胞懸濁液が得られるまで (37 ° C に加温) 完全培地の上下ピペット 10 mL を追加そっとプレート横に振る。遠心分離機し 15 ml の新鮮な媒体の細胞懸濁液を洗浄し、新鮮な完全培地で適切な濃度で中断します。
2. 細胞懸濁液をそっとロード (50 μ L、150-360 10³セル/mL 中、x ~ 16-40 MC あたりセル)、HMCA の上にでき、15 分のために重力によって解決する細胞。
3. 優しくリングとハイドロゲル配列の外部マクロもプラスチック製の底の縁に 6-8 500 μ L 新鮮な媒体 (総 3-4 mL) の因数を追加します。
4. 72 h の HeLa 細胞と MCF7 細胞スフェロイドの形成のための加湿雰囲気で CO₂を 37 ° C、5% で 48 時間孵化させなさい。

3 生存率 Propidium ヨウ化 (PI) 染色による検出

1. 円周率の貯蔵液の準備 (PBS の 1 mL あたりに PI の 500 μ g)。4 ° C で約 6 ヶ月間それを維持します。たて 6 ウェル HMCA 板 (ウェルあたり 2 mL) を 12 mL の完全培地、フェノールレッドなしの株式の 6 μ L 添加による 1:2,000 (0.25 μ g/mL) の希釈を準備します。
2. 生物のフードにインキュベーターから 48-72 h スフェロイド HMCA プレートを転送します。ハイドロゲル配列の横にマクロもプラスチック製の底の端に先端を薄くことで、HMCA からすべてのメディアを削除、中でいっぱい配列タンクを残してします。
3. 各ウェルにステップ 3.1 からマクロもプラスチック製の底の端に先端を薄くことで PI 希釈の 2 mL を追加する優しくします。37 ° C、5% CO₂、加湿雰囲気の中で、1 時間 HMCA プレートを孵化させなさい。手順 7 に進みます。
   注: 他の染料はされる可能性がありますここで同様に、たとえば、核の染色、ヘキスト染色、フルオレセイン ・ ジアセテート (FDA) の生きているセル検出、apoptosis のためアネキシン V ミトコンドリア膜電位の tetramethylrhodamine メチル エステル (TMRM)検出とその他。

4. コラーゲン混合物の準備

1. 1 M NaOH フィルター滅菌溶液 100 mL を保有しオートクレーブ滅菌二重蒸留水 (DDW) を準備します。RT、および使用するまで-20 ° C で凍ってコラーゲン混合物の準備の使用ヒントで材料を維持します。
2. 使用前に 10-20 分配置を含むすべての intergrades: 滅菌 DDW、1 M NaOH 滅菌溶液、滅菌 10 x PBS、I 型コラーゲンのラット尾 (3-カ月の 4 ° C で保存)、生殖不能の管から完全に冷却されるまでの氷のバケツに。生物のフードの中の氷のバケツを配置します。
3. 6 ウェル HMCA 浸潤アッセイ プレート (300 μ L/ウェル) を次のように最終濃度 3 mg/mL でコラーゲン混合物の 1,800 μ L を準備します。次の順序で冷却管に intergrades を追加: DDW、1 M NaOH の 24.8 μ L、180 μ L の 10 倍 PBS の 515 μ L。氷に渦と場所で混ぜる。最後に、再び渦混合物にコラーゲンの 1080 μ L を追加し、氷に戻します。

5. HA とコラーゲン混合物の準備

1. ハ滅菌 DDW の 2 mL に 10 mg を溶解します。粉が完全に溶解するまで、いくつかの分および渦の優しく常温混合物をインキュベートします。2 年間の 4 ° C で原液を格納します。
2. 右使用前に生物学的フード内氷バケットに HA 原液を場所します。
3. コラーゲン混合物のステップ 4 で説明したように 3 mg/mL を準備します。最終濃度 20 μ G/ml にコラーゲン混合物を使用する準備ができての 1,800 μ L に HA の 36 μ g (7.2 μ L) を追加します。それから、渦を再度簡潔に、氷に戻る。

6. ECM 混合物添加

1. 生物のフードにインキュベーターから HMCA プレートは、48-72 時間回転楕円体を転送し、氷の上に置きます。プレートは冷却されるまで 10 分間インキュベートします。1% の溶液を予熱 37 の ° C の水浴中に LMA。
2. ハイドロゲル配列の横にマクロもプラスチック製の底の端に先端を薄くことで HMCA、周りからすべてのメディアを削除します。その後、配列の端には、優しく、ゆっくりと吸うすべてのメディアを取り出し、先端を薄くことで、ヒントを読み込んで細かいヒント/ゲルに配列タンクからすべての媒体を取除く非常に慎重に。
   注: ハイドロゲル配列の周りからすべてのメディアを削除すると、中ではまだ配列タンクはいっぱい。この媒体は非常に優しくハイドロゲル MC の破壊と回転楕円体の転位を避けるために削除します。
3. あらかじめ冷凍ファインチップとコラーゲン混合物または HA とコラーゲン混合物 (ECM 混合物) の 150 μ L を取るし、先端を配列エッジにアタッチすることにより配列のタンクに追加します。ゆっくりと回転楕円体の転位を避けるために混合物をリリースします。合計 300 μ L/ウェルの 150 μ L のもう一つの因数でこの手順を繰り返します。すべての井戸が埋まるまで各ウェルの同じ手順に従います。ECM におけるゲル化の 1 h の定温器にプレートを入れ。
4. ECM におけるゲル化が達成された後に予め温めておいた 1% の 400 μ L をピペット LMA ECM のゲルの上。その蓋プレート カバー、5-7 分間放置、agarose のゲル化のための 4 ° C で 2 分 RT でプレートを孵化させなさい。最後に、マクロもプラスチック製の底の端に先端を薄くことで優しく完全培地 2 mL を追加します。
   注: agarose 層は、HMCA からコラーゲン ゲルのマトリックスの剥離を防ぎます。

7. 浸潤アッセイ集録および解析

1. 負荷に電動 HMCA プレートは、37 ° c、5% CO₂加湿雰囲気調整済み、インキュベーターを備えた顕微鏡ステージを反転します。
2. 事前の各画像取り込み位置配列全体の領域をカバーするためによくし、10 X または 4 X 目標を使用を決定する (この手順はここで使用される画像集録ソフトウェアに必要な詳細については以下の表を参照)。または、任意の画像集録ソフトウェアを使用して選択することで必要な領域全体の自動スキャンを容易にする、 「スティッチ」オプション。
3. 画像を取得明るいフィールド (BF) ごとの 2-4 h 24-72 h の全期間のため周囲の ECM に回転楕円体ボディから細胞の浸潤に従うために。
4. (励起フィルター 530-550 nm、ダイクロイック ミラー 565 nm 長いパスおよび排出フィルター 600-660 nm) 専用の蛍光キューブを使用して円周率の検出のための蛍光画像を取得します。
5. 画像集録ソフトウェアからタイムラプス BF/蛍光画像をエクスポートし、ツールバーをクリックし、 「エクスポート レコード ファイル」ボタンで「データベース」タブを使用して専用フォルダーにタグ付きイメージ ファイルの形式 (TIFF) で保存します。
   注意: MATLAB ソフトウェアどの侵略で迅速かつ容易に分析は実行できるデザイン グラフィック ユーザー インターフェイス (GUI) を含む特別な社内解析コードを開発しました。この分析コードで回転楕円体と浸潤領域のセグメンテーションは、侵食と拡張形態演算子に続いて Sobel フィルターを使用して半自動的に行われます。領域の自動セグメンテーション後精度を高めるため必要に応じて手動での修正が行われました。分割完了後パラメーターのセットが自動的にソフトウェアによって計算され、さらに操作の excel ファイルにエクスポートします。パラメーターのリストです: 時に基本的な回転楕円体断面積 = 0、回転楕円体の体に接続したセルの侵入エリア = 主な侵入エリア主な浸潤領域から分離細胞の主な浸潤領域の平均距離から区切られたセルの数主な浸潤領域と分離細胞集団の侵入距離] パラメーターのまわりに基本的な回転楕円体の重心からの侵略 = d (d = √ ((X₂ - X₁)² + (Y₂ - Y₁)²) のうち、X と Y 回転楕円体の重心座標を前に (X₁, Y₁) と後 (X₂Y₂) 集団侵略プロセス)。また、他の専門的なソフトウェアと画像解析を行うことができます。
6. GUI を開くし、 "負荷 BF"ボタンを押します。画像を開いた後、分割パラメーターの調整 (最小サイズ: > 1 と半径を閉じます: > 1) 回転楕円体とその侵入地域の正確な分割を達成するために、実行のため「利益 (率 ROI) のセグメンテーションの地域」ボタンを押すと境界線は、各回転楕円体の周り表示されます。自動セグメンテーションが正しくない場合「削除」または「追加」ボタンを押すし、手動で要求された訂正を行います。後続の画像は、同じ手順を繰り返します。
7. スフェロイドに番号を「追跡」ボタンを押すソフトウェアが各時間経過イメージで各回転楕円体の同じ番号を割り当てます。すべてのパラメーターをスプレッドシートを生成する「計測」ボタンを押してください。処理結果にさらに使用および統計ソフトウェアを excel で excel ファイルとしてこのスプレッドシートを保存します。

結果

ユニークな HMCA イメージング プレートは、回転楕円体 3 D 腫瘍の浸潤能の測定に使用されます。全体アッセイ、スフェロイドの形成に始まり、浸潤過程と追加の操作までは同じプレート内で実行されます。回転楕円体の形成のため、HeLa 細胞は配列盆地に読み込まれ、重力によってハイドロゲル MCs で解決。ハイドロゲル非付着性/低添付ファイルの特性を持つ、MCs 3 D ...

ディスカッション

それも記載の生きている有機体、複雑な 3 D 多細胞組織によって特徴付けられるより良い機能を模倣細胞モデルを使用する重大な必要性を強調、一般的に使用される 2次元単層培養細胞とは全く異なる・薬物の生きている有機体のプロセスの検診します。最近では、チップ上の臓器、organoids 切片培養スフェロイドは標準化された薬剤の発見の使用のために導入された⁸をされ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37°C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37°C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics